水稻粒長基因gs3的功能標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種水稻粒長基因GS3的功能標(biāo)記及其應(yīng)用，通過設(shè)計合成了三條引物：gs3In、gs3F和gs3R，三條引物同時在PCR體系中對不同水稻DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，然后對擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳檢測是否含有g(shù)s3等位基因。此過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物不需要進(jìn)行酶切，直接通過電泳就能檢測出是否含有g(shù)s等位基因，簡化了步驟，不僅能快速、準(zhǔn)確的鑒定水稻種質(zhì)資源或育種群體是否含有g(shù)s等位基因，而且在育種應(yīng)用中加速了選育進(jìn)程，提高了效率。
【專利說明】水稻粒長基因GS3的功能標(biāo)巧及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，設(shè)及一種水稻粒長基因GS3的功能標(biāo)記及其應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是重要的糧食作物，為全球一半的人口提供口糧。隨著世界人口的增長，水稻 作為主要糧食作物面臨著提高產(chǎn)量的迫切需要。預(yù)計到2030年，水稻產(chǎn)量需要提高40% W 上才能滿足人類的需要。
[0003] 水稻單株產(chǎn)量是由有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和粒重=個因素共同決定的，對于水稻的 整體產(chǎn)量而言，該=個因素表面上是獨立的但又相互關(guān)聯(lián)，很多情況下會出現(xiàn)此消彼長的 矛盾。在有效穗數(shù)和每穗粒數(shù)達(dá)到一個相對理想的較高水平時，提高巧粒的重量將是提高 水稻產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一。研究表明，水稻粒重是由水稻粒長和粒寬決定的，最先鑒定的控 制水稻粒長的主效QTL(quantitative trait locus,數(shù)量性狀基因座）位點GS3是控制水 稻粒重和粒長的主效Q化，同時也是控制水稻粒寬和巧粒充實度的微效QTL。GS3CDNA全長 95化P，包含5個外顯子，編碼為一個由232個氨基酸組成的跨膜蛋白。經(jīng)過序列分析表明， 與小粒品種相比，大粒品種GS3第2外顯子中編碼第55位半脫氨酸的密碼子TGC突變成終 止密碼子TGA，造成蛋白翻譯提前終止（缺失了 178個氨基酸）。
[0004] 現(xiàn)有研究中，GS3開發(fā)有功能標(biāo)記Sf28,由正反兩條引物構(gòu)成，PCR擴(kuò)增后需要限 制性內(nèi)切酶切消化過夜，再進(jìn)行電泳檢測，成本高，耗時長，不適應(yīng)高通量的分子標(biāo)記輔助 選擇。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對W上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種水稻粒長基因GS3的功能標(biāo)記及其應(yīng)用。
[0006] 水稻粒長基因GS3的功能標(biāo)記，所述水稻粒長基因GS3的粒長等位基因的顯性分 子標(biāo)記M-GS3由S條引物構(gòu)成：
[0007] gs3F 引物；ATTGGCTTGATTTCCTGTGC ;
[0008] gsSIn 引物；GCAGGCTGGCTTACTTTCTT ;
[0009] gs3R 引物；TTGCTCTTACGGGAGGACAC ;
[0010] 其中，所述gs3In的序列與所述GS3等位基因匹配，并在3'末端引入一個錯配。
[0011] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，擴(kuò)增水稻基因組DNA時，如果同時含有720bp和308bp 兩條特征條帶，則為含粒長gs3等位基因；如果僅含有72化P的特征條帶，則為不含粒長 gs3等位基因。
[0012] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述水稻粒長基因GS3的功能標(biāo)記采用W下步驟進(jìn)行 分子標(biāo)記：
[001引步驟1)冰稻植株基因組DNA的提?。?br> [0014] 步驟。；PCR擴(kuò)增；將所述的gs3F、gs3In和gs3R引物加入到PCR反應(yīng)體系中， 并對所述水稻植株基因組DM進(jìn)行擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物；所述PCR反應(yīng)程序為；94°C預(yù)變性 5min ;然后94°C變性30s、55°C變性30s、72°C變性45s，循環(huán)35次；然后72°C延伸lOmin后 得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0015] 步驟3):將擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量比濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳，然后漠化己錠 染色，紫外燈下觀察并拍照得到電泳圖；
[0016] 步驟4);根據(jù)電泳圖進(jìn)行分析，如果同時含有720bp和308bp兩條特征條帶，則為 含粒長gs3等位基因；如果僅含有72化P的特征條帶，則為不含粒長gs3等位基因，為短粒 品種。
[0017] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，上述步驟中，所述PCR反應(yīng)體系為20 UL的體系： 2. 0 y L 的 10XBuffer、2. 0 y L 的 dNTPs、4mol/L 的 gs3F、4mol/L 的 gs3In 和 4mol/L 的 gs3R 引物各 l.OuUO. 2yL Taq DM 聚合酶，2. OuL 模板 DNA，12. 8yL (1地2〇。
[0018] 本發(fā)明還提供了水稻粒長基因GS3的功能標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0020] 本發(fā)明針對技術(shù)問題，設(shè)計了一條能匹配長粒等位基因gs3的引物gs3In(3'端錯 配一個堿基），并在其上游一條引物gs3F，下游設(shè)計一條gs3R。S條引物同時在PCR體系中 進(jìn)行擴(kuò)增，長粒等位基因gs3的序列與gs3In只有一個堿基錯配，故gs3F與gs3In之間的 308bp能擴(kuò)增出來；而短粒等位基因GS3與引物gs3In有兩個堿基錯配，則308bp的帶就不 能擴(kuò)增出來。該樣，擴(kuò)增產(chǎn)物不需要進(jìn)行酶切，直接電泳檢測是否含有308bp的條帶，就能 檢測出是否含有g(shù)s等位基因；簡化了步驟，不僅能快速、準(zhǔn)確的鑒定水稻種質(zhì)資源或育種 群體是否含有g(shù)s等位基因，而且在育種中加速了選育進(jìn)程，提高了效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是本發(fā)明粒長等位基因的擴(kuò)增示意圖；
[0022] 圖2是本發(fā)明檢測24個水稻品種分子標(biāo)記的電泳圖。
[0023] 圖中，M 為 Marker200,從上到下條帶分別為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp 和 lOObp ;1-II-32B ;2-BX-16 ;3-崗 4她；4-特 B ;5-良豐 B ;6-112B ;7-西菲 B ;8-龍 豐 B ;9-博 IIB ;10-158B ;11-地谷 B ;12-福伊 B ;13-谷梅 4 號；14-02428 ;15-南梗 46 ; 16-BL122 ;17-博 IIIB ;18-協(xié)青早 B ;19-B5 ;20-IRBB7 ;21-L427 ;22-金 23B ;23-內(nèi)香 B ; 24-泰豐B。

【具體實施方式】
[0024] W下將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳述。
[00巧]實施例1
[0026] 具體實施步驟如下：
[0027] (1)水稻基因組DNA提取
[002引分別取種植于南寧的24份水稻葉片，通過CTAB法（十六燒基=甲基漠化錠法） 提取水稚基因組DNA ;
[0029] (2) PCR 擴(kuò)增
[0030] PCR 反應(yīng)體系為 20yL 的體系；2. OuL 10XBuffer，2. OuL dNTPs，gs3F、gs3In 和 gs3R 引物各 1.0yL(4mol/L)，0. 2yL Taq DM 聚合酶，2. OuL 模板 DNA，12. 8yL (1地2〇。 PCR 反應(yīng)程序為 94°C 5min ;然后 94°C 30s、55°C 30s、72°C 45s，循環(huán) 35 次；最后 72°C延伸 lOmin得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0031] (3)將擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，漠化己錠染色，紫外燈下觀察拍 照得到電泳圖；
[00對 （4)結(jié)果與分析；
[0033] 24個水稻品種的分子標(biāo)記的電泳圖詳見圖1，24個水稻品種的粒長表型和基因性 詳見表1。由圖1和表1可見；基因型為"+ "為圖1中有720bp和308bp兩條帶的品種，其 粒長較長；基因性為為圖1中僅有720bp條帶的品種，其粒長均較短。
[0034] 表1 24個水稻品種及其粒長表型和基因性
[0035]

【權(quán)利要求】
1. 水稻粒長基因GS3的功能標(biāo)記，其特征在于，所述水稻粒長基因GS3的粒長等位基因 的顯性分子標(biāo)記M-GS3由三條引物構(gòu)成： gs3F引物：AITGGCTTGAITTCCTGTGC; gs3In引物：GCAGGCTGGCTTACTTTCTT; gs3R引物：TTGCTCTTACGGGAGGACAC。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能標(biāo)記，其特征在于：擴(kuò)增水稻基因組DNA時，如果同時含 有720bp和308bp兩條特征條帶，則為含粒長gs3等位基因；如果僅含有720bp的特征條 帶，則為不含粒長gs3等位基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的功能標(biāo)記，其特征在于，采用以下步驟進(jìn)行分子標(biāo)記： 步驟1):水稻植株基因組DNA的提??； 步驟2) :PCR擴(kuò)增：將所述的gs3F、gs3In和gs3R引物加入到PCR反應(yīng)體系中，并對所 述水稻植株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物；所述PCR反應(yīng)程序為：94 °C預(yù)變性5min ;然后94°C變性30s、55°C變性30s、72°C變性45s，循環(huán)35次；然后72°C延伸10min后得 到擴(kuò)增產(chǎn)物； 步驟3):將擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量比濃度為1. 2%的瓊脂糖凝膠中電泳，然后溴化乙錠染色， 紫外燈下觀察并拍照得到電泳圖； 步驟4):根據(jù)電泳圖進(jìn)行分析，如果同時含有720bp和308bp兩條特征條帶，則為含粒 長gs3等位基因；如果僅含有720bp的特征條帶，則為不含粒長gs3等位基因，為短粒品種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的功能標(biāo)記，其特征在于：所述PCR反應(yīng)體系為20yL的體系： 2.0yL的 10XBuffer、2.0yL的dNTPs、4mol/L的gs3F、4mol/L的gs3In和 4mol/L的 gs3R引物各 1.0yL、0.2yLTaqDNA聚合酶，2.0yL模板DNA，12.8yLddH20。
5. 權(quán)利要求1所述的水稻粒長基因GS3的功能標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104513859SQ201410852508
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】鄧國富, 高利軍, 周萌, 周維永, 陳小林, 顏群, 戴高興, 梁海福, 陳仁天, 李瑞芳, 陳韋韋 申請人:廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所, 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所