檢測(cè)g6pd缺乏癥基因突變的引物、探針及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)G6PD缺乏癥基因突變的引物，包括以下序列的引物：SEQ ID NO:1-32。本發(fā)明還涉及一種用于檢測(cè)G6PD缺乏癥基因突變的探針，包括以下序列的探針：SEQ ID NO:33-67。本發(fā)明還涉及一種用于檢測(cè)G6PD缺乏癥基因突變的試劑盒，包括PCR反應(yīng)液Ⅰ、PCR反應(yīng)液Ⅱ和PCR反應(yīng)液Ⅲ。本發(fā)明的用于檢測(cè)G6PD缺乏癥基因突變的試劑盒具有覆蓋率高、女性雜合子的檢出率高、成本低廉以及準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】檢測(cè)G6PD缺乏癥基因突變的引物、探針及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測(cè)技術(shù)，特別涉及檢測(cè)G6ro缺乏癥基因突變的引物、探針及試 劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖 _6_ 憐酸脫氛酶缺乏癥（Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency，G6PD deficiency)是最常見(jiàn)的人類(lèi)酶缺陷病之一。G6H)缺乏癥的實(shí)質(zhì)是G6H) 基因突變，為X連鎖不完全顯性遺傳?；颊吲R床表現(xiàn)變化不一。G6H)缺乏者如能被檢出并 給予早期干預(yù)，常常能夠起到很好的預(yù)防效果。男性因只有一條X染色體，故群體中僅存在 正常與顯著缺乏的半合子兩類(lèi)人群。女性有兩條X染色體，據(jù)其攜帶G6H)突變基因的數(shù) 量不同分為正常、雜合子和純合子人群。雜合子占女性患者的絕大多數(shù)。國(guó)內(nèi)外早就證實(shí) G6ro缺乏雜合子是可以發(fā)病的，而且國(guó)外的前瞻性研宄表明G6ro雜合子發(fā)生新生兒高膽 紅素血癥的危險(xiǎn)要顯著高于G6ro正常純合子，G6ro缺乏雜合子是新生兒高膽紅素血癥發(fā) 生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。
[0003] 目前國(guó)內(nèi)臨床上采用的G6H)活性篩查試驗(yàn)有高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)、硝基四唑 氮藍(lán)（NBT)紙片法和熒光斑點(diǎn)法。部分實(shí)驗(yàn)室采用全自動(dòng)生化分析儀酶法定量檢測(cè)新生兒 臍血G6ro缺乏癥篩查。許多實(shí)驗(yàn)室采用熒光斑點(diǎn)法作定性初篩，然后用比值法作定量確 診。盡管兩種方法優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，可提高篩查敏感性與診斷準(zhǔn)確性，對(duì)男性半合子及女性純合子 均可準(zhǔn)確檢出，但對(duì)女性雜合子的實(shí)際檢出率仍然不理想，原因可能是多方面的，操作者本 身的差別可能會(huì)對(duì)結(jié)果有一定影響。但從雜合子的發(fā)病機(jī)制上看，酶學(xué)檢測(cè)本身無(wú)法檢出 大多數(shù)的雜合子才是最根本的原因。分子生物學(xué)手段檢測(cè)基因突變是雜合子檢測(cè)的金標(biāo) 準(zhǔn)，目前國(guó)內(nèi)在這方面已經(jīng)取得了一些成績(jī)，ARMS(突變特異性擴(kuò)增系統(tǒng)）、限制性內(nèi)切酶 法、高分辨率熔解曲線分析（HRM)、變性高效液相色譜法（DHPLC)法和基因芯片法已經(jīng)廣泛 用于G6H)缺乏癥已知突變基因的檢測(cè)，并且取得了很好的效果?？傮w上來(lái)說(shuō)，上述分子生 物學(xué)的方法對(duì)雜合子的檢出率雖高達(dá)90%?99%，但技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)用昂貴、耗時(shí)長(zhǎng)，只用于 科學(xué)研宄，目前尚未在臨床醫(yī)院推廣使用，因此開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速、價(jià)格低廉的基因檢測(cè) 篩查方法，提高雜合子的檢出率，是臨床的基本需求。
[0004] 迄今全世界已報(bào)道160多種G6H)基因突變型，在我國(guó)人群中已發(fā)現(xiàn)至少34種， G1376T、G1388A、A95G是中國(guó)人最常見(jiàn)的3種突變，現(xiàn)在市面并無(wú)成熟應(yīng)用于臨床的G6H) 缺乏癥基因診斷產(chǎn)品，應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室科研研宄的技術(shù)方法例如ARMS、限制性內(nèi)切酶法、HRM 和DHPLC法等均有臨床應(yīng)用難推廣的缺點(diǎn)。
[0005] 現(xiàn)有的分子檢測(cè)方法雖然能較好的解決G6ro缺乏癥女性雜合子檢測(cè)的問(wèn)題，但 不同的方法有著自身的局限性：（1) DHPLC對(duì)儀器要求設(shè)備高，應(yīng)用性不強(qiáng)；（2) ARMS檢測(cè)的 通量十分有限，而且需要PCR后處理，容易出現(xiàn)污染造成假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生；（3)多重等位 基因特異PCR(multiplex allele specific PCR，MAS_PCR)法較為簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、可靠，但由于 在一個(gè)反應(yīng)體系中，多對(duì)引物之間易發(fā)生相互干擾，影響PCR結(jié)果，所以一個(gè)PCR反應(yīng)管只 宜檢測(cè)有限的幾種突變，對(duì)G6ro缺乏癥如此多突變的診斷來(lái)說(shuō)，檢出率有限；(4)熒光PCR 熔解曲線法雖然靈敏性高，但準(zhǔn)確性低、通量低，多個(gè)位點(diǎn)同管檢測(cè)的結(jié)果判讀較難，尤其 雜合子熔解鋒圖更為復(fù)雜難判讀，臨床應(yīng)用受限；（5)反向點(diǎn)雜交方法靈敏、可靠，成本低， 但操作繁瑣，需要對(duì)PCR產(chǎn)物做后處理，容易引起污染，結(jié)果判讀易受主觀影響。（6)測(cè)序法 操作步驟繁多，需要特殊的昂貴儀器，檢測(cè)成本貴。
[0006] 上述方法的缺陷直接限制了它們?cè)贕6H)缺乏癥基因檢測(cè)的臨床應(yīng)用，即存在臨 床應(yīng)用推廣較難的問(wèn)題；此外，以上述方法為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的基因檢測(cè)試劑盒同時(shí)還存在覆蓋 率不高的缺陷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種檢出率高且適合臨床應(yīng)用的熒光PCR法 檢測(cè)G6H)缺乏癥基因突變的試劑盒。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0009] -種用于檢測(cè)G6F*D缺乏癥基因突變的引物，包括以下序列的引物：
[0010] 特異性擴(kuò)增1376T位點(diǎn)、1388A位點(diǎn)的上游引物F1和下游引物R1，所述F1的序列 如：SEQ ID NO:l，所述R1的序列如：SEQ ID NO:2 ;特異性擴(kuò)增871A位點(diǎn)的上游引物F2和 下游引物R2,所述F2的序列如：SEQ ID NO:3,所述R2的序列如：SEQ ID N0:4;特異性擴(kuò)增 95G位點(diǎn)的上游引物F3和下游引物R3,所述F3的序列如：SEQ ID NO:5,所述R3的序列如： SEQ ID NO:6 ;特異性擴(kuò)增392T位點(diǎn)的上游引物F4和下游引物R4,所述F4的序列如：SEQ ID NO:7,所述R4的序列如：SEQ ID NO:8 ;特異性擴(kuò)增1024T位點(diǎn)的上游引物F5和下游引 物尺5，所述？5的序列如觀〇10勵(lì):9，所述1?5的序列如觀〇10^) :10;特異性擴(kuò)增196八 位點(diǎn)、202A位點(diǎn)的上游引物F6和下游引物R6,所述F6的序列如：SEQ ID NO:ll，所述R6的 序列如：SEQ ID NO: 12 ;特異性擴(kuò)增274T位點(diǎn)的上游引物F7和下游引物R7,所述F7的序 列如：SEQ ID NO: 13,所述 R7 的序列如：SEQ ID NO: 14;特異性擴(kuò)增 383(^^4061^1^、 442A位點(diǎn)、473A位點(diǎn)的上游引物F8和下游引物R8,所述F8的序列如：SEQ ID N0:15,所述 R8的序列如：SEQ ID NO: 16 ;特異性擴(kuò)增487A位點(diǎn)、493G位點(diǎn)、517C位點(diǎn)、519G位點(diǎn)、563T 位點(diǎn)、592T位點(diǎn)的上游引物F9和下游引物R9,所述F9的序列如：SEQ ID N0:17,所述R9的 序列如：SEQ ID N0:18 ;特異性擴(kuò)增691C位點(diǎn)、703T位點(diǎn)的上游引物F10和下游引物R10， 所述？10的序列如：5￡〇10勵(lì)：19，所述1?10的序列如 ：5￡〇10勵(lì):20;特異性擴(kuò)增835八位 點(diǎn)、835C位點(diǎn)的上游引物F11和下游引物R11，所述F11的序列如：SEQ ID N0:21，所述R11 的序列如：SEQ ID N0:22 ;特異性擴(kuò)增1004T位點(diǎn)的上游引物F12和下游引物R12,所述F12 的序列如：SEQ ID N0:23,所述R12的序列如：SEQ ID N0:24;特異性擴(kuò)增1159T位點(diǎn)、1160A 位點(diǎn)、1225T位點(diǎn)的上游引物F13和下游引物R13,所述F13的序列如：SEQ ID N0:25,所述 R13的序列如：SEQ ID N0:26 ;特異性擴(kuò)增1311T位點(diǎn)、1339A位點(diǎn)、1340T位點(diǎn)、1360T位點(diǎn)、 1381A位點(diǎn)、1387T位點(diǎn)、1414C位點(diǎn)的上游引物F14和下游引物R14,所述F14的序列如： SEQ ID N0:27,所述R14的序列如：SEQ ID N0:28;特異性擴(kuò)增ACTBP位點(diǎn)的上游引物F15 和下游引物R15,所述F15的序列如：SEQ ID N0:29,所述R15的序列如：SEQ ID N0:30;以 及通用上游引物F16和下游引物R16,所述F16的序列如：SEQ ID N0:31，所述R16的序列 如：SEQ ID NO:32。
[0011] 本發(fā)明的一種用于檢測(cè)G6ro缺乏癥基因突變的探針，包括以下序列的探針：特異 性識(shí)別1376T位點(diǎn)的探針P1，所述P1的序列如：SEQ ID NO:33 ;特異性識(shí)別1388A位點(diǎn)的 探針P2,所述P2的序列如：SEQ ID NO:34 ;特異性識(shí)別871A位點(diǎn)的探針P3,所述P3的序列 如：SEQ ID NO:35 ;特異性識(shí)別95G位點(diǎn)的探針P4,所述P4的序列如：SEQ ID NO:36 ;特異 性識(shí)別392T位點(diǎn)的探針P5,所述P5的序列如：SEQ ID NO:37 ;特異性識(shí)別1024T位點(diǎn)的探 針P6,所述P6的序列如：SEQ ID NO: 38 ;特異性識(shí)別196A位點(diǎn)的探針P7,所述P7的序列 如：SEQ ID N0:39 ;特異性識(shí)別202A位點(diǎn)的探針P8,所述P8的序列如：SEQ ID N0:40 ;特異 性識(shí)別274T位點(diǎn)的探針P9,所述P9的序列如：SEQ ID N0:41 ;特異性識(shí)別383C位點(diǎn)的探 針P10,所述P10的序列如：SEQ ID N0:42 ;特異性識(shí)別406T位點(diǎn)的探針P11，所述P11的序 列如：SEQ ID N0:43;特異性識(shí)別442A位點(diǎn)的探針P12,所述P12的序列如：SEQ ID N0:44; 特異性識(shí)別473A位點(diǎn)的探針P13,所述P13的序列如：SEQ ID N0:45 ;特異性識(shí)別487A位 點(diǎn)的探針P14,所述P14的序列如：SEQ ID N0:46 ;特異性識(shí)別493G位點(diǎn)的探針P15,所述 P15的序列如：SEQ ID N0:47;特異性識(shí)別517C位點(diǎn)的探針P16,所述P16的序列如：SEQ ID N0:48 ;特異性識(shí)別519G位點(diǎn)的探針P17,所述P17的序列如：SEQ ID N0:49 ;特異性識(shí)別 563T位點(diǎn)的探針P18,所述P18的序列如：SEQ ID N0:50;特異性識(shí)別592T位點(diǎn)的探針P19， 所述P19的序列如：SEQ ID N0:51 ;特異性識(shí)別691C位點(diǎn)的探針P20,所述P20的序列如： SEQ ID N0:52 ;特異性識(shí)別703T位點(diǎn)的探針P21，所述P21的序列如：SEQ ID N0:53 ;特異 性識(shí)別835A位點(diǎn)的探針P22,所述P22的序列如：SEQ ID N0:54 ;特異性識(shí)別835C位點(diǎn)的 探針P23,所述P23的序列如：SEQ ID NO: 55 ;特異性識(shí)別1004T位點(diǎn)的探針P24,所述P24 的序列如：SEQ ID N0:56;特異性識(shí)別1159T位點(diǎn)的探針P25,所述P25的序列如：SEQ ID N0:57 ;特異性識(shí)別1160A位點(diǎn)的探針P26,所述P26的序列如：SEQ ID N0:58 ;特異性識(shí)別 1225T位點(diǎn)的探針P27,所述P27的序列如：SEQ ID N0:59;特異性識(shí)別1311T位點(diǎn)的探針 P28,所述P28的序列如：SEQ ID N0:60 ;特異性識(shí)別1339A位點(diǎn)的探針P29,所述P29的序列 如：SEQ ID N0:61 ;特異性識(shí)別1340T位點(diǎn)的探針P30,所述P30的序列如：SEQ ID N0:62 ; 特異性識(shí)別1360T位點(diǎn)的探針P31，所述P31的序列如：SEQ ID N0:63 ;特異性識(shí)別1381A位 點(diǎn)的探針P32,所述P32的序列如：SEQ ID N0:64 ;特異性識(shí)別1387T位點(diǎn)的探針P33,所述 P33的序列如：SEQ ID N0:65 ;特異性識(shí)別1414C位點(diǎn)的探針P34,所述P34的序列如：SEQ ID N0:66 ;特異性識(shí)別ACTBP位點(diǎn)的探針P35,所述P35的序列如：SEQ ID N0:67。
[0012] 本發(fā)明還公開(kāi)一種用于檢測(cè)G6H)缺乏癥基因突變的試劑盒，包括PCR反應(yīng)液I、 PCR反應(yīng)液II和PCR反應(yīng)液III，所述PCR反應(yīng)液I包括特異性擴(kuò)增1376T位點(diǎn)、1388A位點(diǎn) 的上游引物F1和下游引物R1，特異性擴(kuò)增871A位點(diǎn)的上游引物F2和下游引物R2,特異性 擴(kuò)增ACTBP位點(diǎn)的上游引物F15和下游引物R15,通用上游引物F16和下游引物R16,特異 性識(shí)別1376T位點(diǎn)的探針P1，特異性識(shí)別1388A位點(diǎn)的探針P2,以及特異性識(shí)別871A位點(diǎn) 的探針P3 ;所述PCR反應(yīng)液II包括特異性擴(kuò)增95G位點(diǎn)的上游引物F3和下游引物R3,特 異性擴(kuò)增392T位點(diǎn)的上游引物F4和下游引物R4,特異性擴(kuò)增ACTBP位點(diǎn)的上游引物F15 和下游引物R15,通用上游引物F16和下游引物R16,特異性擴(kuò)增1024T位點(diǎn)的上游引物F5 和下游引物R5,特異性識(shí)別95G位點(diǎn)的探針P4,特異性識(shí)別392T位點(diǎn)的探針P5,以及特異 性識(shí)別1024T位點(diǎn)的探針P6 ;所述PCR反應(yīng)液III包括特異性擴(kuò)增196A位點(diǎn)、202A位點(diǎn)的 上游引物F6和下游引物R6，特異性擴(kuò)增274T位點(diǎn)的上游引物F7和下游引物R7，特異性擴(kuò) 增383C位點(diǎn)、406T位點(diǎn)、442A位點(diǎn)、473A位點(diǎn)的上游引物F8和下游引物R8,特異性擴(kuò)增 487A位點(diǎn)、493G位點(diǎn)、517C位點(diǎn)、519G位點(diǎn)、563T位點(diǎn)、592T位點(diǎn)的上游引物F9和下游引 物R9,特異性擴(kuò)增691C位點(diǎn)、703T位點(diǎn)的上游引物F10和下游引物R10,特異性擴(kuò)增835A 位點(diǎn)、835C位點(diǎn)的上游引物F11和下游引物R11，特異性擴(kuò)增1004T位點(diǎn)的上游引物F12和 下游引物R12，特異性擴(kuò)增1159T位點(diǎn)、1160A位點(diǎn)、1225T位點(diǎn)的上游引物F13和下游引物 R13，特異性擴(kuò)增1311T位點(diǎn)、1339A位點(diǎn)、1340T位點(diǎn)、1360T位點(diǎn)、1381A位點(diǎn)、138H位點(diǎn)、 1414C位點(diǎn)的上游引物F14和下游引物R14,特異性擴(kuò)增ACTBP位點(diǎn)的上游引物F15和下游 引物R15,通用上游引物F16和下游引物R16,特異性識(shí)別196A位點(diǎn)的探針P7,特異性識(shí)別 202A位點(diǎn)的探針P8,特異性識(shí)別274T位點(diǎn)的探針P9,特異性識(shí)別383C位點(diǎn)的探針P10,特 異性識(shí)別406T位點(diǎn)的探針PI 1，特異性識(shí)別442A位點(diǎn)的探針P12,特異性識(shí)別473A位點(diǎn)的 探針P13,特異性識(shí)別487A位點(diǎn)的探針P14,特異性識(shí)別493G位點(diǎn)的探針P15,特異性識(shí)別 517C位點(diǎn)的探針P16,特異性識(shí)別519G位點(diǎn)的探針P17,特異性識(shí)別563T位點(diǎn)的探針P18， 特異性識(shí)別592T位點(diǎn)的探針P19,特異性識(shí)別691C位點(diǎn)的探針P20,特異性識(shí)別703T位點(diǎn) 的探針P21，特異性識(shí)別835A位點(diǎn)的探針P22,特異性識(shí)別835C位點(diǎn)的探針P23,特異性識(shí) 另lj 1004T位點(diǎn)的探針P24,特異性識(shí)別1159T位點(diǎn)的探針P25,特異性識(shí)別1160A位點(diǎn)的探 針P26,特異性識(shí)別1225T位點(diǎn)的探針P27,特異性識(shí)別1311T位點(diǎn)的探針P28,特異性識(shí)別 1339A位點(diǎn)的探針P29,特異性識(shí)別1340T位點(diǎn)的探針P30,特異性識(shí)別1360T位點(diǎn)的探針 P31，特異性識(shí)別1381A位點(diǎn)的探針P32,特異性識(shí)別1387T位點(diǎn)的探針P33,以及特異性識(shí) 另lj 1414C位點(diǎn)的探針P34。
[0013] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0014] (1)應(yīng)用特殊翹尾修飾的Taqman探針及帶有通用擴(kuò)增引物的特異位點(diǎn)擴(kuò)增方法， 對(duì)覆蓋了大多數(shù)G6H)突變?nèi)巳旱?種最常見(jiàn)突變點(diǎn)做單獨(dú)分型，將28種非常見(jiàn)位點(diǎn)中的 相鄰位點(diǎn)用同種熒光標(biāo)記，既滿足了檢測(cè)準(zhǔn)確性、特異性的要求，又縮小了進(jìn)一步排查稀有 基因型的范圍，無(wú)需對(duì)各個(gè)稀有位點(diǎn)做分管檢測(cè)，降低了檢測(cè)成本；（2)本發(fā)明的用于檢測(cè) G6H)缺乏癥基因突變的試劑盒可在三管PCR反應(yīng)液中可完成34個(gè)位點(diǎn)的34種突變的檢 測(cè)，通過(guò)簡(jiǎn)單的加樣上機(jī)，整個(gè)操作在1?1. 5小時(shí)內(nèi)即可完成，操作步驟少、耗時(shí)短；（3) PCR反應(yīng)液I、PCR反應(yīng)液II和PCR反應(yīng)液III可以先取PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液II對(duì)6個(gè) 常見(jiàn)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，在排除6常見(jiàn)位點(diǎn)后再取PCR反應(yīng)液III對(duì)常見(jiàn)位點(diǎn)范圍外的樣本進(jìn)行 檢測(cè)，從而可進(jìn)一步降低臨床檢測(cè)成本。（4)本發(fā)明為均相檢測(cè)體系，添加模板后PCR閉管 擴(kuò)增，無(wú)需PCR后處理，減少了 PCR產(chǎn)物污染幾率；（5)可同時(shí)檢測(cè)G6H)基因34個(gè)位點(diǎn)的 34種突變類(lèi)型，檢測(cè)位點(diǎn)多，對(duì)中國(guó)人群的突變覆蓋率高，可滿足臨床對(duì)G6H)缺乏癥患者 或攜帶者的篩查需求；(6)可通過(guò)擴(kuò)增曲線的"有"或"無(wú)"判斷各突變位點(diǎn)的"陽(yáng)性"或"陰 性"，結(jié)果容易判讀，不易出錯(cuò)，特異性高。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為1376GXT突變時(shí)的擴(kuò)增曲線圖；
[0016] 圖2為1388G>A突變時(shí)的擴(kuò)增曲線圖；
[0017] 圖3為871G>A突變時(shí)的擴(kuò)增曲線圖；
[0018] 圖4為95A>G突變時(shí)的擴(kuò)增曲線圖；
[0019] 圖5為1024C>T突變時(shí)的擴(kuò)增曲線圖；
[0020] 圖6為392G>T突變時(shí)的擴(kuò)增曲線圖；
[0021] 圖7為不分型的28位點(diǎn)突變時(shí)的擴(kuò)增曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 為詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附 圖予以說(shuō)明。
[0023] 本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于：特殊翹尾修飾的Taqman探針及帶有通用擴(kuò)增引物的 特異位點(diǎn)擴(kuò)增方法，對(duì)覆蓋了大多數(shù)G6H)突變?nèi)巳旱?4種類(lèi)型進(jìn)行檢測(cè)，具有檢測(cè)準(zhǔn)確性 高、特異性高、檢測(cè)成本低的優(yōu)點(diǎn)。
[0024] 本發(fā)明的用于檢測(cè)G6H)缺乏癥基因突變的引物，包括以下序列的引物：SEQ ID NO: 1-32。本發(fā)明的用于檢測(cè)G6H)缺乏癥基因突變的探針，包括以下序列的探針：SEQ ID NO: 33-67。本發(fā)明還公開(kāi)一種用于檢測(cè)G6H)缺乏癥基因突變的試劑盒，包括PCR反應(yīng)液I、 PCR反應(yīng)液II和PCR反應(yīng)液III。
[0025] 進(jìn)一步的，所述PCR反應(yīng)液I、PCR反應(yīng)液II和PCR反應(yīng)液III分別包括特異性擴(kuò)增 ACTBP位點(diǎn)的上游引物F15和下游引物R15,以及特異性識(shí)別ACTBP位點(diǎn)的探針P35。進(jìn)一 步的，所述PCR反應(yīng)液I、PCR反應(yīng)液II和PCR反應(yīng)液III分別包括10XPCR buffer、5XProbe qPCR buffer、dNTPs和Hotstart taq酶。進(jìn)一步的，所述探針的Y端進(jìn)行焚光素標(biāo)記，所 述熒光素為VIC、R0X、Cy5或FAM。進(jìn)一步的，還包括陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，所述陽(yáng)性質(zhì) 控品包括871G>A突變、1004C>A突變和1376G>T突變標(biāo)準(zhǔn)品，所述陰性質(zhì)控品為無(wú)菌水。
[0026] 本發(fā)明通過(guò)特殊翹尾修飾的Taqman探針及帶有通用擴(kuò)增引物的特異位點(diǎn)擴(kuò)增方 法，對(duì)各個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的用于檢測(cè)G6H)缺乏癥基因突變的試劑盒包含A、B、 C三管PCR反應(yīng)液（PCR反應(yīng)液I、PCR反應(yīng)液II和PCR反應(yīng)液III)及各管對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性質(zhì)控 品，A管（PCR反應(yīng)液I )包含3個(gè)位點(diǎn)、B管（PCR反應(yīng)液II )包含3個(gè)位點(diǎn)及C管（PCR反 應(yīng)液III)包含28個(gè)位點(diǎn)，共設(shè)計(jì)三管多重?zé)晒釶CR反應(yīng)液，檢測(cè)僅需添加DNA模板后上機(jī) 運(yùn)行l(wèi)h，采集PCR過(guò)程中的熒光信號(hào)，通過(guò)Ct值對(duì)擴(kuò)增曲線進(jìn)行簡(jiǎn)單定性判讀，操作簡(jiǎn)便， 無(wú)需進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳或純化，避免了開(kāi)管引起的污染，適合大批量樣本篩查檢測(cè)。
[0027] (1)探針、引物設(shè)計(jì)：本發(fā)明的用于檢測(cè)G6H)缺乏癥基因突變的試劑盒是在多重 熒光PCR技術(shù)上開(kāi)發(fā)的一款穩(wěn)定性高、價(jià)格低廉的試劑盒。多重?zé)晒釶CR體系是一個(gè)比較復(fù) 雜的擴(kuò)增體系，既要保證各個(gè)位點(diǎn)的準(zhǔn)確性、特異性，又要兼顧各個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增效率接近。 僅僅針對(duì)各位點(diǎn)設(shè)計(jì)大量引物、探針進(jìn)行篩選，無(wú)法達(dá)到預(yù)期的臨床檢測(cè)要求。
[0028] 我們根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)的G6H)基因序列及各位點(diǎn)突變堿基序列，耗費(fèi)了大量 精力進(jìn)行各位點(diǎn)探針序列的設(shè)計(jì)優(yōu)化、序列比對(duì)，對(duì)位置相近的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)合并擴(kuò)增引 物，擴(kuò)增引物包含了特異引物序列及通用擴(kuò)增Tag片段。針對(duì)各個(gè)突變點(diǎn)分別設(shè)計(jì)了不同 標(biāo)記、部分5'端翹尾修飾的Taqman探針，避免各探針間的引物二聚體及非特異結(jié)合。PCR 反應(yīng)液I、PCR反應(yīng)液II的6個(gè)位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)了 2?3對(duì)擴(kuò)增引物及Taqman探針，各個(gè)位 點(diǎn)的探針?lè)謩e用不同的熒光標(biāo)記進(jìn)行區(qū)分，PCR反應(yīng)液III的28個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)了 Taqman探 針，相鄰位點(diǎn)共用擴(kuò)增引物，三管反應(yīng)液共用一對(duì)內(nèi)參基因的擴(kuò)增引物及一條探針做內(nèi)控 監(jiān)測(cè)。
[0029] 本試劑盒的各個(gè)位點(diǎn)的引物、探針序列均是經(jīng)過(guò)優(yōu)化篩選的特異序列，每個(gè)位點(diǎn) 選定最優(yōu)的探針、引物后，與其他位點(diǎn)的引物、探針各做大量正交對(duì)比實(shí)驗(yàn)確定各自的用 量。表1為本發(fā)明各個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增引物及探針序列表。
[0030] 表 1
[0031]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)Gero缺乏癥基因突變的引物，其特征在于，包括以下序列的引物： 特異性擴(kuò)增1376T位點(diǎn)、1388A位點(diǎn)的上游引物F1和下游引物R1，所述F1的序列如： SEQ ID N0:1，所述 R1 的序列如：SEQ ID N0:2 ; 特異性擴(kuò)增871A位點(diǎn)的上游引物F2和下游引物R2,所述F2的序列如：SEQ ID N0:3， 所述R2的序列如：SEQ ID NO:4 ; 特異性擴(kuò)增95G位點(diǎn)的上游引物F3和下游引物R3,所述F3的序列如：SEQ ID N0:5， 所述R3的序列如：SEQ ID NO:6 ; 特異性擴(kuò)增392T位點(diǎn)的上游引物F4和下游引物R4,所述F4的序列如：SEQ ID N0:7， 所述R4的序列如：SEQ ID NO:8 ; 特異性擴(kuò)增1024T位點(diǎn)的上游引物F5和下游引物R5,所述F5的序列如：SEQ ID N0:9， 所述R5的序列如：SEQ ID NO: 10 ; 特異性擴(kuò)增196A位點(diǎn)、202A位點(diǎn)的上游引物F6和下游引物R6,所述F6的序列如：SEQ ID NO: 11，所述 R6 的序列如：SEQ ID NO: 12 ; 特異性擴(kuò)增274T位點(diǎn)的上游引物F7和下游引物R7,所述F7的序列如：SEQ ID NO: 13， 所述R7的序列如：SEQ ID NO: 14 ; 特異性擴(kuò)增383C位點(diǎn)、406T位點(diǎn)、442A位點(diǎn)、473A位點(diǎn)的上游引物F8和下游引物R8， 所述？8的序列如：5￡〇10勵(lì)：15，所述1?8的序列如：5￡〇10勵(lì)：16; 特異性擴(kuò)增487A位點(diǎn)、493G位點(diǎn)、517C位點(diǎn)、519G位點(diǎn)、563T位點(diǎn)、592T位點(diǎn)的上游引 物F9和下游引物R9，所述F9的序列如：SEQIDN0:17，所述R9的序列如：SEQIDN0 :18; 特異性擴(kuò)增691C位點(diǎn)、703T位點(diǎn)的上游引物F10和下游引物R10，所述F10的序列如： 5￡〇10勵(lì)：19，所述1?10的序列如：5￡〇10勵(lì):20; 特異性擴(kuò)增835A位點(diǎn)、835C位點(diǎn)的上游引物F11和下游引物R11，所述FI 1的序列如： 5￡〇10勵(lì):21，所述1?11的序列如：5￡〇10勵(lì):22; 特異性擴(kuò)增1004T位點(diǎn)的上游引物F12和下游引物R12,所述F12的序列如：SEQ ID NO: 23,所述 R12 的序列如：SEQ ID NO: 24 ; 特異性擴(kuò)增1159T位點(diǎn)、1160A位點(diǎn)、1225T位點(diǎn)的上游引物F13和下游引物R13，所述 ?13的序列如；5￡〇10勵(lì):25，所述1?13的序列如：5￡〇10勵(lì):26; 特異性擴(kuò)增1311T位點(diǎn)、1339A位點(diǎn)、1340T位點(diǎn)、1360T位點(diǎn)、1381A位點(diǎn)、138H位點(diǎn)、 1414C位點(diǎn)的上游引物F14和下游引物R14,所述F14的序列如：SEQ ID N0:27,所述R14的 序列如：SEQ ID N0:28 ; 特異性擴(kuò)增ACTBP位點(diǎn)的上游引物F15和下游引物R15,所述F15的序列如：SEQ ID NO: 29,所述 R15 的序列如：SEQ ID NO: 30 ; 以及通用上游引物F16和下游引物R16,所述F16的序列如：SEQ ID N0:31，所述R16的 序列如：SEQ ID NO:32。
2. -種用于檢測(cè)G6H)缺乏癥基因突變的探針，其特征在于，包括以下序列的探針： 特異性識(shí)別1376T位點(diǎn)的探針P1，所述P1的序列如：SEQ ID N0:33 ; 特異性識(shí)別1388A位點(diǎn)的探針P2,所述P2的序列如：SEQ ID N0:34 ; 特異性識(shí)別871A位點(diǎn)的探針P3,所述P3的序列如：SEQ ID N0:35 ; 特異性識(shí)別95G位點(diǎn)的探針P4,所述P4的序列如：SEQ ID NO: 36 ; 特異性識(shí)別392T位點(diǎn)的探針P5,所述P5的序列如：SEQ ID N0:37 ; 特異性識(shí)別1024T位點(diǎn)的探針P6,所述P6的序列如：SEQ ID N0:38 ; 特異性識(shí)別196A位點(diǎn)的探針P7,所述P7的序列如：SEQ ID N0:39 ; 特異性識(shí)別202A位點(diǎn)的探針P8,所述P8的序列如：SEQ ID N0:40 ; 特異性識(shí)別274T位點(diǎn)的探針P9,所述P9的序列如：SEQ ID N0:41 ; 特異性識(shí)別383C位點(diǎn)的探針P10,所述P10的序列如：SEQ ID N0:42 ; 特異性識(shí)別406T位點(diǎn)的探針P11，所述P11的序列如：SEQ ID N0:43 ; 特異性識(shí)別442A位點(diǎn)的探針P12,所述P12的序列如：SEQ ID N0:44 ; 特異性識(shí)別473A位點(diǎn)的探針P13,所述P13的序列如：SEQ ID N0:45 ; 特異性識(shí)別487A位點(diǎn)的探針P14,所述P14的序列如：SEQ ID N0:46 ; 特異性識(shí)別493G位點(diǎn)的探針P15,所述P15的序列如：SEQ ID N0:47 ; 特異性識(shí)別517C位點(diǎn)的探針P16,所述P16的序列如：SEQ ID N0:48 ; 特異性識(shí)別519G位點(diǎn)的探針P17,所述P17的序列如：SEQ ID N0:49 ; 特異性識(shí)別563T位點(diǎn)的探針P18,所述P18的序列如：SEQ ID N0:50 ; 特異性識(shí)別592T位點(diǎn)的探針P19,所述P19的序列如：SEQ ID N0:51 ; 特異性識(shí)別691C位點(diǎn)的探針P20,所述P20的序列如：SEQ ID N0:52 ; 特異性識(shí)別703T位點(diǎn)的探針P21，所述P21的序列如：SEQ ID N0:53 ; 特異性識(shí)別835A位點(diǎn)的探針P22,所述P22的序列如：SEQ ID N0:54 ; 特異性識(shí)別835C位點(diǎn)的探針P23,所述P23的序列如：SEQ ID N0:55 ; 特異性識(shí)別1004T位點(diǎn)的探針P24,所述P24的序列如：SEQ ID N0:56 ; 特異性識(shí)別1159T位點(diǎn)的探針P25,所述P25的序列如：SEQ ID N0:57 ; 特異性識(shí)別1160A位點(diǎn)的探針P26,所述P26的序列如：SEQ ID N0:58 ; 特異性識(shí)別1225T位點(diǎn)的探針P27,所述P27的序列如：SEQ ID N0:59 ; 特異性識(shí)別1311T位點(diǎn)的探針P28,所述P28的序列如：SEQ ID N0:60 ; 特異性識(shí)別1339A位點(diǎn)的探針P29,所述P29的序列如：SEQ ID N0:61 ; 特異性識(shí)別1340T位點(diǎn)的探針P30,所述P30的序列如：SEQ ID N0:62 ; 特異性識(shí)別1360T位點(diǎn)的探針P31，所述P31的序列如：SEQ ID N0:63 ; 特異性識(shí)別1381A位點(diǎn)的探針P32,所述P32的序列如：SEQ ID N0:64 ; 特異性識(shí)別1387T位點(diǎn)的探針P33,所述P33的序列如：SEQ ID N0:65 ; 特異性識(shí)別1414C位點(diǎn)的探針P34,所述P34的序列如：SEQ ID N0:66 ; 特異性識(shí)別ACTBP位點(diǎn)的探針P35,所述P35的序列如：SEQ ID N0:67。
3. -種用于檢測(cè)G6H)缺乏癥基因突變的試劑盒，其特征在于，包括PCR反應(yīng)液I、PCR 反應(yīng)液II和PCR反應(yīng)液III， 所述PCR反應(yīng)液I包括特異性擴(kuò)增1376T位點(diǎn)、1388A位點(diǎn)的上游引物F1和下游引物 R1，特異性擴(kuò)增871A位點(diǎn)的上游引物F2和下游引物R2，特異性擴(kuò)增ACTBP位點(diǎn)的上游引物 F15和下游引物R15,通用上游引物F16和下游引物R16,特異性識(shí)別1376T位點(diǎn)的探針P1， 特異性識(shí)別1388A位點(diǎn)的探針P2,以及特異性識(shí)別871A位點(diǎn)的探針P3 ; 所述PCR反應(yīng)液II包括特異性擴(kuò)增95G位點(diǎn)的上游引物F3和下游引物R3,特異性擴(kuò) 增392T位點(diǎn)的上游引物F4和下游引物R4,特異性擴(kuò)增1024T位點(diǎn)的上游引物F5和下游引 物R5,特異性擴(kuò)增ACTBP位點(diǎn)的上游引物F15和下游引物R15,通用上游引物F16和下游引 物R16,特異性識(shí)別95G位點(diǎn)的探針P4,特異性識(shí)別392T位點(diǎn)的探針P5,以及特異性識(shí)別 1024T位點(diǎn)的探針P6 ; 所述PCR反應(yīng)液III包括特異性擴(kuò)增196A位點(diǎn)、202A位點(diǎn)的上游引物F6和下游引物R6， 特異性擴(kuò)增274T位點(diǎn)的上游引物F7和下游引物R7，特異性擴(kuò)增383C位點(diǎn)、406T位點(diǎn)、442A 位點(diǎn)、473A位點(diǎn)的上游引物F8和下游引物R8，特異性擴(kuò)增487A位點(diǎn)、493G位點(diǎn)、517C位點(diǎn)、 519G位點(diǎn)、563T位點(diǎn)、592T位點(diǎn)的上游引物F9和下游引物R9，特異性擴(kuò)增691C位點(diǎn)、703T 位點(diǎn)的上游引物F10和下游引物R10,特異性擴(kuò)增835A位點(diǎn)、835C位點(diǎn)的上游引物F11和下 游引物R11，特異性擴(kuò)增1004T位點(diǎn)的上游引物F12和下游引物R12,特異性擴(kuò)增1159T位 點(diǎn)、1160A位點(diǎn)、1225T位點(diǎn)的上游引物F13和下游引物R13,特異性擴(kuò)增1311T位點(diǎn)、1339A 位點(diǎn)、1340T位點(diǎn)、1360T位點(diǎn)、1381A位點(diǎn)、138H位點(diǎn)、1414C位點(diǎn)的上游引物F14和下游 引物R14,特異性擴(kuò)增ACTBP位點(diǎn)的上游引物F15和下游引物R15,通用上游引物F16和下 游引物R16,特異性識(shí)別196A位點(diǎn)的探針P7,特異性識(shí)別202A位點(diǎn)的探針P8,特異性識(shí)別 274T位點(diǎn)的探針P9,特異性識(shí)別383C位點(diǎn)的探針P10,特異性識(shí)別406T位點(diǎn)的探針PI 1，特 異性識(shí)別442A位點(diǎn)的探針P12,特異性識(shí)別473A位點(diǎn)的探針P13,特異性識(shí)別487A位點(diǎn)的 探針P14,特異性識(shí)別493G位點(diǎn)的探針P15,特異性識(shí)別517C位點(diǎn)的探針P16,特異性識(shí)別 519G位點(diǎn)的探針P17,特異性識(shí)別563T位點(diǎn)的探針P18,特異性識(shí)別592T位點(diǎn)的探針P19， 特異性識(shí)別691C位點(diǎn)的探針P20,特異性識(shí)別703T位點(diǎn)的探針P21，特異性識(shí)別835A位點(diǎn) 的探針P22,特異性識(shí)別835C位點(diǎn)的探針P23,特異性識(shí)別1004T位點(diǎn)的探針P24,特異性 識(shí)別1159T位點(diǎn)的探針P25,特異性識(shí)別1160A位點(diǎn)的探針P26,特異性識(shí)別1225T位點(diǎn)的 探針P27,特異性識(shí)別1311T位點(diǎn)的探針P28,特異性識(shí)別1339A位點(diǎn)的探針P29,特異性識(shí) 另lj 1340T位點(diǎn)的探針P30,特異性識(shí)別1360T位點(diǎn)的探針P31，特異性識(shí)別1381A位點(diǎn)的探 針P32,特異性識(shí)別1387T位點(diǎn)的探針P33,以及特異性識(shí)別1414C位點(diǎn)的探針P34。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)G6H)缺乏癥基因突變的試劑盒，其特征在于，所述 PCR反應(yīng)液I、PCR反應(yīng)液II和PCR反應(yīng)液III分別包括特異性擴(kuò)增ACTBP位點(diǎn)的上游引物 F15和下游引物R15,以及特異性識(shí)別ACTBP位點(diǎn)的探針P35。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)G6H)缺乏癥基因突變的試劑盒，其特征在于，所 述PCR反應(yīng)液I、PCR反應(yīng)液II和PCR反應(yīng)液III分別包括10XPCR buffer、5XProbe qPCR buffer、dNTPs 和 Hotstart taq 酶。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)G6H)缺乏癥基因突變的試劑盒，其特征在于，還包 括陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，所述陽(yáng)性質(zhì)控品包括871G>A突變、1004C>A突變和1376G>T突 變標(biāo)準(zhǔn)品，所述陰性質(zhì)控品為無(wú)菌水。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104450925SQ201410784741
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月16日
【發(fā)明者】劉晶晶, 李印淑, 向筑 申請(qǐng)人:亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司