一種阻斷hiv-1感染的ccr5δ32慢病毒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種阻斷HIV-1感染的CCR5?32慢病毒及其制備方法，CR5?32慢病毒具有SEQ ID NO.6所示的基因序列，CR5?32慢病毒的制備方法包括2對引物和一個連接引物的設計、32堿基缺失的CCR5基因片段（CCR5?32）的構建以及穿梭質粒pMXs-Puro的重組等；所述CCR5?32慢病毒具有同時阻斷R5和X4嗜性的HIV-1感染的作用。
【專利說明】—種阻斷HIV-1感染的CCR5 Δ32慢病毒及其制備方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于艾滋病防治領域，涉及一種阻斷Hiv-1感染的CCR5 Δ 32慢病毒，用于阻斷以CCR5和CXCR4為輔助受體的HIV-1對靶細胞的感染。

【背景技術】
[0002]趨化因子受體5 (CCR5)是CC亞家族趨化因子MIP-1和RANTES的特異性受體。CCR5屬G蛋白偶聯(lián)受體家族，有7個跨膜區(qū)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)CCR5能輔助HIV-1感染靶細胞，因此，自其被發(fā)現(xiàn)后一直是人們關注的熱點。HIV-1感染宿主靶細胞的過程的起始階段是由病毒囊膜上的糖蛋白gpl20和宿主細胞上的受體⑶4與趨化因子受體如CCR5、CXCR4結合而引起。這個三分子復合物之間的相互作用使gpl20-gp41復合物的構型發(fā)生變化，促使病毒與宿主細胞膜發(fā)生融合。大部分HIV-1的傳播是以CCR5作為輔助受體的，這部分HIV-1毒株被稱為R5嗜性。但也有一部分HIV-1是以CXCR4為輔助受體，稱為X4嗜性。
[0003]鑒于CCR5在HIV-1感染中的重要作用，該分子成為阻斷HIV-1感染的重要靶點。目前，已有針對CCR5的小分子阻斷劑(maraviroc)上市，但是該拮抗劑僅能阻斷以CCR5為輔助受體的HIV-1感染，對于CXCR4嗜性的HIV-1則無效。另外，其它以CCR5為靶點的治療方法或策略均基于敲除CCR5的基因治療手段，利用包括RNA1、鋅指蛋白沒技術、TALEN技術、CRISPR技術等基因操作技術敲除外周血T淋巴細胞或造血干細胞上的CCR5基因，以達到阻斷HIV-1感染的目的。但上述治療藥物或方法均是針對R5嗜性的HIV-1，對于X4嗜性的無效。
[0004]CCR5基因突變可以對HIV-1的感染產(chǎn)生抵抗或阻斷。人們發(fā)現(xiàn)高加索人中有一種CCR5的突變型等位基因的發(fā)生率很高(約9.2%)，使該基因型人群受HIV-1感染的機率下降。突變主要是由CCR5基因的外顯子區(qū)缺失了 32對堿基(CCR5A32)造成。小部分高加索人是CCR5 Δ 32 / CCR5 Δ 32純合子基因型，而大部分則是CCR5 / CCR5 Δ 32雜合子基因型。調查結果顯示，HIV-1感染的高加索人中沒有發(fā)現(xiàn)CCR5 Δ 32突變的純合子基因型，而雜合子基因型的人群感染率也比普通人群低35%左右。雜合子基因型能使HIV-1感染者的AIDS疾病進程減慢，發(fā)病期延遲2?4年以上。另外，值得一提的是，與野生型相比，CCR5 / CCR5A 32雜合子基因型個體的外周血淋巴細胞中的HIV-1復制水平顯著降低。這可能是因為，CCR5翻譯后轉移到細胞膜前，需在內質網(wǎng)中經(jīng)過磷酸化修飾和多聚化翻譯才能成為成熟CCR5。而CCR5A32由于基因的編碼區(qū)缺失了 32對堿基，造成了讀框錯誤，產(chǎn)生一個無功能的受體，這種受體不能進行磷酸化修飾，不支持胞膜融合。而且，CCR5A32和CCR5可以在內質網(wǎng)中形成異二聚體，使CCR5復合物滯留在內質網(wǎng)，減少在細胞膜表面的表達，從而抵御HIV-1的感染或減少感染的機會。
[0005]但是令人奇怪的是，CCR5 Δ 32純合子和雜合子基因型的高加索人對R5和X4嗜性的HIV-1的感染均有抵抗性。著名的“柏林病人”因移植了 CCR5A32純合子基因型供體的骨髓而治愈了艾滋病，該病人體內不僅檢測不到R5嗜性的HIV-1，X4嗜性的病毒也檢測不到。以上結果說明，CCR5 Δ 32基因型編碼的結構缺失型CCR5蛋白，不僅能夠阻斷R5嗜性的HIV-1，還能夠阻斷X4嗜性的HIV-1。其機制為:CCR5A32也可以和CXCR54內質網(wǎng)中形成異二聚體，使CXCR4復合物滯留在內質網(wǎng)，減少在細胞膜表面的表達，從而抵御X4嗜性HIV-1的感染。因此，CCR5 Δ 32基因編碼的蛋白(暫稱之為CCR5 Δ 32蛋白)是一種可以抵抗R5和X4嗜性的HIV-1感染的蛋白。但是，由于CCR5 Δ 32基因型在普通人群中十分罕見，我國盡在維吾爾族人群中發(fā)現(xiàn)了少數(shù)幾例，漢族人群不攜帶此變異基因型。因此，如何使野生型個體產(chǎn)生對R5和X4嗜性的HIV-1感染產(chǎn)生阻斷和抵抗有待研究。本發(fā)明構建了一種使野生型⑶4+T細胞產(chǎn)生CCR5 Δ 32蛋白，從而阻斷HIV-1 (包括R5嗜性和X4嗜性)感染的CCR5 Δ 32慢病毒。


【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種阻斷HIV-1 (包括R5嗜性和X4嗜性)感染的CCR5 Δ 32慢病毒以及該慢病毒的制備方法，該病毒可以進一步用于造血干細胞的改造，為臨床治療艾滋病提供一種新的思路。
[0007]本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn):一種阻斷HIV-1 (包括R5嗜性和X4嗜性)感染的CCR5 Δ 32慢病毒，所述CCR5 Δ 32慢病毒的基因序列如SEQ ID N0.6所示。
[0008]所述CCR5 Δ 32慢病毒的制備方法包括以下步驟:
(1)分別設計CCR5cDNA序列的上下游引物P1、P2，CCR5 Δ 32基因型缺失的32個堿基對兩側的引物P3、P4，和連接引物P5 ;P1、P2、P3、P4、P5的序列如SEQ ID N0.1-SEQ IDN0.5所示；
(2)利用PCR的方法，分別用P1、P3擴增CCR5Δ 32基因型缺失的32個堿基對位點5’側和3’側的序列，得到第一 PCR產(chǎn)物，分別用P2、P4擴增CCR5 Δ 32基因型缺失的32個堿基對位點5’側和3’側的序列，得到第二 PCR產(chǎn)物；然后以P5作為連接引物，PU P2作為上、下游引物，擴增第一 PCR產(chǎn)物和第二 PCR產(chǎn)物，得到第三PCR產(chǎn)物(B卩32個堿基缺失的CCR5基因片段CCR5 Δ 32);第一 PCR產(chǎn)物、第二 PCR產(chǎn)物、第三PCR產(chǎn)物的堿基序列如SEQID N0.7-SEQ ID N0.9 所示；
(3)將第三PCR產(chǎn)物回收，用PacI和Xho I內切酶酶切，連接到慢病毒表達載體穿梭質粒pMXs-Puro上，得到重組的穿梭質粒，重組的穿梭質粒的基因序列如SEQ ID N0.10所示；
(4)用脂質體轉染法將重組的穿梭質粒轉染到慢病毒包裝細胞Platinum-GP細胞內，48小時后包裝出CCR5 Δ 32慢病毒表達載體，收集含有病毒的培養(yǎng)上清，經(jīng)濃縮、純化后得到CCR5 Δ 32慢病毒。
[0009]本發(fā)明通過模擬罕見的CCR5A 32基因攜帶者對HIV-1感染的抵抗，在體外構建CCR5 Δ 32缺失型基因，并進一步包裝成CCR5 Δ 32慢病毒表達載體，感染HIV-1的靶細胞，使其具有阻斷HIV-1感染的能力。與現(xiàn)有的針對CCR5的治療和阻斷HIV-1感染的方法相t匕，該病毒具有同時阻斷R5和X4嗜性的HIV-1感染的功能。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1.CCR5 Δ 32基因片段序列擴增策略。先用兩對引物分別擴增32個堿基兩側的片段，再用連接引物和CCR5上下游引物連接和擴增兩個片段。
[0011]圖2.pMXs-Puro穿梭質粒圖譜。
[0012]圖3.CCR5 Δ 32慢病毒表達載體感染的Jurkat細胞表面CCR5和CXCR4表達的流式細胞術檢測。圖中每幅流式細胞術檢測圖中上面的數(shù)字表示陽性細胞的百分比，下面的數(shù)字表示平均熒光強度。
[0013]圖4.CCR5 Δ 32和Maraviroc對R5嗜性的HIV-1感染的阻斷作用。A:對HIV-1感染的阻斷效果，通過檢測細胞培養(yǎng)上清中的HIV-1 p24蛋白濃度來比較，**表示與對照組相比，P<0.01 ;B:流式細胞術檢測結果，圖中上面的數(shù)字表示陽性細胞的百分比，下面的數(shù)字表示平均熒光強度。
[0014]圖5.CCR5 Δ 32和Maraviroc對X4嗜性的HIV-1感染的阻斷作用。#表示與對照組相比，P〈0.01。

【具體實施方式】
[0015]實施例1.制備CCR5 Δ 32慢病毒，包括以下步驟:
步驟1.根據(jù)CCR5 Δ 32基因型個體中缺失的32個堿基對的位置和序列，分別設計缺失的32個堿基對兩側引物及CCR5 cDNA序列的相關上下游引物。
[0016]設計CCR5 cDNA序列上下游引物如下:
Pl (SEQ ID N0.l):5’-CCTTAATTAAGGTGGAACAAGATGGATTAT-3’(含有 Pac I 酶切位點) P2 (SEQ ID N0.2):5’-CCGCTCGAGCGGATGTGCACAACTCTGACTG-3’ (含有 Xho I 酶切位點)；
設計缺失的32個堿基對兩側引物如下:
P3 (SEQ ID N0.3): 5’-TGTATGGAAAATGAGAGCTGCAGGTG-3’，
P4 (SEQ ID N0.4): 5’ -TTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTGGTCC-3’ ；
設計缺失的32個堿基兩側序列的連接引物如下:
P5 (SEQ ID N0.5):
5’ - GCCCCAAGATGACTATCTTTAATGTATGGAAAATGAGAGC-3’。
[0017]步驟2.利用PCR的方法，分別用P1、P3擴增CCR5 Δ 32基因型缺失的32個堿基對位點5’側和3’側的序列，得到第一 PCR產(chǎn)物，分別用P2、P4擴增CCR5 Δ 32基因型缺失的32個堿基對位點5’側和3’側的序列，得到第二 PCR產(chǎn)物；然后以P5作為連接引物，P1、P2作為上、下游引物，擴增第一 PCR產(chǎn)物和第二 PCR產(chǎn)物，得到第三PCR產(chǎn)物(B卩32個堿基缺失的CCR5基因片段CCR5 Δ 32);第一 PCR產(chǎn)物、第二 PCR產(chǎn)物、第三PCR產(chǎn)物的堿基序列如 SEQ ID N0.7-SEQ ID N0.9 所示；如圖1 所示。
[0018]步驟3.第三PCR產(chǎn)物純化使用過柱離心的方法，操作步驟和方法按著產(chǎn)品說明書進行。使用Pac I和Xho I內切酶對回收純化的PCR產(chǎn)物進行雙酶切，并使用過柱離心的方法純化。
[0019]步驟4.CCR5 Δ 32慢病毒表達載體的構建
(4.1)將慢病毒表達載體包裝試劑盒中的穿梭質粒pMXs-Puro經(jīng)過大腸桿菌DH-5 α擴增后，使用質粒小量抽提試劑盒進行抽提，操作按說明書進行。然后將所得質粒經(jīng)Pac I和Xho I內切酶雙酶切，并使用過柱離心的方法純化。質粒酶切產(chǎn)物與PCR酶切產(chǎn)物用Τ4連接酶連接，得到重組質粒。重組質粒進一步轉化DH-5 α感受態(tài)細胞后,挑選克隆,大量擴增。經(jīng)雙酶切和測序鑒定正確重組,得到重組的穿梭質粒。所述穿梭質粒pMXs-Puro的圖譜如圖2所示，購于美國Cell B1labs公司，重組的穿梭質粒的基因序列如SEQ ID N0.10所示。
[0020](4.2)慢病毒的包裝
轉染前一天將大約2 X 16慢病毒包裝細胞Platinum-GP細胞接種于6cm培養(yǎng)皿中，使用無抗生素DMEM培養(yǎng)基。是用脂質體轉染試劑將穿梭質粒轉染到Platinum-GP細胞，48小時后即可包裝出CCR5A32慢病毒表達載體。收集含有病毒的培養(yǎng)上清，使用慢病毒濃縮、純化試劑盒處理病毒培養(yǎng)上清液，檢測病毒的基因序列如SEQ ID N0.6所示。
[0021]實施例2.將實施例1制備的CCR5 Δ 32慢病毒感染靶細胞。
[0022]培養(yǎng)CD4+T淋巴細胞系Jurkat細胞，該細胞同時表達CCR5和CXCR4分子，是HIV-1的靶細胞。將濃縮、純化的CCR5 Δ 32慢病毒表達載體感染Jurkat細胞，48小時后用含有嘌呤霉素(2ug/ml)的1640培養(yǎng)基進行篩選,每3天換液一次，10-14天后篩選出的活細胞。
[0023](I)將篩選出的活細胞在胞漿內穩(wěn)定表達CCR5A32蛋白，以檢測CCR5A32慢病毒表達載體對Jurkat細胞表面CCR5和CXCR4表達的影響。由于CCR5 Δ 32蛋白可以與CCR5和CXCR4分子在胞漿內形成異二聚體，將這些HIV-1輔助受體滯留在細胞內，阻止其跨膜表達。
[0024]我們用流式細胞術檢測了感染CCR5 Δ 32慢病毒表達載體的Jurkat細胞表面CCR5和CXCR4分子的表達，結果顯示，與對照細胞相比，感染CCR5 Δ 32慢病毒表達載體的Jurkat細胞表面的CCR5和CXCR4分子表達量將顯著下降，見圖3。說明10-14天后篩選出的活細胞具有HIV-1感染的抵抗能力。
[0025](2)將篩選出的活細胞用R5嗜性的HIV-1-GFP病毒感染，感染48小時后檢測細胞培養(yǎng)上清中的P24蛋白含量，并用流式細胞術檢測細胞內病毒含量，病毒含量越高表示感染率越高。用X4嗜性的HIV-1 PNL4-3假病毒(含熒光素酶報告基因)感染，48小時后檢測Jurkat細胞的熒光素酶活性，活性越高表示病毒數(shù)量越多，感染率越高。如圖4、圖5所示，感染CCR5 Δ 32慢病毒表達載體的Jurkat細胞R5嗜性的HIV-1-GFP和X4嗜性的HIV-1PNL4-3假病毒感染率顯著下降。
[0026]進一步將CCR5 Δ 32慢病毒表達載體與CCR5拮抗劑Maraviroc的阻斷效果進行了比較，結果顯示，兩者對R5嗜性的HIV-1-GFP均有顯著的阻斷效果，但對于X4嗜性的HIV-1PNL4-3假病毒Maraviroc沒有阻斷效果(見圖4、圖5)。
[0027]上述實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行限制，在本發(fā)明的精神和權利要求的保護范圍內，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種阻斷Hiv-1感染的CCR5 Δ 32慢病毒，其特征在于，所述CR5 Δ 32慢病毒的基因序列如SEQ ID N0.6所示。
2.—種權利要求1所述的CR5 Δ 32慢病毒的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)分別設計CCR5cDNA序列的上下游引物P1、P2，CCR5 Δ 32基因型缺失的32個堿基對兩側的引物P3、P4，和連接引物P5 ;P1、P2、P3、P4、P5的序列如SEQ ID N0.1-SEQ IDN0.5所示； (2)利用PCR的方法，分別用P1、P3擴增CCR5Δ 32基因型缺失的32個堿基對位點5’側和3’側的序列，得到第一 PCR產(chǎn)物，分別用P2、P4擴增CCR5 Δ 32基因型缺失的32個堿基對位點5’側和3’側的序列，得到第二 PCR產(chǎn)物；然后以P5作為連接引物，PU P2作為上、下游引物，擴增第一 PCR產(chǎn)物和第二 PCR產(chǎn)物，得到第三PCR產(chǎn)物(B卩32個堿基缺失的CCR5基因片段CCR5 Δ 32);第一 PCR產(chǎn)物、第二 PCR產(chǎn)物、第三PCR產(chǎn)物的堿基序列如SEQID N0.7-SEQ ID N0.9 所示； (3)將第三PCR產(chǎn)物回收，用PacI和Xho I內切酶酶切，連接到慢病毒表達載體穿梭質粒pMXs-Puro上，得到重組的穿梭質粒，重組的穿梭質粒的基因序列如SEQ ID N0.10所示； (4)用脂質體轉染法將重組的穿梭質粒轉染到慢病毒包裝細胞Platinum-GP細胞內，48小時后包裝出CCR5 Δ 32慢病毒表達載體，收集含有病毒的培養(yǎng)上清，經(jīng)濃縮、純化后得到CCR5 Δ 32慢病毒。
【文檔編號】C12N7/00GK104498444SQ201410747124
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權日:2014年12月10日
【發(fā)明者】靳昌忠, 吳南屏, 程林芳 申請人:浙江大學