一種一次準(zhǔn)確定量烷烴羥化酶基因alkB的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種一次準(zhǔn)確定量烷烴羥化酶基因alkB的方法及其應(yīng)用。環(huán)境檢測(cè)過(guò)程中因烷烴羥化酶基因alkB編碼的基因多樣性較高，難以一次準(zhǔn)確定量。本方法首先用通用序列接頭的特異引物對(duì)目的基因進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，使目的基因的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物帶有這段通用序列；然后用通用序列作引物實(shí)現(xiàn)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的定量分析。本方法成功解決了普通多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中由引物擴(kuò)增效率差異、非特異性擴(kuò)增、引物二聚體等引起的定量結(jié)果準(zhǔn)確性和可比性差的問(wèn)題，可通過(guò)一步PCR反應(yīng)準(zhǔn)確地對(duì)PCR體系中多個(gè)目的基因的總量進(jìn)行一次性定量。本方法操作簡(jiǎn)便快速，特異性高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢測(cè)靈敏度高，最低檢測(cè)濃度為1×102拷貝/ml。
【專利說(shuō)明】一種一次準(zhǔn)確定量烷烴羥化酶基因aIkB的方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生態(tài)技術(shù)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)，它涉及一種基于通用序列 的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，及其在烷烴羥化酶基因alkB定量檢測(cè)中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 油藏和石油污染環(huán)境中存在著大量的烴降解菌株，它們能以石油烴為碳源生長(zhǎng)代 謝并產(chǎn)生生物表面活性物質(zhì)，從而達(dá)到提高石油采收率或清除環(huán)境中的石油污染物。目前 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約有100多個(gè)屬的微生物能夠直接或輔助降解一種或多種石油烴，這類微生物主 要有：Pseudomonas, Acinetobacter, Achromobacter, Nocardia, Bacillus, Micrococcus, A ctinomycet, Aureobasidium, Candida, Rhodotorula 及 PeniciIlium 等。現(xiàn)有石開(kāi)究結(jié)果表 明：烷烴是一種高度還原性物質(zhì)，微生物對(duì)石油烴類的降解主要通過(guò)好氧途徑完成，其降解 的第一步是在烷烴分子中加入氧使其氧化為醇或酮，再進(jìn)一步氧化為脂肪酸進(jìn)入3 -氧 化途徑進(jìn)行氧化分解。在石油烴的生物降解過(guò)程中，這種氧化反應(yīng)是由一類烷烴羥化酶催 化完成的。因此，準(zhǔn)確定量環(huán)境中烷烴羥化酶基因（alkB)的數(shù)量對(duì)于分析原位烴氧化菌 (hydrocarbon oxidizing bacteria, H0B)的豐度和石油經(jīng)的降解潛力具有重要意義。然 而，長(zhǎng)期的自然進(jìn)化過(guò)程使編碼烷烴羥化酶的基因表現(xiàn)出了豐富的多樣性，即：雖然alkB 基因的編碼產(chǎn)物都是烷烴羥化酶，但它們的堿基序列甚至氨基酸序列卻存在較大的差異， 這些酶屬于同工酶家族。2013年6月8日之前，Genbank中公布的alkB基因序列已經(jīng)超過(guò) 1100條，其同源性在43%?94%之間。這就給利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qPCR技術(shù)）準(zhǔn) 確定量alkB基因提出了巨大的挑戰(zhàn)。主要原因在于：實(shí)時(shí)熒光定量PCR除了在PCR過(guò)程中 需要實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度之外，與普通PCR的原理是相同的。也就是說(shuō)普通PCR的缺點(diǎn) 在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中也難以避免。例如引物二聚體的形成和非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生，這些 在以SYBR Green I等熒光染料為檢測(cè)介質(zhì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR中會(huì)對(duì)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性 產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。因此，qPCR也必須遵循普通PCR所要遵循的規(guī)則，甚至要更嚴(yán)格地遵循。 在普通PCR過(guò)程中，引物的特異性是有效擴(kuò)增目的基因，減少非特異性擴(kuò)增的關(guān)鍵，這就使 多樣性指數(shù)非常高的alkB基因的qPCR定量結(jié)果與實(shí)際偏差較大。為了克服這種困難，最 容易實(shí)現(xiàn)的策略是在PCR體系中加入多對(duì)特異性引物進(jìn)行定量分析，即利用多重引物qPCR 技術(shù)對(duì)alkB基因進(jìn)行定量。多重引物PCR技術(shù)是在普通PCR基礎(chǔ)上，利用體系中含有的多 對(duì)特異引物，同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)目的基因的擴(kuò)增，廣泛用于多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)，以及某 些遺傳病及癌基因的分型鑒定。然而，將多重引物直接用于qPCR分析還有許多困難，PCR體 系中的多對(duì)引物會(huì)使引物二聚體、非特異性擴(kuò)增等干擾定量準(zhǔn)確性的問(wèn)題更為突出；此外， 不同引物間擴(kuò)增效率的差異以及相互抑制也會(huì)影響到定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是解決普通多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中由引物擴(kuò)增效率差異、非 特異性擴(kuò)增、引物二聚體等因素引起的定量結(jié)果準(zhǔn)確性和可比性差的問(wèn)題，提供一種一次 準(zhǔn)確定量烷烴羥化酶基因alkB的方法及其應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明提供的一種一次準(zhǔn)確定量烷烴羥化酶基因alkB的方法，是基于通用序列 的多重引物實(shí)時(shí)突光定量PCR(universalprimermutiplexqPCR，以下簡(jiǎn)稱UPMQ)方法，該 方法首先用15對(duì)帶有通用序列接頭的特異引物對(duì)目的基因進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，使目的基因的預(yù) 擴(kuò)增產(chǎn)物均帶有這段通用序列；然后用通用序列作引物實(shí)現(xiàn)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的定量分析。
[0005] 該方法采用如下步驟進(jìn)行：
[0006] (1)選用兩條引物序列UP-15，-TAGGGGTGACTACCCACGGGT-3，， UP-25' -TGATAGGGAAGGCCCTGACGG-3'作為多重引物實(shí)時(shí)熒光定量PCR中特異引物前的通 用序列；
[0007] (2)選用15組針對(duì)alkB基因第二個(gè)和第四個(gè)組氨酸保守區(qū)對(duì)應(yīng)的核酸序列設(shè)計(jì) 引物，其中上游混合引物由M-1F至M-15F等比例混合而成：

【權(quán)利要求】
1. 一種一次準(zhǔn)確定量烷烴羥化酶基因alkB的方法，其特征在于采用如下步驟進(jìn)行： (1) 選用兩條引物序列UP-I5 ' -TAGGGGTGACTACCCACGGGT-3 '，UP-2 5' -TGATAGGGAAGGCCCTGACGG-3'作為多重引物實(shí)時(shí)熒光定量PCR中特異引物前的通用序 列； (2) 選用15組針對(duì)alkB基因第二個(gè)和第四個(gè)組氨酸保守區(qū)對(duì)應(yīng)的核酸序列設(shè)計(jì)引物， 其中上游混合引物由M-IF至M-15F等比例混合而成： +游混^引物由下列引物M-IR至M-15R
以等比例混合而成: '

(3) 樣品的采集和預(yù)處理； (4) 環(huán)境樣品核酸的提取； (5) 陽(yáng)性和陰性質(zhì)控品的制備； (6) 烷烴羥化酶基因alkB標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及靈敏度實(shí)驗(yàn)； 將濃度為l〇7copies/yL的陽(yáng)性質(zhì)控品，依次稀釋為L(zhǎng)OXlO6U.OXlO5U. 0X104、 1. 0X103、1. 0X102、1. 0XIO1和1. 0X10 °，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行，并且設(shè)置無(wú)模板對(duì)照，利 用上述步驟（2)的引物體系為模板進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增的PCR體系為：

預(yù)擴(kuò)增條件為：
利用預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析； 擴(kuò)增的PCR體系為：
:丨 3 :丨 :::丨 3 擴(kuò)增條件為：
擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，計(jì)算各濃度樣品所對(duì)應(yīng)的Ct值，并以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制烷烴羥化酶基因alkB標(biāo)準(zhǔn)曲線； (7) 用步驟（2)的15對(duì)5'端含有通用序列接頭的特異引物對(duì)環(huán)境基因組中的烷烴羥 化酶基因alkB進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，進(jìn)一步利用預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析；PCR體系 和擴(kuò)增條件同步驟（6); (8) 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值及標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程式計(jì)算出烷烴羥化 酶基因alkB的量。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟⑴所述的兩個(gè)通用序列，是利用大腸桿 菌的終止密碼子和稀有密碼子組合設(shè)計(jì)的一對(duì)用作定量引物的DNA序列，在利用該序列作 引物進(jìn)行正常的PCR擴(kuò)增時(shí)，以環(huán)境基因組為模板不能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2)所述的帶有通用序列接頭的特異 弓丨物，首先從GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.ncbi.nlm.nih.ROV和功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)http:// funRene.cme.msu.edu/index.spr下載已報(bào)道的2000組目的基因序列，然后用Mothur軟 件找出重復(fù)序列，用ClustalXl. 81進(jìn)行序列比對(duì)，然后用MEGA4軟件中P-distance模型和 Neighbor-joining算法進(jìn)行各序列間的同源性和進(jìn)化距離的分析與比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育 樹(shù)，接著在核酸水平上對(duì)目的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，針對(duì)第二個(gè)和第四個(gè)組氨酸保守區(qū) 對(duì)應(yīng)的核酸序列設(shè)計(jì)引物，按照系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)將進(jìn)化距離小于0. 12的序列分為一組，共得到 15組，最后用ClustalX軟件進(jìn)行組內(nèi)序列比對(duì)，用Oligo軟件設(shè)計(jì)出15對(duì)5'端含有通用 序列接頭的特異引物，其中上游引物含有UP-I序列，下游引物含有UP-2序列。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法是基于通用序列的多重引物實(shí)時(shí)熒光 定量PCR方法，每對(duì)特異引物的5'端加入一種或兩種相同堿基的通用序列，這種相同堿基 的通用序列可以作為多重引物實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量引物，在進(jìn)行PCR時(shí)先通過(guò)15對(duì)5' 端含有通用序列接頭的特異引物預(yù)擴(kuò)增3?8輪，然后通過(guò)定量引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量 分析，能夠?qū)ν搓P(guān)系較遠(yuǎn)的烷烴羥化酶基因alkB同時(shí)進(jìn)行定量。
5. -種權(quán)利要求1所述方法的應(yīng)用，用于對(duì)環(huán)境中烷烴羥化酶基因alkB的定量分析和 檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)便快速、特異性高、檢測(cè)靈敏度高的特點(diǎn)，基因的最低檢測(cè)濃度為IXlO2 拷貝/ml。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104450889SQ201410648293
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】馬挺, 李國(guó)強(qiáng), 高夢(mèng)黎, 田會(huì)梅, 高配科, 陳兆會(huì) 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)