一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒包括由外引物Ⅰ、外引物Ⅱ、內(nèi)引物Ⅰ和內(nèi)引物Ⅱ配制而成的檢測(cè)引物溶液；具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶；10×反應(yīng)緩沖液；dNTPs溶液；陽(yáng)性DNA對(duì)照樣品；陰性DNA對(duì)照樣品。同時(shí)本發(fā)明還公開(kāi)了該試劑盒的檢測(cè)方法。本發(fā)明具有高特異性，且具有快速高效、操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本低的特點(diǎn)，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)試劑盒，尤其涉及一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]地溝油是一種衛(wèi)生極差，過(guò)氧化值、酸價(jià)、水分、羰基價(jià)、丙二醛、黃曲霉毒素等嚴(yán)重超標(biāo)的非食用油。產(chǎn)生途徑主要有以下幾種:一是由下水道的一些油膩漂浮物，還有餐廚廢棄油中的一些油膩物質(zhì)，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的加工提煉而來(lái)；還有一種是從動(dòng)物內(nèi)臟等組織提煉出來(lái)的油脂；其三就是經(jīng)過(guò)反復(fù)油炸的油脂。地溝油中如黃曲霉素、苯并(a)芘、反式脂肪酸等各種有毒物質(zhì)，長(zhǎng)期食用對(duì)人體傷害很大，嚴(yán)重威脅這人類的健康。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)有關(guān)地溝油的報(bào)道以及地溝油引起的食品安全問(wèn)題引起了人們的高度關(guān)注。
[0003]國(guó)外對(duì)地溝油檢測(cè)方法報(bào)道較少，但由于制訂一系列法規(guī)，使地溝油很難再進(jìn)入食用油市場(chǎng)，研究主要關(guān)注廢棄油脂綜合利用及食用油摻偽和種類區(qū)分。
[0004]近年來(lái)，各種地溝油的檢測(cè)方法層出不群，2011年12月，衛(wèi)生部向社會(huì)廣泛公開(kāi)征集“地溝油”檢測(cè)方法，共收到762份關(guān)于檢驗(yàn)方法或檢驗(yàn)指標(biāo)的建議。其中，有281個(gè)單位和個(gè)人提交了 315項(xiàng)“地溝油”檢測(cè)方法，組建了包括油脂加工、食品安全、衛(wèi)生檢驗(yàn)、化學(xué)分析等領(lǐng)域權(quán)威專家和相關(guān)機(jī)構(gòu)在內(nèi)的檢驗(yàn)方法論證專家組，通過(guò)盲樣測(cè)試等方式對(duì)征集到的方法進(jìn)行了科學(xué)論證，發(fā)現(xiàn)這些方法特異性都不強(qiáng)。
[0005]朱旭平等通過(guò)對(duì)樣品油所含的外源動(dòng)物基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)的方法對(duì)地溝油進(jìn)行了檢測(cè)。其原理為:地溝油主要是由各種潲水、用于油炸食品中的油、劣質(zhì)動(dòng)物肉、內(nèi)臟、毛皮等加工及提煉后產(chǎn)出的油煉制而成，這些原料在煎炸烹飪和回收過(guò)程中往往會(huì)含有一些動(dòng)物性原料，因此含有其相應(yīng)的核酸成分，如豬、牛和魚類等哺乳動(dòng)物的特征基因殘留。目前市面上的合格食用油多為植物油，不存在動(dòng)物性基因成分。因此，通過(guò)判斷樣品油中是否含有動(dòng)物性基因成分，就可以推斷該樣品油是否為地溝油，或者樣品油中是否混有地溝油。該檢測(cè)方法在部分樣品的檢測(cè)中取得較好的效果，但地溝油的來(lái)源多樣、加工工藝不同，有的地溝油經(jīng)過(guò)高溫、粉碎、攪拌等生產(chǎn)處理，細(xì)胞核基因組往往被破壞，因此，該方法采用細(xì)胞核基因組基因作為檢測(cè)的對(duì)象，檢測(cè)的特異性不強(qiáng)，無(wú)法達(dá)到地溝油有效鑒定的預(yù)期目的。
[0006]專利(201110456243.2)以樣品油中不應(yīng)存在的動(dòng)物外源成分作為地溝油的鑒別依據(jù)，以動(dòng)物外源成分的線粒體特征DNA為檢測(cè)的具體靶標(biāo)，建立了基于此原理的熒光定量PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)線粒體DNA地溝油的方法。但該方法操作繁瑣、需要專門的特殊儀器，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
[0007]LAMP技術(shù)是由日本榮研化學(xué)株式會(huì)社在2000年開(kāi)發(fā)的一種新的基因擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)的基本特點(diǎn)是:①恒溫?cái)U(kuò)增:整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)在恒溫條件(6(T65°C)進(jìn)行，不需要特殊儀器設(shè)備；②快速高效:整個(gè)擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)可在Ih內(nèi)完成；③高特異性:針對(duì)靶標(biāo)序列6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條檢測(cè)引物，擴(kuò)增特異性高；④高靈敏度:檢測(cè)極限可低至10個(gè)拷貝或更低；⑤鑒定簡(jiǎn)便:擴(kuò)增產(chǎn)物有多種鑒定方法，如肉眼觀察或利用濁度儀觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化、加入染料觀察顏色變化等。
[0008]LAMP方法具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)、不需要特殊儀器，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，在轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前尚未有利用LAMP方法檢測(cè)動(dòng)物線粒體特征DNA序列、引物組，構(gòu)建地溝油的檢測(cè)試劑盒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速、高效的用于地溝油檢測(cè)的試劑盒。
[0010]本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是該用于地溝油檢測(cè)的試劑盒的檢測(cè)方法。
[0011]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所述的一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒，包括
一檢測(cè)引物溶液:由濃度為4飛MmoI/L的外引物1、濃度為4飛MmoI/L的外引物I1、濃度為32?48 Mfl1l/L的內(nèi)引物I和濃度為32?48Mfflol/L的內(nèi)引物II配制而成；
一具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶:濃度為7?9U/ μ L ；
—1X 反應(yīng)緩沖液:由 200 mmol/L 且 pH= 8.8 的 Tris-HCl，100 mmol/L KCl, 100mmol/L (NH4) 2S04,40?100 mmol/L MgSO4,6?14 mol/L 甜菜喊混合而成；
—dNTPs溶液:由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
一陽(yáng)性DNA對(duì)照樣品:含有脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，或者食品中常見(jiàn)的豬、牛、羊、雞、鴨和魚的總DNA樣品；
一陰性DNA對(duì)照樣品:不含脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的DNA。
[0012]所述脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1第I位到259位所示。
[0013]所述外引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2第I位到18位所示。
[0014]所述外引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3第I位到18位所示。
[0015]所述內(nèi)引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.4第I位到44位所示。
[0016]所述內(nèi)引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5第I位到46位所示。
[0017]該試劑盒還包括顯色劑1000XSYBR GREEN I熒光染料。
[0018]如上所述的一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
⑴提取待測(cè)樣品DNA:
在2mL離心管I中加入400μ? TE緩沖液，然后加入食用油lmL，漩渦震蕩混勻:T8min，室溫下13000r/min離心5min，去除上層油脂，留下層水相，在所述離心管I中再次加入食用油lmL，顛倒混勻，離心，共重復(fù)5?20次，所得水相即為待測(cè)樣品DNA ；
⑵配制待測(cè)樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系:
在200 μ L PCR反應(yīng)管I內(nèi)加入所述待測(cè)樣品DNA 2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
⑶配制對(duì)照樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系:
在200 uL PCR反應(yīng)管II內(nèi)加入陽(yáng)性DNA對(duì)照樣品2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
在200 μ L PCR反應(yīng)管III內(nèi)加入陰性DNA對(duì)照樣品2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
⑷分別對(duì)所述PCR反應(yīng)管1、PCR反應(yīng)管I1、PCR反應(yīng)管III進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng):6(T65°C孵育2(T60min，8(TC孵育5min終止反應(yīng)；
(5)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定:通過(guò)肉眼觀察或利用濁度儀分別觀察所述PCR反應(yīng)管1、PCR反應(yīng)管I1、PCR反應(yīng)管III內(nèi)沉淀的濁度變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果，或取2飛μ?擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果；
(6)當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，即判定樣品為地溝油；
⑴當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，若所述待測(cè)樣品DNA的濃度偏差小于同等條件下市售標(biāo)準(zhǔn)油脂樣品處理后的濃度的1%時(shí)，則判定樣品為地溝油；
⑶當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，若所述待測(cè)樣品DNA的濃度與同等條件下市售標(biāo)準(zhǔn)油脂樣品處理后的濃度相等時(shí)，則將所述待測(cè)樣品DNA轉(zhuǎn)移至離心管II中；
⑶在所述離心管II中加入100 μ L 20% SDS,混勻后經(jīng)65°C水浴lOmin，期間顛倒數(shù)次；然后在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到上清液I，該上清液I移至離心管III中；
(10)在所述離心管III中加入等體積的Tris和苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻后靜置1min,室溫下13000r/min離心5min,得到上清液II,該上清液II移至離心管IV中；所述苯酚-氯仿-異戊醇混合液是指將苯酚、氯仿、異戊醇按25 mL:24 mL:1 mL的體積比混合而成的溶液；
在所述離心管IV中，按所述上清液II的體積的0.7倍加入異丙醇，顛倒混勻后于_20°C冰箱靜置過(guò)夜沉淀DNA，然后在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到沉淀物；該沉淀物用體積濃度為70%的乙醇洗滌2次，最后，沉淀物自然晾干，并加50μ L TE緩沖液溶解，_20°C保存，即得純化的待測(cè)樣品DNA ；
(11)配制純化的待測(cè)樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系:
在200 uL PCR反應(yīng)管IV內(nèi)加入所述純化的待測(cè)樣品DNA 2飛μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶IyLUOX反應(yīng)緩沖液2.5 μ L、dNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 uL；
(12)分別將所述PCR反應(yīng)管I1、PCR反應(yīng)管II1、PCR反應(yīng)管IV重復(fù)所述步驟⑷?(5)，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，即判定樣品為地溝油；當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，即判定樣品為市售標(biāo)準(zhǔn)油脂。
[0019]如上所述的一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
⑴提取待測(cè)樣品DNA:
在2mL離心管I中加入400μ? TE緩沖液，然后加入食用油lmL，漩渦震蕩混勻:T8min，室溫下13000r/min離心5min，去除上層油脂，留下層水相，在所述離心管I中再次加入食用油lmL，顛倒混勻，離心，共重復(fù)5?20次，所得水相即為待測(cè)樣品DNA ；
⑵配制待測(cè)樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系:
在200 μ L PCR反應(yīng)管I內(nèi)加入所述待測(cè)樣品DNA 2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
⑶配制對(duì)照樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系:
在200 uL PCR反應(yīng)管II內(nèi)加入陽(yáng)性DNA對(duì)照樣品2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
在200 μ L PCR反應(yīng)管III內(nèi)加入陰性DNA對(duì)照樣品2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
⑷分別對(duì)所述PCR反應(yīng)管1、PCR反應(yīng)管I1、PCR反應(yīng)管III進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng):6(T65°C孵育2(T60min，8(TC孵育5min終止反應(yīng)；
(5)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定:在LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入廣2 μ?顯色劑，混勻，通過(guò)肉眼觀察顯色結(jié)果來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果；
(6)當(dāng)出現(xiàn)綠色，則為陽(yáng)性，即判定樣品為地溝油；
(7)當(dāng)出現(xiàn)橙色，則為陰性，若所述待測(cè)樣品DNA的濃度偏差小于同等條件下市售標(biāo)準(zhǔn)油脂樣品處理后的濃度的1%時(shí)，則判定樣品為地溝油；
(8)當(dāng)出現(xiàn)橙色，則為陰性，若所述待測(cè)樣品DNA的濃度與同等條件下市售標(biāo)準(zhǔn)油脂樣品處理后的濃度相等時(shí)，則將所述待測(cè)樣品DNA轉(zhuǎn)移至離心管II中；
⑶在所述離心管II中加入100 μ L 20% SDS,混勻后經(jīng)65°C水浴lOmin，期間顛倒數(shù)次；然后在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到上清液I，該上清液I移至離心管III中；
(10)在所述離心管III中加入等體積的Tris和苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻后靜置1min,室溫下13000r/min離心5min,得到上清液II,該上清液II移至離心管IV中；所述苯酚-氯仿-異戊醇混合液是指將苯酚、氯仿、異戊醇按25 mL:24 mL:1 mL的體積比混合而成的溶液；
在所述離心管IV中，按所述上清液II的體積的0.7倍加入異丙醇，顛倒混勻后于_20°C冰箱靜置過(guò)夜沉淀DNA，然后在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到沉淀物；該沉淀物用體積濃度為70%的乙醇洗滌2次，最后，沉淀物自然晾干，并加50μ L TE緩沖液溶解，_20°C保存，即得純化的待測(cè)樣品DNA ；
(11)配制純化的待測(cè)樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系:
在200 uL PCR反應(yīng)管IV內(nèi)加入所述純化的待測(cè)樣品DNA 2飛μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶IyLUOX反應(yīng)緩沖液2.5 μ L、dNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 uL；
(12)分別將所述PCR反應(yīng)管I1、PCR反應(yīng)管II1、PCR反應(yīng)管IV重復(fù)所述步驟⑷?(5)，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，即判定樣品為地溝油；當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，即判定樣品為市售標(biāo)準(zhǔn)油脂。
[0020]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
1、由于線粒體DNA具有分子量小、拷貝數(shù)多和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等特點(diǎn)，因此，本發(fā)明中的脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列可作為動(dòng)物性外源成分鑒定和物種分類等技術(shù)的理想靶基因。
[0021]2、本發(fā)明中脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列僅存在于脊椎動(dòng)物，而在細(xì)菌、古菌、真菌和綠色植物線粒體中則不存在，因此，作為L(zhǎng)AMP技術(shù)檢測(cè)地溝油識(shí)別、鑒定的依據(jù)，使本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)地溝油的準(zhǔn)確率更高。
[0022]3、本發(fā)明以樣品中不應(yīng)存在的動(dòng)物源性成分作為鑒別依據(jù)，以動(dòng)物線粒體DNA為檢測(cè)靶標(biāo)，試劑盒應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有高特異性，且具有快速高效、操作簡(jiǎn)便，在不到I小時(shí)即可完成檢測(cè)。
[0023]4、本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒只需一個(gè)恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測(cè)成本低，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
[0024]5、本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡(jiǎn)便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物一焦磷酸鎂沉淀，可通過(guò)肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽(yáng)性結(jié)果顯色差異顯著，驗(yàn)證率高，更加明顯可靠。
[0025]6、利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)技術(shù)檢測(cè)地溝油，本發(fā)明試劑盒及檢測(cè)方法具有很好的通用性和特異性。
[0026]⑴測(cè)試樣品:分別含有食品中常見(jiàn)的豬、牛、羊、雞、鴨和魚等動(dòng)物的總DNA樣品的大豆油；市場(chǎng)上常見(jiàn)的大豆油、花生油、玉米油、橄欖油和2種植物調(diào)調(diào)和油；2種模擬地溝油樣品。
[0027]用實(shí)施例廣2中所述試劑盒及檢測(cè)方法進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果顯示所有含有動(dòng)物的總DNA樣品的大豆油(1、2、3、4、5、6)和陽(yáng)性對(duì)照(P)反應(yīng)管顯現(xiàn)出典型擴(kuò)增曲線，肉眼觀察有沉淀產(chǎn)生，表明含有動(dòng)物源性成分，是地溝油；市場(chǎng)上常見(jiàn)的大豆油(7)、花生油(8)、玉米油(9)、橄欖油(10)和3種植物調(diào)和油(11、12、13)和陰性對(duì)照(N)顯現(xiàn)橙色一致，無(wú)典型擴(kuò)增曲線，肉眼觀察無(wú)沉淀產(chǎn)生，表明不含有動(dòng)物源性成分(參見(jiàn)圖1)。
[0028]⑵測(cè)試樣品:分別含有食品中常見(jiàn)的豬、牛、羊、雞、鴨和魚等動(dòng)物的總DNA樣品的大豆油；市場(chǎng)上常見(jiàn)的大豆油、花生油、玉米油、橄欖油和2種植物調(diào)和油；2種模擬地溝油樣品。
[0029]用實(shí)施例3?4中所述試劑盒及檢測(cè)方法進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果顯示所有含有動(dòng)物的總DNA樣品的大豆油和2種模擬地溝油樣品反應(yīng)管顯現(xiàn)綠色，市場(chǎng)上常見(jiàn)的大豆油、花生油、玉米油、橄欖油和2種植物調(diào)和油顯現(xiàn)橙色(參見(jiàn)圖2)。
[0030]5、經(jīng)測(cè)試，本發(fā)明試劑盒及檢測(cè)方法的靈敏度可達(dá)0.01 ng/μ L0
[0031]測(cè)試樣品為含有?？侱NA的大豆油樣品所提DNA樣品依次稀釋而成。樣品中?？?DNA 的濃度分別為:160ng/μ L、80 ng/μ L、40 ng/μ L、20 ng/μ L、1ng/μ L、lng/μ L、0.lng/μ L、0.0lng/μ L、0.0Olng/μ L 和 0.000lng/μ L。
[0032]樣品中牛總DNA 的濃度分別為 160ng/y L(-2)、80 ng/μ L(-3),40 ng/μ L(-4),20 ng/μ L (-5)U0ng/y L (-6)、lng/μ L (-7+),0.lng/ μ L (-8+),0.0lng/μ L (-9+)和陽(yáng)性對(duì)照(P)的測(cè)試反應(yīng)管中均呈現(xiàn)綠色，而0.0Olng/μ L (-10-),0.0OOlng/μ L (-11-)和陰性對(duì)照(N)顯現(xiàn)橙色(參見(jiàn)圖3)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0034]圖1為本發(fā)明LAMP檢測(cè)(無(wú)顯色劑)方法的通用性和特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[0035]圖2為本發(fā)明LAMP檢測(cè)(有顯色劑)方法的通用性和特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[0036]圖3為本發(fā)明LAMP靈敏度檢測(cè)結(jié)果圖。圖中管子上方:N為陰性對(duì)照屮為陽(yáng)性對(duì)照；數(shù)字表示1X梯度稀釋倍數(shù)。

【具體實(shí)施方式】
[0037]實(shí)施例1 一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒，包括
一檢測(cè)引物溶液:由濃度為4飛Mmol/L的外引物1、濃度為4飛Mmol/L的外引物I1、濃度為32?48 Mmol/L的內(nèi)引物I和濃度為32?48Mfflol/L的內(nèi)引物II配制而成；
一具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶:濃度為7?9U/ μ L ；
—1X 反應(yīng)緩沖液:由 200 mmol/L 且 pH= 8.8 的 Tris-HCl，100 mmol/L KCl, 100mmol/L (NH4) 2S04,40?100 mmol/L MgSO4,6?14 mol/L 甜菜喊混合而成；
—dNTPs溶液:由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
一陽(yáng)性DNA對(duì)照樣品:含有脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，或者食品中常見(jiàn)的豬、牛、羊、雞、鴨和魚的總DNA樣品；
一陰性DNA對(duì)照樣品:不含脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的DNA。
[0038]其中:
脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1第I位到259位所示。
[0039]外引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2第I位到18位所示。
[0040]外引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3第I位到18位所示。
[0041]內(nèi)引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.4第I位到44位所示。
[0042]內(nèi)引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5第I位到46位所示。
[0043]實(shí)施例2 —種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
⑴提取待測(cè)樣品DNA:
在2mL離心管I中加入400μ? TE緩沖液，然后加入食用油lmL，漩渦震蕩混勻:T8min，室溫下13000r/min離心5min，去除上層油脂，留下層水相，在離心管I中再次加入食用油lmL，顛倒混勻，離心，共重復(fù)5?20次，所得水相即為待測(cè)樣品DNA ；
⑵配制待測(cè)樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系:
在200 uL PCR反應(yīng)管I內(nèi)加入待測(cè)樣品DNA 2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、BstDNA聚合酶IyLUOX反應(yīng)緩沖液2.5 μ L、dNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μ L ；
⑶配制對(duì)照樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系:
在200 μ L PCR反應(yīng)管II內(nèi)加入陽(yáng)性DNA對(duì)照樣品2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
在200 μ L PCR反應(yīng)管III內(nèi)加入陰性DNA對(duì)照樣品2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
⑷分別對(duì)PCR反應(yīng)管1、PCR反應(yīng)管I1、PCR反應(yīng)管III進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng):6(T65°C孵育2(T60min,80°C孵育5min終止反應(yīng)；
(5)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定:通過(guò)肉眼觀察或利用濁度儀分別觀察PCR反應(yīng)管1、PCR反應(yīng)管I1、PCR反應(yīng)管III內(nèi)沉淀的濁度變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果，或取2飛μ?擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果；
(6)當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，即判定樣品為地溝油；
⑴當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，若待測(cè)樣品DNA的濃度偏差小于同等條件下市售標(biāo)準(zhǔn)油脂樣品處理后的濃度的1%時(shí)，則判定樣品為地溝油；
⑶當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，若待測(cè)樣品DNA的濃度與同等條件下市售標(biāo)準(zhǔn)油脂樣品處理后的濃度相等時(shí)，則將所測(cè)樣品DNA轉(zhuǎn)移至離心管II中；
(9)在離心管II中加入100μ L 20% SDS,混勻后經(jīng)65°C水浴lOmin，期間顛倒數(shù)次；然后在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到上清液I，該上清液I移至離心管III中；
(10)在離心管III中加入等體積的Tris和苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻后靜置lOmin，室溫下13000r/min離心5min,得到上清液II,該上清液II移至離心管IV中；苯酹_氯仿_異戊醇混合液是指將苯酚、氯仿、異戊醇按25 mL:24 mL:1 mL的體積比混合而成的溶液；
在離心管IV中，按上清液II的體積的0.7倍加入異丙醇，顛倒混勻后于_20°C冰箱靜置過(guò)夜沉淀DNA，然后在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到沉淀物；該沉淀物用體積濃度為70%的乙醇洗滌2次，最后，沉淀物自然晾干，并加50 μ L TE緩沖液溶解，-20°C保存，即得純化的待測(cè)樣品DNA ；
(11)配制純化的待測(cè)樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系:
在200 μ L PCR反應(yīng)管IV內(nèi)加入純化的待測(cè)樣品DNA 2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
(12)分別將PCR反應(yīng)管I1、PCR反應(yīng)管II1、PCR反應(yīng)管IV重復(fù)步驟⑷?(5)，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，即判定樣品為地溝油；當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，即判定樣品為市售標(biāo)準(zhǔn)油脂。
[0044]實(shí)施例3 —種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒，包括
一檢測(cè)引物溶液:由濃度為4飛Mmol/L的外引物1、濃度為4飛Mmol/L的外引物I1、濃度為32?48 Mmol/L的內(nèi)引物I和濃度為32?48Mfflol/L的內(nèi)引物II配制而成；
一具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶:濃度為7?9U/ μ L ；
—10Χ 反應(yīng)緩沖液:200 mmol/L且pH= 8.8 的Tris-HCl，100 mmol/L KCl, 100 mmol/L (NH4) 2S04,40?100 mmol/L MgSO4,6?14 mol/L 舌甘菜喊;
—dNTPs溶液:由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
一陽(yáng)性DNA對(duì)照樣品:含有脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，或者食品中常見(jiàn)的豬、牛、羊、雞、鴨和魚的總DNA樣品；
一陰性DNA對(duì)照樣品:不含脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的DNA 一顯色劑:1000XSYBR GREEN I熒光染料。
[0045]其中:
脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1第I位到259位所示。
[0046]外引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2第I位到18位所示。
[0047]外引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3第I位到18位所示。
[0048]內(nèi)引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.4第I位到44位所示。
[0049]內(nèi)引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5第I位到46位所示。
[0050]實(shí)施例4 一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
⑴提取待測(cè)樣品DNA:
在2mL離心管I中加入400μ? TE緩沖液，然后加入食用油lmL，漩渦震蕩混勻:T8min，室溫下13000r/min離心5min，去除上層油脂，留下層水相，在所述離心管I中再次加入食用油lmL，顛倒混勻，離心，共重復(fù)5?20次，所得水相即為待測(cè)樣品DNA ；
⑵配制待測(cè)樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系:
在200 μ L PCR反應(yīng)管I內(nèi)加入所述待測(cè)樣品DNA 2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
⑶配制對(duì)照樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系:
在200 uL PCR反應(yīng)管II內(nèi)加入陽(yáng)性DNA對(duì)照樣品2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
在200 μ L PCR反應(yīng)管III內(nèi)加入陰性DNA對(duì)照樣品2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
⑷分別對(duì)PCR反應(yīng)管1、PCR反應(yīng)管I1、PCR反應(yīng)管III進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng):6(T65°C孵育2(T60min,80°C孵育5min終止反應(yīng)；
(5)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定:在LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入廣2 μ?顯色劑，混勻，通過(guò)肉眼觀察顯色結(jié)果來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果；
(6)當(dāng)出現(xiàn)綠色，則為陽(yáng)性，即判定樣品為地溝油；
(7)當(dāng)出現(xiàn)橙色，則為陰性，若待測(cè)樣品DNA的濃度偏差小于同等條件下市售標(biāo)準(zhǔn)油脂樣品處理后的濃度的1%時(shí)，則判定樣品為地溝油；
(8)當(dāng)出現(xiàn)橙色，則為陰性，若待測(cè)樣品DNA的濃度與同等條件下市售標(biāo)準(zhǔn)油脂樣品處理后的濃度相等時(shí)，則將待測(cè)樣品DNA轉(zhuǎn)移至離心管II中；
(9)在離心管II中加入100μ L 20% SDS,混勻后經(jīng)65°C水浴lOmin，期間顛倒數(shù)次；然后在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到上清液I，該上清液I移至離心管III中；
(10)在離心管III中加入等體積的Tris和苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻后靜置lOmin，室溫下13000r/min離心5min,得到上清液II,該上清液II移至離心管IV中；苯酹_氯仿_異戊醇混合液是指將苯酚、氯仿、異戊醇按25 mL:24 mL:1 mL的體積比混合而成的溶液；
在離心管IV中，按上清液II的體積的0.7倍加入異丙醇，顛倒混勻后于_20°C冰箱靜置過(guò)夜沉淀DNA，然后在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到沉淀物；該沉淀物用體積濃度為70%的乙醇洗滌2次，最后，沉淀物自然晾干，并加50 μ L TE緩沖液溶解，-20°C保存，即得純化的待測(cè)樣品DNA ；
(11)配制純化的待測(cè)樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系:
在200 μ L PCR反應(yīng)管IV內(nèi)加入純化的待測(cè)樣品DNA 2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
(12)分別將PCR反應(yīng)管I1、PCR反應(yīng)管II1、PCR反應(yīng)管IV重復(fù)所述步驟⑷?(5)，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，即判定樣品為地溝油；當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，即判定樣品為市售標(biāo)準(zhǔn)油脂。
[0051]應(yīng)該理解，這里討論的實(shí)施例和實(shí)施方案只是為了說(shuō)明，對(duì)熟悉該領(lǐng)域的人可以提出各種改進(jìn)和變化，這些改進(jìn)和變化將包括在本申請(qǐng)的精神實(shí)質(zhì)和范圍以及所附的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒，包括 一檢測(cè)引物溶液:由濃度為4飛MmoI/L的外引物1、濃度為4飛MmoI/L的外引物I1、濃度為32?48 Mfl1l/L的內(nèi)引物I和濃度為32?48Mfflol/L的內(nèi)引物II配制而成； 一具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶:濃度為7?9U/ μ L ； —1X 反應(yīng)緩沖液:由 200 mmol/L 且 pH= 8.8 的 Tris-HCl，100 mmol/L KCl, 100mmol/L (NH4) 2S04,40?100 mmol/L MgSO4,6?14 mol/L 甜菜喊混合而成； —dNTPs溶液:由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成； 一陽(yáng)性DNA對(duì)照樣品:含有脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，或者食品中常見(jiàn)的豬、牛、羊、雞、鴨和魚的總DNA樣品； 一陰性DNA對(duì)照樣品:不含脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的DNA。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒，其特征在于:所述脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1第I位到259位所示。
3.如權(quán)利要求1所述的一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒，其特征在于:所述外引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2第I位到18位所示。
4.如權(quán)利要求1所述的一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒，其特征在于:所述外引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3第I位到18位所示。
5.如權(quán)利要求1所述的一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒，其特征在于:所述內(nèi)引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.4第I位到44位所示。
6.如權(quán)利要求1所述的一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒，其特征在于:所述內(nèi)引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5第I位到46位所示。
7.如權(quán)利要求1所述的一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒，其特征在于:該試劑盒還包括顯色劑1000 X SYBR GREEN I熒光染料。
8.如權(quán)利要求1所述的一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟: ⑴提取待測(cè)樣品DNA: 在2mL離心管I中加入400μ? TE緩沖液，然后加入食用油lmL，漩渦震蕩混勻:T8min，室溫下13000r/min離心5min，去除上層油脂，留下層水相，在所述離心管I中再次加入食用油lmL，顛倒混勻，離心，共重復(fù)5?20次，所得水相即為待測(cè)樣品DNA ； ⑵配制待測(cè)樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系: 在200 μ L PCR反應(yīng)管I內(nèi)加入所述待測(cè)樣品DNA 2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ； ⑶配制對(duì)照樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系: 在200 uL PCR反應(yīng)管II內(nèi)加入陽(yáng)性DNA對(duì)照樣品2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ； 在200 μ L PCR反應(yīng)管III內(nèi)加入陰性DNA對(duì)照樣品2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ； ⑷分別對(duì)所述PCR反應(yīng)管1、PCR反應(yīng)管I1、PCR反應(yīng)管III進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng):6(T65°C孵育2(T60min，8(TC孵育5min終止反應(yīng)； (5)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定:通過(guò)肉眼觀察或利用濁度儀分別觀察所述PCR反應(yīng)管1、PCR反應(yīng)管I1、PCR反應(yīng)管III內(nèi)沉淀的濁度變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果，或取2飛μ?擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果； (6)當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，即判定樣品為地溝油； ⑴當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，若所述待測(cè)樣品DNA的濃度偏差小于同等條件下市售標(biāo)準(zhǔn)油脂樣品處理后的濃度的1%時(shí)，則判定樣品為地溝油； ⑶當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，若所述待測(cè)樣品DNA的濃度與同等條件下市售標(biāo)準(zhǔn)油脂樣品處理后的濃度相等時(shí)，則將所述待測(cè)樣品DNA轉(zhuǎn)移至離心管II中； ⑶在所述離心管II中加入100 μ L 20% SDS,混勻后經(jīng)65°C水浴lOmin，期間顛倒數(shù)次；然后在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到上清液I，該上清液I移至離心管III中； (10)在所述離心管III中加入等體積的Tris和苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻后靜置1min,室溫下13000r/min離心5min,得到上清液II,該上清液II移至離心管IV中；所述苯酚-氯仿-異戊醇混合液是指將苯酚、氯仿、異戊醇按25 mL:24 mL:1 mL的體積比混合而成的溶液； 在所述離心管IV中，按所述上清液II的體積的0.7倍加入異丙醇，顛倒混勻后于_20°C冰箱靜置過(guò)夜沉淀DNA，然后在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到沉淀物；該沉淀物用體積濃度為70%的乙醇洗滌2次，最后，沉淀物自然晾干，并加50μ L TE緩沖液溶解，_20°C保存，即得純化的待測(cè)樣品DNA ； (11)配制純化的待測(cè)樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系: 在200 uL PCR反應(yīng)管IV內(nèi)加入所述純化的待測(cè)樣品DNA 2飛μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶IyLUOX反應(yīng)緩沖液2.5 μ L、dNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 uL； (12)分別將所述PCR反應(yīng)管I1、PCR反應(yīng)管II1、PCR反應(yīng)管IV重復(fù)所述步驟⑷?(5)，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，即判定樣品為地溝油；當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，即判定樣品為市售標(biāo)準(zhǔn)油脂。
9.如權(quán)利要求7所述的一種用于地溝油檢測(cè)的試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟: ⑴提取待測(cè)樣品DNA: 在2mL離心管I中加入400μ? TE緩沖液，然后加入食用油lmL，漩渦震蕩混勻:T8min，室溫下13000r/min離心5min，去除上層油脂，留下層水相，在所述離心管I中再次加入食用油lmL，顛倒混勻，離心，共重復(fù)5?20次，所得水相即為待測(cè)樣品DNA ； ⑵配制待測(cè)樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系: 在200 μ L PCR反應(yīng)管I內(nèi)加入所述待測(cè)樣品DNA 2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到.25 μ L ； ⑶配制對(duì)照樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系: 在200 uL PCR反應(yīng)管II內(nèi)加入陽(yáng)性DNA對(duì)照樣品2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到.25 μ L ； 在200 μ L PCR反應(yīng)管III內(nèi)加入陰性DNA對(duì)照樣品2?5 μ L、檢測(cè)引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到.25 μ L ； ⑷分別對(duì)所述PCR反應(yīng)管1、PCR反應(yīng)管I1、PCR反應(yīng)管III進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng):6(T65°C孵育2(T60min，8(TC孵育5min終止反應(yīng)； (5)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定:在LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入廣2 μ?顯色劑，混勻，通過(guò)肉眼觀察顯色結(jié)果來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果； (6)當(dāng)出現(xiàn)綠色，則為陽(yáng)性，即判定樣品為地溝油； (7)當(dāng)出現(xiàn)橙色，則為陰性，若所述待測(cè)樣品DNA的濃度偏差小于同等條件下市售標(biāo)準(zhǔn)油脂樣品處理后的濃度的1%時(shí)，則判定樣品為地溝油； (8)當(dāng)出現(xiàn)橙色，則為陰性，若所述待測(cè)樣品DNA的濃度與同等條件下市售標(biāo)準(zhǔn)油脂樣品處理后的濃度相等時(shí)，則將所述待測(cè)樣品DNA轉(zhuǎn)移至離心管II中； ⑶在所述離心管II中加入100 μ L 20% SDS,混勻后經(jīng)65°C水浴lOmin，期間顛倒數(shù)次；然后在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到上清液I，該上清液I移至離心管III中； (10)在所述離心管III中加入等體積的Tris和苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻后靜置.1min,室溫下13000r/min離心5min,得到上清液II,該上清液II移至離心管IV中；所述苯酚-氯仿-異戊醇混合液是指將苯酚、氯仿、異戊醇按25 mL:24 mL:1 mL的體積比混合而成的溶液； 在所述離心管IV中，按所述上清液II的體積的0.7倍加入異丙醇，顛倒混勻后于_20°C冰箱靜置過(guò)夜沉淀DNA，然后在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到沉淀物；該沉淀物用體積濃度為70%的乙醇洗滌2次，最后，沉淀物自然晾干，并加50μ L TE緩沖液溶解，_20°C保存，即得純化的待測(cè)樣品DNA ； (11)配制純化的待測(cè)樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系: 在200 uL PCR反應(yīng)管IV內(nèi)加入所述純化的待測(cè)樣品DNA 2飛μ L、檢測(cè)引物溶液.1.5 μ L、Bst DNA聚合酶IyLUOX反應(yīng)緩沖液2.5 μ L、dNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 uL； (12)分別將所述PCR反應(yīng)管I1、PCR反應(yīng)管II1、PCR反應(yīng)管IV重復(fù)所述步驟⑷?(5)，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，即判定樣品為地溝油；當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，即判定樣品為市售標(biāo)準(zhǔn)油脂。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104328193SQ201410636580
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】徐紅偉, 臧榮鑫 申請(qǐng)人:西北民族大學(xué)