一種使微生物可同時發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明是關(guān)于一種利用微生物發(fā)酵糖類的方法。本發(fā)明藉由基因工程的方式，針對目標細菌的糖類代謝相關(guān)路徑進行改良，使得目標細菌具備可以同時快速代謝五碳糖與六碳糖的能力，并且達到利用單一菌株即可同時發(fā)酵五碳糖與六碳糖的功能，不僅簡化發(fā)酵的流程，更可以降低發(fā)酵成本、提升糖類發(fā)酵的效能。
【專利說明】-種使微生物可同時發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法
[0001] 本申請是中國專利申請No. 201110448728. 7的分案申請，原申請的申請日為 2011. 12. 28,申請?zhí)枮?01110448728. 7,發(fā)明創(chuàng)造名稱為一種使微生物可同時發(fā)酵五碳醣 與六碳醣的方法。
[0002] 本申請要求2011年12月16日提交的在先申請?zhí)枮?00146856的優(yōu)先權(quán)，其整體 通過引用合并此。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明是關(guān)于一種利用微生物發(fā)酵糖類的方法，尤其是關(guān)于一種使微生物可同時 發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法。

【背景技術(shù)】
[0004] 由再生資源來生產(chǎn)替代性能源和取代石油衍生性的化學(xué)品是目前國際市場的主 流，也是必然的趨勢。再生資源中，尤以植物生質(zhì)（即木質(zhì)纖維素）的蘊藏量最豐，而木質(zhì) 纖維素包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，其中纖維素和半纖維素經(jīng)酵素水解后，主要可生成 葡萄糖（glucose)和木糖（xylose),本發(fā)明可以將細菌（如：大腸桿菌）改質(zhì)，經(jīng)改質(zhì)后的 菌株即具有同時且快速代謝葡萄糖和木糖的能力，并能發(fā)酵轉(zhuǎn)化生成能源（如：酒精）和其 他大宗化學(xué)品（如：乳酸）。
[0005] 習知技術(shù)中，常見利用大腸桿菌對糖類進行發(fā)酵的技術(shù)，然而此一方法存在著若 干尚待解決的問題。大腸桿菌的優(yōu)勢在于生長快速、培養(yǎng)基成分簡單且易于調(diào)配、發(fā)酵過程 易于操作、并且可以代謝多種不同的糖類，然而在同時具有多種糖類的生長環(huán)境之下，大腸 桿菌會優(yōu)先代謝葡萄糖，待生長環(huán)境中的葡萄糖消耗完畢后，才會開始依序代謝其他糖類， 因此無法同時代謝不同的糖類，使得整體糖類的代謝速率無法提升，甚至造成非葡萄糖的 其他糖類代謝不完全，導(dǎo)致糖類代謝的效率低落。
[0006] 先前技術(shù)利用紫外光、伽瑪射線、亞硝基胍（nitrosoguanidine)等致突變劑使得 菌種產(chǎn)生突變，接著透過篩選的方式找出可以同時發(fā)酵五碳糖與六碳糖的菌株，然而此一 方法步驟繁瑣，亦非在了解菌種糖類代謝機制的情況下將菌種改良而得到可同時代謝五 碳糖與六碳糖的菌株，而是藉由重復(fù)篩選的方式摸索尋找可能適合的變種菌株，因此效果 較差。
[0007] 由于大腸桿菌在代謝葡萄糖時所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物會抑制其他糖類的代謝路徑，因 此有習知技術(shù)讓大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)移酵素系統(tǒng)產(chǎn)生缺陷，以期降低大腸桿菌代謝葡萄糖時 所造成的降解產(chǎn)物抑制效應(yīng)，希望藉此提高其他糖類的代謝速率。然而，具有缺陷的大腸桿 菌雖然可以因此同時代謝葡萄糖與木糖，但是其對于葡萄糖的代謝速率卻明顯降低，反而 不利于整體的代謝流程及產(chǎn)物生成效率。
[0008] 若干先前技術(shù)會在糖類發(fā)酵過程中同時采用兩種分別代謝葡萄糖和木糖的菌株， 希望能藉由兩種菌株分工的方式達到同時代謝五碳糖與六碳糖的目的。但是這樣的發(fā)酵過 程操作不易，必須多次嘗試與調(diào)整才能達到最佳的發(fā)酵成效，并且必須事先培養(yǎng)兩種菌株， 因此也會導(dǎo)致整體發(fā)酵成本的增加,并不利于工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用。
[0009] 由于必須克服前述習知技術(shù)的缺點，例如發(fā)酵成本過高、發(fā)酵速率與效率不佳、發(fā) 酵操作程序困難繁復(fù)等，因此有必要找到能夠利用易于制備的單一菌株同時發(fā)酵五碳糖與 六碳糖的方法，以便改善與簡化糖類發(fā)酵的程序并提升糖類發(fā)酵的效能，藉此提升相關(guān)產(chǎn) 業(yè)界的技術(shù)，尤其在生質(zhì)能源的領(lǐng)域更有其必要性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 人類第四次工業(yè)革命的產(chǎn)業(yè)實系于綠色的制程，其中生物產(chǎn)業(yè)被視為綠色工業(yè)的 代表，生物產(chǎn)業(yè)有賴于生物技術(shù)為基礎(chǔ)，相對于以化石能源為基礎(chǔ)的化學(xué)工業(yè)，生物技術(shù)可 有效降低能源的消耗和污染的排放，尤其生物技術(shù)可利用再生資源，達到永續(xù)發(fā)展和改善 環(huán)境的目的。再生資源是指以生物質(zhì)（biomass)為原料，范圍主要包括作物、農(nóng)林漁牧加 工后的廢棄物和工業(yè)及都市排放的有機廢棄物，透過生物精煉制程（biorefinery process) 可將這些生物質(zhì)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)替代性能源、取代石油衍生性的產(chǎn)品和新產(chǎn)品，這類新興產(chǎn)業(yè)的 市場以每年約15%的速率成長，預(yù)計2012年的全球總產(chǎn)值可達到1215億美元（Gobina E, 2007, report code EGY054A, BCC Research publications)〇
[0011] 再生資源中，尤以木質(zhì)纖維素（Iignocellulose)的蘊藏量最豐，木質(zhì)纖維素的來 源廣泛，但目前被研究可做為發(fā)酵料源的，包括（1)農(nóng)業(yè)殘留物如甘蔗渣、稻桿、榖殼、玉 米桿等，（2)非糧食作物，如芒草等，（3)木本生物質(zhì)，如麻瘋樹等，（4)生物質(zhì)廢棄物，如 蔬菜和水果廢棄物、紙楽廢棄物和都市排放固態(tài)廢棄物等（Dietmar P, 2006, Biotechnol J. 1:806-814)。一般而言，木質(zhì)纖維素的組成包含30-60%纖維素（cellulose)、20-40%半 纖維素（hemicellulose)和10-30%木質(zhì)素（lignin)。而纖維素是一種由葡萄糖以β-1，4 糖鍵結(jié)（glycosidic linkage)的聚合糖，由于其本身分子和分子間的氫鍵鍵結(jié)，以致造成 結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)的結(jié)構(gòu)；半纖維素則是一種由六碳糖和五碳糖所構(gòu)成的具有復(fù)雜分支結(jié) 構(gòu)的聚合糖，軟木的半纖維素組成分主要是六碳糖如葡萄糖，而硬木的半纖維素組成分主 要是五碳糖如木糖（Ganapathy S.et al. 2010, Eng. Life Sci. 10:8-18)。纖維素和半纖維 素經(jīng)水解后，主要可生成葡萄糖和木糖，絕大部分的微生物皆可有效代謝葡萄糖，然僅有少 數(shù)的微生物可以發(fā)酵木糖，不過代謝效能不彰，以致影響了以木質(zhì)纖維素為基礎(chǔ)的微生物 發(fā)酵精煉制程的工業(yè)發(fā)展。
[0012] 相較于其他細菌，大腸桿菌是一株工業(yè)實用友善性極高的菌種，它的優(yōu)勢在于生 長快速、培養(yǎng)基質(zhì)配方簡單、發(fā)酵易操作，尤其大腸桿菌具有代謝多種類糖（包括木糖）的 能力，不過當有多種糖類同時存在的環(huán)境下，大腸桿菌將優(yōu)先使用葡萄糖，其他糖類（如木 糖）的代謝則受到抑制，待葡萄糖消耗完后，其他糖類再依次代謝，因此遲緩了糖的代謝速 率，甚至造成其他糖類代謝的不完全，以致效率不佳。
[0013] 基于此，本發(fā)明技術(shù)就是運用代謝工程的技術(shù)來改質(zhì)大腸桿菌，根據(jù)大腸桿菌的 葡萄糖和木糖代謝路徑，剔除大腸桿菌的PtsG基因，以緩和葡萄糖降解物抑制的現(xiàn)象，再 引介運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)的葡萄糖促進基因 （glucose facilitator gene) gif，以增進大腸桿菌的葡萄糖代謝速率，且加強五碳糖磷酸代謝路徑的rpiA、tktA、 rpe、talB基因表現(xiàn)，以增加大腸桿菌木糖代謝的速率，最后移除生產(chǎn)其他有機酸的ldhA、 frdA、pta、poxB基因，以便移除生成的有機酸對于五碳糖磷酸的回饋抑制作用。整合以上 的代謝工程技術(shù)，經(jīng)改質(zhì)后的單一菌株即能同時代謝葡萄糖和木糖，且葡萄糖和木糖的消 耗速率可幾乎達到同步，操作簡易方便，亦可簡化發(fā)酵程序，以生產(chǎn)能源（如酒精）和其他 大宗化學(xué)品（如乳酸）為最佳實施例，可有效提升發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)效能，極具發(fā)展前瞻性和 潛力。
[0014] 圖3.大腸桿菌的葡萄糖和木糖代謝路徑。
[0015] 本發(fā)明是利用基因工程的方式改良大腸桿菌的代謝路徑，使大腸桿菌得以同時且 快速地代謝五碳糖與六碳糖，包含以下步驟：剔除大腸桿菌的PtsG基因，以緩和葡萄糖降 解物抑制的現(xiàn)象；引介運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)的葡萄糖促進基因 （glucose facilitator gene) glf，以增進大腸桿菌的葡萄糖代謝速率；引入一起動子以加強五碳糖 磷酸代謝路徑的rpiA、tktA、rpe、talB基因表現(xiàn)，藉此增加大腸桿菌木糖代謝的速率；剔除 生產(chǎn)其他有機酸的ldhA、frdA、pta、poxB基因，以便移除代謝過程中生成的有機酸對于五 碳糖磷酸的回饋抑制作用。
[0016] 因此，本發(fā)明的一種利用微生物發(fā)酵糖類的方法不但可以增進菌株發(fā)酵植物生質(zhì) 水解產(chǎn)物的速率，亦可簡化發(fā)酵程序，并且有效提升發(fā)酵產(chǎn)品的生成效能，具有國內(nèi)外市場 需求的潛力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明的一種實施方式的流程圖。
[0018] 圖2為本發(fā)明的另一實施方式的流程圖。
[0019] 圖3.大腸桿菌的葡萄糖和木糖代謝路徑。
[0020] 圖4. DNA電泳圖。
[0021] 圖 5.質(zhì)體 pND-glf 圖譜。
[0022] 圖 6.質(zhì)體 pHK-glf 圖譜。
[0023] 圖7. DNA電泳圖。
[0024] 圖 8.質(zhì)體 pPhi80_rTA 圖譜。
[0025] 圖9. DNA電泳圖。
[0026] 圖 10.質(zhì)體 pLam-rTB 圖譜。
[0027] 圖ILDNA電泳圖。
[0028] 圖 12.質(zhì)體 pMC-poxKm 圖譜。
[0029] 圖 13. DNA 電泳圖。
[0030] 圖 14.質(zhì)體 pMC-ptaKm 圖譜。
[0031] 圖 15. DNA 電泳圖。
[0032] 圖 16.質(zhì)體 pND-pet 圖譜。
[0033] 圖17.重組菌株BL21/pND-pet和BL-G/pND-pet的混合糖消耗曲線。
[0034] 圖18.重組菌株BL21/pND-pet和BL-G/pND-pet發(fā)酵混合糖生產(chǎn)酒精曲線。
[0035] 圖19.重組菌株BL-Gf/pND-pet和BL21e-RB/pND-pet的混合糖消耗曲線。
[0036] 圖20.重組菌株BL21/pND-pet和BL-G/pND-pet發(fā)酵混合糖生產(chǎn)酒精曲線。
[0037] 圖21.重組菌株BL-A4/pND_pet的混合糖消耗曲線。
[0038] 圖22.重組菌株BL-A4/pND-pet發(fā)酵混合糖生產(chǎn)酒精曲線。
[0039] 圖 23.質(zhì)體 pTrc-H/D-ldh 圖譜。
[0040] 圖24. BL-A4/pTrc-H/D-Ldh的混合糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸曲線。

【具體實施方式】
[0041] 本發(fā)明于實施例中所提及的實驗操作方法，優(yōu)先說明如下：
[0042] -般實驗方法與材料
[0043] 本發(fā)明技術(shù)中采用的一般實驗方法和DNA選殖（DNA cloning)主要可參考本技 藝中所詳知的教科書：Sambrook J, Russell DW, 2001，Molecular Cloning :a Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York，其中例如限制酶剪切 DNA 片段反應(yīng)（cleavage reaction by restricting enzyme)、使用 T4DNA 黏接酶（Iigase) 黏接 DNA 片段反應(yīng)（DNA ligation with T4DNA ligase)、聚合酶連鎖反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR)、瓊脂凝膠電泳（agarose gel electrophoresis)、硫酸十二酯鈉一 聚丙烯醜胺電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)和 質(zhì)體轉(zhuǎn)形（transform)等,這些技術(shù)都是熟悉此項技術(shù)的人士可根據(jù)本身的專業(yè)素養(yǎng)來 實施。此外、細菌培養(yǎng)液密度是使用分光亮度計（V530, Jasco)測量，測定波長為550nm， 所得到的吸光值記錄為0D550。蛋白質(zhì)濃度分析則是使用蛋白質(zhì)分析試劑（Protein assay Reagent, BioRad Co.)，進行總蛋白質(zhì)的定量，個別標的的蛋白質(zhì)則是以影像分析儀 (AlphalmagerEP, AlphaInnotech)來分析經(jīng)凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)加以定量。
[0044] 細菌及噬菌體染色體（chromosome)、質(zhì)體（plasmid)和DNA片段的純化則分別 使用 Wizard*3 Genomic DNA Purification kit (Promega Co.)、High-Speed Plasmid Mini kit(Geneaid Co.)和 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit(Geneaid Co.)等商業(yè) 純化藥品組。DNA核苷酸定點突變則使用QuickChange」Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Co·)、限制酶（Restriction enzyme)購自 New England Biolabs 以及 Fermentas Life Science，T4DNA 黏接酶和 Pfu DNA 聚合酶（polymerase)購自 Promega Co.，聚合酶連鎖反應(yīng)中所須的引子（primers)委由明欣生物科技公司（臺北）及源資生物 科技公司（臺北）合成。
[0045] DNA選殖過程中所使用的中介細胞為大腸桿菌DH5 a (Stratagene Co.)、 BW25142(Haldimann and Wanner，2001，J.Bacteriol.，183:6384-93)與 BL21(DE3) (Invitrogen Co.),細菌以 LB 營養(yǎng)基(Miller JH, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)培養(yǎng)，而經(jīng)轉(zhuǎn)形的菌種則在 培養(yǎng)基中添加抗生素培養(yǎng)，抗生素用量如安培西林（ampicillin)為50yg/mL，康納霉素 (kanamicin)為 50μ g/mL〇
[0046] 實施例一：
[0047] L剔除大腸桿菌染色體的PtsG基因：
[0048] 根據(jù)前人的研究，移除PtsG基因產(chǎn)物的功能后，可減緩大腸桿菌中葡萄糖降解物 抑制的效應(yīng)，使得大腸桿菌可以同時利用木糖和葡萄糖。因此，首先剔除大腸桿菌染色體的 PtsG基因，其進行步驟如下所述。根據(jù)EcoCyc基因體數(shù)據(jù)庫中ptsG基因周遭的核苷酸序 列來合成以下兩個引子：
[0049] 順向引子I:
[0050] (5, -TGGGTGAAACCGGGCTGG)
[0051] 反向引子2:
[0052] (5, -AGCCGTCTGACCACCACG)
[0053] 使用 Wizard Genomic DNA purification kit (Promega Co.)來純化菌株 CGSC9031(E.coli Genetic Stock Center, USA)的染色體，以純化后的染色體為DNA模版 (template)，使用上述兩個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一段DNA(2. 8kb)，其兩端包含ptsG 基因 N端及ptsG基因 C端的同源區(qū)域，而其中間部分則包含一個兩端被FRT位置（sites) 鑲夾的抗康納霉素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進 行純化。接著，依照前述的"化學(xué)轉(zhuǎn)形法"，將協(xié)助型質(zhì)體pKD46 (Datsenko K.A. and Wanner B. L.，2000, Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 97:6640-6645)轉(zhuǎn)形入大腸桿菌亞型 B BL21 中，得到 菌株BL21/pKD46。依照前述的"電穿孔法"，準備菌株BL21/pKD46的勝任細胞，再利用電穿 孔法將上述所得的線性DNA送入菌株BL21/pKD46中，隨后以SOC培養(yǎng)基于30°C下培養(yǎng)，同 時加入ImM阿拉伯糖進行誘導(dǎo)生產(chǎn)質(zhì)體PKD46上的λ -Red基因，以幫助此增幅出來的線性 DNA與染色體ptsG基因進行同源重組（homologous recombination)，誘導(dǎo)二小時后，將培 養(yǎng)溫度提升到42°C，經(jīng)二小時后以離心機將細胞離心下來，移除上清液，將細胞涂灑在含有 抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基上。隨意挑選生長于固態(tài)培養(yǎng)基的菌落，以順向引子3和反向 引子4 (如下），使用前述的"原位PCR反應(yīng)"來確認染色體基因 ptsG中所鑲嵌的抗康納霉 素基因，如圖4中所示，挑選出的菌株可增幅出抗康納霉素基因的DNA片段，然而原生型菌 株BL21則無法增幅出抗康納霉素基因的DNA片段。最后選擇其中一株菌株，根據(jù)前述的"抗 抗生素基因移除法"來移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型質(zhì) 體PCP20產(chǎn)生FLP蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個FRT位置后，將抗康納霉素基因由菌株染色體上移 除，選擇其中一株無法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基生長的菌株，重新命名為BL-G。
[0054] 圖4. DNA電泳圖。徑1 :原生型菌株BL21 ;徑2 :DNA標準物；徑3 :染色體鑲嵌抗 康納霉素基因的菌株。
[0055] 順向引子3:
[0056] (5, -GATTGAACAAGATGGATTGC)
[0057] 反向引子4:
[0058] (5, -GAAGAACTCGTCAAGAAGGC)
[0059] 2.建構(gòu)含有g(shù)if基因的重組大腸桿菌菌株：
[0060] 根據(jù)前人的研究報導(dǎo)，PtsG基因缺陷大腸桿菌的葡萄糖消耗速率將大幅降低， 另一方面，過去的研究顯示來自運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)的葡萄糖促進基因 (glucose facilitator gene) gif產(chǎn)物可提供大腸桿菌運輸葡萄糖到胞內(nèi)的功能（Parker C et al.，1995, Mol Microbiol. 15:795-802),為了設(shè)法提升此缺陷菌BL-G的葡萄糖消耗 速率，因此將gif基因引介入PtsG基因缺陷大腸桿菌中。建構(gòu)過程如下，首先根據(jù)美國國 家生物科技信息中心（NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫gif的核苷酸序列（GenBank:M60615. 1)來合成 gif基因引子：
[0061] 順向引子5:
[0062] (5, -TGTCTCTAGAAGCATGCAGGAGGAATCG)
[0063] 反向引子6:
[0064] (5, -AGCAACTCGAGTTACTTCTGGGAGCGCCAC)
[0065] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶XbaI的切割位置（如底線所標示者），而反向 引子設(shè)計含有XhoI的切割位置（如底線所標示者）。以Z. mobilis的染色體做為DNA模 板，并以上述兩個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一含有g(shù)if的片段（1.4kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純化后，使用限制酵素 XbaI以及XhoI 切割此基因片段；另一方面，利用High-Speed Plasmid Mini kit純化質(zhì)體pND707 (Love CA et al·，1996, Gene, 176:49-53)，以限制酵素 XbaI 以及 XhoI 切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶（T41igase) 將上述兩個片段黏合后，依照前述"一般實驗方法"，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株 DH5a中，而得到質(zhì)體pND-glf，如下圖5所示。
[0066] 圖5.質(zhì)體pND-glf圖譜。符號簡寫說明：bla，抗安培西林基因；CI857,抑制子； lambda PR, λ PR 啟動子；lambda PL，λ PL 啟動子。
[0067] 接著，構(gòu)筑鑲嵌式質(zhì)體（integration plasmid) pHK-glf，根據(jù)質(zhì)體 pND-glf 的 DNA 序列，設(shè)計以下的引子：
[0068] 順向引子7:
[0069] (5, -AAGGGGGATCCATCTAACACCGTGCGTGTTG)
[0070] 反向引子8:
[0071] (5, -AGCAACTCGAGTTACTTCTGGGAGCGCCAC)
[0072] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶BamHI的切割位置（如底線所標示者）。以質(zhì)體 pND-glf做為DNA模板，并以上述兩個引子進行菌落PCR反應(yīng)，增幅出一段含有受λ PRPL 啟動子調(diào)控 gif 的 DNA 片段（I. 8kb)，以 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將增幅 的基因片段進行純化后，使用限制酵素 BamHI以及SmaI切割；另一方面，利用High-Speed Plasmid Mini kit 純化的壤嵌式質(zhì)體 pHK-Km(Chiang CJ et al·，2008, Biotechnol. Bioeng. 101:985-995)，以限制酵素 BamHI 以及 SmaI 切害Ij ;接著使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將上述被酵素切割過的DNA片段回收，利用T4黏合酶 CMligase)將上述兩個片段黏合后，依照前述"一般實驗方法"，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大 腸桿菌菌株DH5a (pir)中，而得到鑲嵌式質(zhì)體pHK-glf，質(zhì)體圖譜如下圖6所示。
[0073] 圖6.質(zhì)體pHK-glf圖譜。符號簡寫說明：Km，康納霉素抗性基因；R6K origin，大 腸桿菌R6K復(fù)制源點；HK attP，前嗜菌體（prophage) HK鑲嵌位置；lambda PR, Pk啟動子； lambda PL，Plj 啟動子。
[0074] 其次，將受λ PRPL啟動子調(diào)控gif基因鑲嵌至ptsG基因缺陷菌株BL-G 的染色體上，因此將協(xié)助型質(zhì)體pAH69 (Haldimann A and Wanner BL.，2001，J Bacteriol.，183:6384-6393)依照前述的"化學(xué)轉(zhuǎn)形法"轉(zhuǎn)形進入大腸桿菌菌株BL-G中，得 到菌株BL-G/pAH69 ;接著根據(jù)前述的"質(zhì)體鑲嵌細菌染色體法"，將鑲嵌式質(zhì)體pHK-glf再 轉(zhuǎn)形入菌株BL-G/pAH69中，進行基因鑲嵌入菌株染色體，以含有康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基 來篩選菌株。挑選單一菌落，利用順向引子7和反向引子8,使用前述的"原位PCR反應(yīng)"來 確認染色體鑲嵌一個gif基因，經(jīng)挑選出的菌株可增幅出一個受λ PRPL啟動子調(diào)控gif基 因片段（徑3)，如下圖7所示。
[0075] 圖7. DNA電泳圖。徑I :DNA標準物；徑2 :質(zhì)體pHK-glf ;徑3 :染色體鑲嵌gif基 因菌株。
[0076] 最后，根據(jù)前述的"抗抗生素基因移除法"來移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉 素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型質(zhì)體PCP20產(chǎn)生FLP蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個FRT位置后，將抗康 納霉素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基 生長的菌株，重新命名為BL-Gf。
[0077] 3.強化大腸桿菌的rpe和tktA基因：
[0078] 為了增進菌株代謝木糖的速率，因此將強化菌株的五碳糖磷酸代謝路徑中的rpe 和tktA基因。其執(zhí)行流程如下，首先根據(jù)美國國家生物科技信息中心（NCBI)基因體數(shù)據(jù) 庫rpe的核苷酸序列來合成引子：
[0079] 順向引子9:
[0080] (5, -TATACATATGAAACAGTATTTGATTGC)
[0081] 反向引子10:
[0082] (5, -CCTGAATTCAAACTTATTCATGACTTACC)
[0083] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶NdeI的切割位置（如底線所標示者），而反向引 子設(shè)計含有EcoRI的切割位置（如底線所標示者）。以大腸桿菌BL21的染色體做為模板， 并以上述兩個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一含有rpe基因的片段（0. 7kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純化后，用限制酵素 NdeI以及EcoRI切 害1J，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；另一 方面，根據(jù)美國國家生物科技信息中心（NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫tktA的核苷酸序列來合成引 子：
[0084] 順向引子11:
[0085] (5, -ACGGGAATTCAGGAGGAGTCAAAATG)
[0086] 反向引子12:
[0087] (5, -GGGCCTCGAGTTACAGCAGTTCTTTTC)
[0088] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶EcoRI的切割位置（如底線所標示者），而反 向引子設(shè)計含有XhoI的切割位置（如底線所標示者）。以大腸桿菌BL21的染色體做 為模板，并以上述兩個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一含有tktA基因的片段（2. Olkb)， 以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純化后，用限制酵 素 EcoRI 以及 XhoI 切害!]，再使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將酵素切 割過的DNA片段回收；同時利用High-Speed Plasmid Mini kit純化質(zhì)體pND707 (Love CA et al·，1996, Gene, 176:49-53)，以限制酵素 NdeI 以及 XhoI 切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶（T41igase) 將上述三個DNA片段黏合后，依照前述"一般實驗方法"，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌 菌株DH5 α中，而得到質(zhì)體pND-rTA。最后依據(jù)質(zhì)體pND-rTA的DNA序列，設(shè)計以下的引子：
[0089] 順向引子13:
[0090] (5, AAGGGGGATCCATCTAACACCGTGCGTGTTG 3,）
[0091] 反向引子14:
[0092] (5, -GGGCCTCGAGTTACAGCAGTTCTTTTC)
[0093] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶BamHI的切割位置（如底線所標示者）。以 質(zhì)體pND-rTA做為模板，并以上述兩個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一含有受λ PRPL啟 動子調(diào)控 rpe-tktA 基因的片段（2. 7kb)，以 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將增幅的基因片段進行純化后，用限制酵素 BamHI切割；另一方面，利用High-Speed Plasmid Mini kit 純化的壤嵌式質(zhì)體 pPhi80_Km(Chiang CJ et al·，2008, Biotechnol. Bioeng. 101:985-995)，以限制酵素 BamHI 以及 SmaI 切害Ij ;接著使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將上述被酵素切割過的DNA片段回收，利用T4黏合酶 CMligase)將上述兩個片段黏合后，依照前述"一般實驗方法"，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大 腸桿菌菌株DH5a (pir)中，而得到鑲嵌式質(zhì)pPhi80-rTA。
[0094] 圖8.質(zhì)體pPhi80-rTA圖譜。符號簡寫說明：Km，康納霉素抗性基因；R6K origin， 大腸桿菌R6K復(fù)制源點；Phi80attP，前嗜菌體（prophage) 80鑲嵌位置；lambda PR, Pk啟動 子；lambda PL, Plj 啟動子。
[0095] 其次，將受λ PRPL啟動子調(diào)控rpe-tktA基因鑲嵌至步驟2建構(gòu)的菌株 BL-Gf 的染色體上，因此將協(xié)助型質(zhì)體 pAH123(Haldimann A and Wanner BL.，2001，J Bacteriol.，183:6384-6393)依照前述的"化學(xué)轉(zhuǎn)形法"轉(zhuǎn)形進入大腸桿菌菌株BL-Gf 中，得到菌株BL-Gf/pAH123 ;接著根據(jù)前述的"質(zhì)體鑲嵌細菌染色體法"，將鑲嵌式質(zhì)體 pPhi80-rTA再轉(zhuǎn)形入菌株BL-Gf/pAH123中，進行基因鑲嵌入菌株染色體，以含有康納霉素 的LB固態(tài)培養(yǎng)基來篩選菌株。挑選單一菌落，利用順向引子13和反向引子14,使用前述 的"原位PCR反應(yīng)"來確認染色體鑲嵌一個rpe-tktA基因，經(jīng)挑選出的菌株可增幅出一個 受λ PRPL啟動子調(diào)控rpe-tktA基因片段（徑3)。
[0096] 圖9. DNA電泳圖。徑I :DNA標準物；徑2 :質(zhì)體pPhi80-rTA ;徑3 :染色體鑲嵌 rpe-tktA基因菌株。
[0097] 最后，根據(jù)前述的"抗抗生素基因移除法"來移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉 素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型質(zhì)體PCP20產(chǎn)生FLP蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個FRT位置后，將抗康 納霉素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基 生長的菌株，重新命名為BL21e。
[0098] 4.強化大腸桿菌的rpiA和talB基因：
[0099]為了增進菌株代謝木糖的速率，因此將強化菌株的五碳糖磷酸代謝路徑中的rpiA 和talB基因。其執(zhí)行流程如下，首先根據(jù)美國國家生物科技信息中心（NCBI)基因體數(shù)據(jù) 庫rpiA的核苷酸序列來合成引子：
[0100] 順向引子15:
[0101] (5' -AATGCCATATGAATTTCATACCACAGGCGAAAC)
[0102] 反向引子16:
[0103] (5, -TGGAGGAATTCCCGTCAGATCATTTCACAATG)
[0104] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶NdeI的切割位置（如底線所標示者），而反向引 子設(shè)計含有EcoRI的切割位置（如底線所標示者）。以大腸桿菌BL21的染色體做為模板， 并以上述兩個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一含有rpiA基因的片段（0.7kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純化后，用限制酵素 NdeI以及EcoRI切 害!]，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；另一 方面，根據(jù)美國國家生物科技信息中心（NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫talB的核苷酸序列來合成引 子：
[0105] 順向引子17:
[0106] (5, -TTTGAATTCAGGAGGATACTATCATGACG)
[0107] 反向引子18:
[0108] (5' -CTAACTCGAGGTCGACGTTACAGCA GATCGCCGATC 3' ）
[0109] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶EcoRI的切割位置（如底線所標示者），而 反向引子設(shè)計含有XhoI的切割位置（如底線所標示者）。以大腸桿菌BL21的染色體 做為模板，并以上述兩個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一含有talB基因的片段（I. Okb)， 以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純化后，用限制酵 素 EcoRI 以及 XhoI 切害!]，再使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將酵素切 割過的DNA片段回收；同時利用High-Speed Plasmid Mini kit純化質(zhì)體pND707 (Love CA et al·，1996, Gene, 176:49-53)，以限制酵素 NdeI 以及 XhoI 切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶（T41igase) 將上述三個DNA片段黏合后，依照前述"一般實驗方法"，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌 株DH5 α中，而得到質(zhì)體pND-rTB。最后依據(jù)質(zhì)體pND-rTB的DNA序列，設(shè)計以下的引子：
[0110] 順向引子19:
[0111] (5 ' AAGGGGGATCCATCTAACACCGTGCGTGTTG 3 '）
[0112] 反向引子20:
[0113] (5, -CTAACTCGAGGTCGACGTTACAG CAGATCGCCGATC 3,）
[0114] 上述反向引子被設(shè)計含有限制酶Sail的切割位置（如底線所標示者）。以質(zhì)體 pND-rTB做為模板，并以上述兩個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一含有受λ PRPL啟動子調(diào)控 rpiA-talB基因的片段（1.7kb)，以 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因 片段進行純化后，用限制酵素 Sail切割；另一方面，利用High-Speed Plasmid Mini kit純 化的壤嵌式質(zhì)體 pLamda_Km(Chiang CJ et al.，2008，Biotechnol.Bioeng. 101:985-995)， 以限制酵素 Sal I以及SmaI切割；接著使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將上 述被酵素切割過的DNA片段回收，利用T4黏合酶（T41igase)將上述兩個片段黏合后，依照 前述"一般實驗方法"，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5ci (pir)中，而得到鑲嵌式 質(zhì)pLam-rTB，質(zhì)體圖譜如圖10所示。
[0115] 圖10.質(zhì)體pLam-rTB圖譜。符號簡寫說明：Km,康納霉素抗性基因；R6K origin, 大腸桿菌R6K復(fù)制源點；Lambda attP，前嗜菌體（prophage)鑲嵌位置；lambda PR, Pk啟動 子；lambda PL, Plj 啟動子。
[0116] 其次，將受λ PRPL啟動子調(diào)控rpiA-talB基因鑲嵌至步驟3建構(gòu)的菌株 BL21e 的染色體上，因此將協(xié)助型質(zhì)體 pAH121(Haldimann A and Wanner BL.，2001，J Bacteriol·，183:6384-6393)依照前述的"化學(xué)轉(zhuǎn)形法"轉(zhuǎn)形進入大腸桿菌菌株BL-Gf 中，得到菌株BL21e/pAH121 ;接著根據(jù)前述的"質(zhì)體鑲嵌細菌染色體法"，將鑲嵌式質(zhì)體 pLam-rTB再轉(zhuǎn)形入菌株BL21e/pAH121中，進行基因鑲嵌入菌株染色體，以含有康納霉素的 LB固態(tài)培養(yǎng)基來篩選菌株。挑選單一菌落，利用順向引子19和反向引子20,使用前述的 "原位PCR反應(yīng)"來確認染色體鑲嵌一個rpiA-talB基因，經(jīng)挑選出的菌株可增幅出一個受 λ PRPL啟動子調(diào)控rpiA-talB基因片段（徑3)。
[0117] 圖11.DNA電泳圖。徑I :DNA標準物；徑2 :質(zhì)體pLam-rTB ;徑3 :染色體鑲嵌 rpiA-talB基因菌株。
[0118] 最后，根據(jù)前述的"抗抗生素基因移除法"來移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉 素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型質(zhì)體PCP20產(chǎn)生FLP蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個FRT位置后，將抗康 納霉素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基 生長的菌株，重新命名為BL21e-RB。
[0119] 5.剔除大腸桿菌染色體的ldhA、poxB、pta、frdA基因：
[0120] 大腸桿菌主要進行混合酸發(fā)酵，所生產(chǎn)的混合酸或混合酸相關(guān)代謝路徑中生產(chǎn)的 中間代謝物，可能產(chǎn)生回饋抑制五碳糖磷酸代謝的作用，為了免除這個抑制機制，因此將混 合酸生成代謝路徑中的ldhA、p 〇XB、pta、frdA基因逐一剔除。進行步驟如下：
[0121] 5. 1根據(jù)美國國家生物科技信息中心（NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫poxB的核苷酸序列來 合成以下引子：
[0122] 順向引子21:
[0123] (5, -ATTAGAAGCTTGCAGGGGTGAAACGCATCTG)
[0124] 反向引子22:
[0125] (5' -ATTAGACTAGTGGCTGGGTTGATATCAATC)
[0126] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶HindIII的切割位置（如底線所標示者），而反 向引子設(shè)計含有SpeI的切割位置（如底線所標示者）。以大腸桿菌BL21的染色體做為模 板，并以上述兩個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一含有poxB基因的片段（0. 84kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純化后，用限制酵素 HindIII以及 SpeI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回 收；同時利用 High-Speed Plasmid Mini kit 純化質(zhì)體 pMCS-5 (Mo Bi Tec, Germany)，以限 制酵素 HindIII 以及 SpeI 切割，使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將酵素切 割過的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶（T41igase)將上述二個DNA片段黏合后，依照 前述"一般實驗方法"，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5 α中，而得到質(zhì)體pMC-pox。 再依據(jù)美國國家生物科技信息中心（NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫poxB的核苷酸序列來合成以下引 子：
[0127] 順向引子23:
[0128] (5, -ATTAGGAATTCGTGATTGCGGTGGCAATC)
[0129] 反向引子24:
[0130] (5, -ATTAGGTCGACGGTACCAAACTG GCGCAACTGCTG)
[0131] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶EcoRI的切割位置（如底線所標示者），而反向引 子設(shè)計含有Sal I的切割位置（如底線所標示者）。以質(zhì)體pMC-pox做為模板，并以上述兩個 引子進行 PCR 反應(yīng)，增幅出一段DNA 片段（3. 5kb)，以 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純化后，用限制酵素 EcoRI以及Sail切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；同時依據(jù)美國國家生物科技信 息中心（NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫中質(zhì)體 pKD13 (Datsenko K. A. and Wanner B. L.，2000, Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 97:6640-6645)的核苷酸序列來合成以下引子：
[0132] 順向引子25:
[0133] (5, -TTAGGAATTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC)
[0134] 反向引子26:
[0135] (5, -ATTCCGGGGATCCGTCGACC)
[0136] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶EcoRI的切割位置（如底線所標示者），而反向 引子設(shè)計含有Sail的切割位置（如底線所標示者）。以質(zhì)體pKD13做為模板，并以上述兩 個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一段包含一個兩端被FRT位置（sites)鑲夾的抗康納霉素基 因片段（I. 3kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純化 后，用限制酵素 EcoRI 以及 Sail 切割，再使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將酵素切割過的DNA片段回收；接著利用T4黏合酶（T41igase)將上述二個DNA片段黏合 后，依照前述"一般實驗方法"，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5 α中，而得到質(zhì)體 pMC-poxKm，質(zhì)體圖譜如圖12所示。
[0137] 圖12.質(zhì)體pMC-poxKm圖譜。符號簡寫說明：Ap，安培西林抗性基因； ColElorigin,大腸桿菌ColEl復(fù)制源點；poxB-1，poxB基因的N端；poxB-2, poxB基因的C 端；Km，康納霉素抗性基因；FRT，F(xiàn)RT位置。
[0138] 以質(zhì)體pMC-poxKm做為模板，使用順向引子21和反向引子22進行PCR反應(yīng)，增幅 出一段DNA(1. 9kb)，其兩端包含poxB基因 N端及poxB基因 C端的同源區(qū)域，而其中間部分 則包含一個兩端被FRT位置（sites)鑲夾的抗康納霉素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純化。接著，依照前述的"化學(xué)轉(zhuǎn)形法"，將協(xié)助型質(zhì) 體 pKD46 (Datsenko K. A. and Wanner B. L.，2000, Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 97:6640-6645) 轉(zhuǎn)形入步驟4建構(gòu)的菌株BL21e-RB中，得到菌株BL21e-RB/pKD46。依照前述的"電穿孔 法"，準備菌株BL21e-RB/pKD46的勝任細胞，再利用電穿孔法將上述所得的線性DNA送入菌 株BL21e-RB/pKD46中，隨后以SOC培養(yǎng)基于30°C下培養(yǎng)，同時加入ImM阿拉伯糖進行誘導(dǎo) 生產(chǎn)質(zhì)體PKD46上的λ -Red基因，以幫助此增幅出來的線性DNA與染色體poxB基因進行 同源重組（homologous recombination),誘導(dǎo)二小時后，將培養(yǎng)溫度提升到42°C，經(jīng)二小 時后以離心機將細胞離心下來，移除上清液，將細胞涂灑在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng) 基上。隨意挑選生長于固態(tài)培養(yǎng)基的菌落，以順向引子21和反向引子22,使用前述的"原 位PCR反應(yīng)"來確認染色體基因 poxB中所鑲嵌的抗康納霉素基因，挑選出的菌株可增幅出 截斷的poxB基因內(nèi)鑲嵌抗康納霉素基因的DNA片段。最后選擇其中一株菌株，根據(jù)前述的 "抗抗生素基因移除法"來移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型 質(zhì)體PCP20產(chǎn)生FLP蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個FRT位置后，將抗康納霉素基因由菌株染色體 上移除，選擇其中一株無法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基生長的菌株，同時以順向引 子21和反向引子22,使用前述的"原位PCR反應(yīng)"來確認抗康納霉素基因移除后所殘留的 poxB基因片段（圖13,徑3)，獲得的菌株重新命名為BL-Al。
[0139] 圖13. DNA電泳圖。徑I :DNA標準物；徑2 :截斷的poxB基因內(nèi)鑲嵌一個康納霉素 抗性基因；徑3 :康納霉素抗性基因移除后殘留的poxB基因片段。
[0140] 5. 2根據(jù)美國國家生物科技信息中心（NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫pta的核苷酸序列來合 成以下引子：
[0141] 順向引子27:
[0142] (5' -TGTCCAAGCTTATTATGCTGATCCCTACC)
[0143] 反向引子28:
[0144] (5, -GTTCGACTAGTTTAGAAATGCGCGCGTC)
[0145] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶HindIII的切割位置（如底線所標示者），而反向 引子設(shè)計含有SpeI的切割位置（如底線所標示者）。以大腸桿菌BL21的染色體做為模板， 并以上述兩個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一含有pta基因的片段（0. 95kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純化后，用限制酵素 HindIII以及SpeI 切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；同 時利用High-Speed Plasmid Mini kit 純化質(zhì)體 pMCS_5(Mo Bi Tec, Germany)，以限制酵素 HindIII 以及 SpeI 切割，使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將酵素切割過的 DNA片段回收。接著利用T4黏合酶（T41igase)將上述二個DNA片段黏合后，依照前述"一 般實驗方法"，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5ci中，而得到質(zhì)體pMC-pta。再依據(jù) 美國國家生物科技信息中心（NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫pta的核苷酸序列來合成以下引子：
[0146] 順向引子29:
[0147] (5' -ACGATGAATTCCATCAGCACATCTTTCTG)
[0148] 反向引子30:
[0149] (5, -ACCGTGTCGACGGTACCTGATCGCGACTCGTGC)
[0150] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶EcoRI的切割位置（如底線所標示者），而反向引 子設(shè)計含有Sal I的切割位置（如底線所標示者）。以質(zhì)體pMC-pta做為模板，并以上述兩個 引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一段DNA片段（3. 5kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純化后，用限制酵素 EcoRI以及Sail切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；同時依據(jù)美國國家生物科技信 息中心（NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫中質(zhì)體 pKD13 (Datsenko K. A. and Wanner B. L.，2000, Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 97:6640-6645)的核苷酸序列來合成以下引子：
[0151] 順向引子25:
[0152] (5, -TTAGGAATTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC)
[0153] 反向引子26:
[0154] (5, -ATTCCGGGGATCCGTCGACC)
[0155] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶EcoRI的切割位置（如底線所標示者），而反向 引子設(shè)計含有Sail的切割位置（如底線所標示者）。以質(zhì)體pKD13做為模板，并以上述兩 個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一段包含一個兩端被FRT位置（sites)鑲夾的抗康納霉素基 因片段（I. 3kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純化 后，用限制酵素 EcoRI 以及 Sail 切割，再使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將酵素切割過的DNA片段回收；接著利用T4黏合酶（T41igase)將上述二個DNA片段黏合 后，依照前述"一般實驗方法"，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5 α中，而得到質(zhì)體 pMC-ptaKm，質(zhì)體圖譜如圖14所示。
[0156] 圖14.質(zhì)體pMC-ptaKm圖譜。符號簡寫說明：符號簡寫說明：Ap，安培西林抗性基 因；ColElorigin,大腸桿菌ColEl復(fù)制源點；pta-1，pta基因的N端；pta-2，pta基因的C 端；Km，康納霉素抗性基因；FRT，F(xiàn)RT位置。
[0157] 以質(zhì)體pMC-ptaKm做為模板，使用順向引子29和反向引子30進行PCR反應(yīng)， 增幅出一段DNA(1.9kb)，其兩端包含pta基因 N端及C端的同源區(qū)域，而其中間部分則 包含一個兩端被FRT位置（sites)鑲夾的抗康納霉素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純化。接著，依照前述的"化學(xué)轉(zhuǎn)形法"，將協(xié)助型質(zhì) 體 pKD46 (Datsenko K. A. and Wanner B. L.，2000, Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 97:6640-6645) 轉(zhuǎn)形入上述建構(gòu)的菌株BL-Al中，得到菌株BL-Al/pKD46。依照前述的"電穿孔法"，準備 菌株BL-Al/pKD46的勝任細胞，再利用電穿孔法將上述所得的線性DNA送入菌株BL-Al/ PKD46中，隨后以SOC培養(yǎng)基于30°C下培養(yǎng)，同時加入ImM阿拉伯糖進行誘導(dǎo)生產(chǎn)質(zhì)體 PKD46上的λ -Red基因，以幫助此增幅出來的線性DNA與染色體pta基因進行同源重組 (homologous recombination)，誘導(dǎo)二小時后，將培養(yǎng)溫度提升到42°C，經(jīng)二小時后以離心 機將細胞離心下來，移除上清液，將細胞涂灑在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基上。隨意 挑選生長于固態(tài)培養(yǎng)基的菌落，以順向引子29和反向引子30,使用前述的"原位PCR反應(yīng)" 來確認染色體基因 Pta中所鑲嵌的抗康納霉素基因，挑選出的菌株可增幅出截斷的poxB基 因內(nèi)鑲嵌抗康納霉素基因的DNA片段。最后選擇其中一株菌株，根據(jù)前述的"抗抗生素基因 移除法"來移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型質(zhì)體PCP20產(chǎn) 生FLP蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個FRT位置后，將抗康納霉素基因由菌株染色體上移除，選擇其 中一株無法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基生長的菌株，同時以順向引子21和反向引 子22,使用前述的"原位PCR反應(yīng)"來確認抗康納霉素基因移除后所殘留的poxB基因片段 (圖15徑3)，獲得的菌株重新命名為BL-A2。
[0158] 圖15. DNA電泳圖。徑I :DNA標準物；徑2 :截斷的pta基因內(nèi)鑲嵌一個抗康納霉 素抗性基因；徑3 :康納霉素抗性基因移除后殘留的pta基因片段。
[0159] 5. 3根據(jù)EcoCyc基因體數(shù)據(jù)庫中IdhA基因周遭的核苷酸序列來合成以下兩個引 子：
[0160] 順向引子31:
[0161] (5, -TCTTATGAAACTCGCCGTTTATAG)
[0162] 反向引子32:
[0163] (5, -TTAAACCAGTTCGTTCGGGCAG)
[0164] 使用 Wizard Genomic DNA purification kit (Promega Co.)來純化菌株 CGSC9216(E.coli Genetic Stock Center, USA)的染色體，以純化后的染色體為DNA模版 (template)，使用上述兩個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一段DNA(2. 8kb)，其兩端包含IdhA 基因 N端及C端的同源區(qū)域，而其中間部分則包含一個兩端被FRT位置（sites)鑲夾的 抗康納霉素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行 純化。接著，依照前述的"化學(xué)轉(zhuǎn)形法"，將協(xié)助型質(zhì)體pH)46 (Datsenko K.A. and Wanner B. L.，2000, Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 97:6640-6645)轉(zhuǎn)形入上述建構(gòu)的菌株 BL-A2 中，得 到菌株BL-A2/pKD46。依照前述的"電穿孔法"，準備菌株BL-A2/pKD46的勝任細胞，再利用 電穿孔法將上述所得的線性DNA送入菌株BL-A2/pKD46中，隨后以SOC培養(yǎng)基于30°C下培 養(yǎng)，同時加入ImM阿拉伯糖進行誘導(dǎo)生產(chǎn)質(zhì)體PKD46上的λ -Red基因，以幫助此增幅出來 的線性DNA與染色體IdhA基因進行同源重組（homologous recombination)，誘導(dǎo)二小時 后，將培養(yǎng)溫度提升到42°C，經(jīng)二小時后以離心機將細胞離心下來，移除上清液，將細胞涂 灑在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基上。隨意挑選生長于固態(tài)培養(yǎng)基的菌落，完全依照步 驟1的做法，以順向引子3和反向引子4,使用前述的"原位PCR反應(yīng)"來確認染色體基因 IdhA中所鑲嵌的抗康納霉素基因。最后選擇其中一株菌株，根據(jù)前述的"抗抗生素基因移除 法"來移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型質(zhì)體PCP20產(chǎn)生FLP 蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個FRT位置后，將抗康納霉素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株 無法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基生長的菌株，重新命名為BL-A3。
[0165] 5. 4根據(jù)EcoCyc基因體數(shù)據(jù)庫中frdA基因周遭的核苷酸序列來合成以下兩個引 子：
[0166] 順向引子33:
[0167] (5, -GAAAGTCGACGAATCCCGCCCAGG)
[0168] 反向引子34:
[0169] (5, -CAAGAAAGCTTGTTGATAAGAAAGG)
[0170] 使用 Wizard Genomic DNA purification kit (Promega Co.)來純化菌株 CGSC10964(E.coli Genetic Stock Center, USA)的染色體，以純化后的染色體為DNA模版 (template)，使用上述兩個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一段DNA(3. Okb)，其兩端包含frdA 基因 N端及C端的同源區(qū)域，而其中間部分則包含一個兩端被FRT位置（sites)鑲夾的 抗康納霉素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純 化。接著，依照前述的"化學(xué)轉(zhuǎn)形法"，將協(xié)助型質(zhì)體pH)46 (Datsenko K.A. and Wanner B. L.，2000, Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 97:6640-6645)轉(zhuǎn)形入上述建構(gòu)的菌株 BL-A3 中，得 到菌株BL-A3/pKD46。依照前述的"電穿孔法"，準備菌株BL-A3/pKD46的勝任細胞，再利用 電穿孔法將上述所得的線性DNA送入菌株BL-A3/pKD46中，隨后以SOC培養(yǎng)基于30°C下培 養(yǎng)，同時加入ImM阿拉伯糖進行誘導(dǎo)生產(chǎn)質(zhì)體PKD46上的λ -Red基因，以幫助此增幅出來 的線性DNA與染色體frdA基因進行同源重組（homologous recombination)，誘導(dǎo)二小時 后，將培養(yǎng)溫度提升到42°C，經(jīng)二小時后以離心機將細胞離心下來，移除上清液，將細胞涂 灑在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基上。隨意挑選生長于固態(tài)培養(yǎng)基的菌落，完全依照步 驟1的做法，以順向引子3和反向引子4,使用前述的"原位PCR反應(yīng)"來確認染色體基因 IdhA中所鑲嵌的抗康納霉素基因。最后選擇其中一株菌株，根據(jù)前述的"抗抗生素基因移除 法"來移除該菌株染色體上鑲嵌的抗康納霉素基因，經(jīng)溫度誘導(dǎo)協(xié)助型質(zhì)體PCP20產(chǎn)生FLP 蛋白質(zhì)，經(jīng)作用于兩個FRT位置后，將抗康納霉素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株 無法在含有抗康納霉素的LB固態(tài)培養(yǎng)基生長的菌株，重新命名為BL-A4。
[0171] 實施例二：同時發(fā)酵葡萄糖和木糖生產(chǎn)酒精
[0172] 為了驗證本發(fā)明技術(shù)所建構(gòu)的菌株相對于葡萄糖和木糖同時發(fā)酵的效能，在此 以生產(chǎn)酒精為例，但本發(fā)明技術(shù)的運用范圍不以此例為限。根據(jù)前人研究（Ingram LO et al.，1987, Appl. Environ. Microbiol. 53:2420-2425)，將運動發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶 (Zymomonas mobilis pdc)基因、乙醇脫氫酶基因 Il(adhll)基因引介至大腸桿菌中，可使 得大腸桿菌具有生產(chǎn)酒精的能力。
[0173] (一）建構(gòu)質(zhì)體 pND-pet
[0174] 根據(jù)美國國家生物科技信息中心（NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫運動發(fā)酵單胞菌的丙酮酸 脫羧酶（Zymomonas mobilis pdc)基因的核苷酸序列來合成引子：
[0175] 順向引子35:
[0176] (5，-TATACATATGAGTTATACTGTCGGTAC)
[0177] 反向引子36:
[0178] (5，-CCATGGATCCTTATCCTCCTCCGAGGAGCTTG)
[0179] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶NdeI的切割位置（如底線所標示者），而反向 引子設(shè)計含有BamHI的切割位置（如底線所標示者）。以運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)的染色體做為模板，并以上述兩個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一含有pdc基因的片 段（1.7kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純化后，用 限制酵素 NdeI以及BamHI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素 切割過的DNA片段回收；另一方面，根據(jù)美國國家生物科技信息中心（NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫 運動發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因 Π (Zymomonas mobilis adhll)基因的核苷酸序列來合 成引子：
[0180] 順向引子37:
[0181] (5, -ATgTGGATCCAggATATAgCTATGGCTTCTTCAACTTTTTATATT C)
[0182] 反向引子38:
[0183] (5, -AGGACTCGAGTTAGAAAGCGCTCAGGAAGAG)
[0184] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶BamHI的切割位置（如底線所標示者），而反 向引子設(shè)計含有XhoI的切割位置（如底線所標示者）。以運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)的染色體做為模板，并以上述兩個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一含有乙醇脫氫酶 基因 II (adhll 基因）的片段（I. 15kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅 的基因片段進行純化后，用限制酵素 BamHI以及XhoI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；同時利用High-Speed Plasmid Mini kit 純化質(zhì)體 PND707 (Love CA et al·，1996, Gene, 176:49-53)，以限制酵素 NdeI 以及 XhoI 切 害!]，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收。接著利 用T4黏合酶（T41igase)將上述三個DNA片段黏合后，依照前述"一般實驗方法"，將DNA黏 合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5a中，而得到質(zhì)體pND-pet，質(zhì)體圖譜如圖16所示。
[0185] 圖16.質(zhì)體pND-pet圖譜。符號簡寫說明：bla，安培西林抗性基因；CI857,抑制 子；lambda PR, Pr 啟動子；lambda PL, Plj 啟動子。
[0186] 依照前述的"化學(xué)轉(zhuǎn)形法"，將質(zhì)體pND-pet逐一轉(zhuǎn)形入原生型菌株BL21、實施例 一中步驟1建構(gòu)的菌株BL-G、實施例一中步驟2建構(gòu)的菌株BL-Gf、實施例一中步驟4建構(gòu) 的菌株BL21e-RB、及實施例一中步驟5. 4建構(gòu)的菌株BL-A4中，而依序獲得重組菌株BL21/ pND-pet、BL-G/pND-pet、BL-Gf/pND-pet、BL21e_RB/pND_pet、BL_A4/pND_pet。
[0187] (二）葡萄糖和木糖發(fā)酵生產(chǎn)酒精
[0188] 從固態(tài)培養(yǎng)基中分別選取重組菌株BL21/pND_pet和BL-G/pND-pet單一菌落，各 培養(yǎng)于含有安培西林抗生素的LB培養(yǎng)液（5mL)的搖瓶中，以30°C、200rpm培養(yǎng)隔夜后，接 種至含有安培西林抗生素的新鮮LB外加3%葡萄糖與3%木糖培養(yǎng)液（25mL)中，使得搖 瓶中的初始細胞密度達到0D550 = 2. 0,接著于37°C、150rpm下進行繼代培養(yǎng)，隨著發(fā)酵時 間取樣分析，其中葡萄糖、木糖和酒精濃度則依據(jù)"一般實驗方法"來測量。發(fā)酵結(jié)果如圖 17所示，菌株BL21/pND-pet可快速代謝葡萄糖，卻完全無法消耗木糖，當發(fā)酵時間結(jié)束后， 生產(chǎn)的酒精達I. 7% (圖18);相對的是，當大腸桿菌的PtsG基因被剔除時（即重組菌株 BL-G/pND-pet)，菌株BL-G/pND-pet可以同時消耗葡萄糖及木糖，不過木糖和葡萄糖的消 耗速率皆緩慢（圖17)，當發(fā)酵時間結(jié)束后，則可生產(chǎn)2. 2%酒精（圖18)。
[0189] 圖17.重組菌株BL21/pND_pet和BL-G/pND-pet的混合糖消耗曲線。符號：（·） 菌株BL21/pND-pet的葡萄糖消耗；（〇）菌株BL21/pND-pet的木糖消耗；（)菌株BL-G/ pND-pet的葡萄糖消耗；（□)菌株BL-G/pND-pet的木糖消耗。
[0190] 圖18.重組菌株BL21/pND-pet和BL-G/pND-pet發(fā)酵混合糖生產(chǎn)酒精曲線。符號： 符號：（·）菌株 BL21/pND-pet ;()菌株 BL-G/pND-pet。
[0191] 依照上述的搖瓶培養(yǎng)方法，以含有3%葡萄糖與3%木糖的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)重組菌 株BL-Gf/pND-pet和BL21e-RB/pND-pet，并隨著發(fā)酵時間取樣分析，其中葡萄糖、木糖和酒 精濃度則依據(jù)"一般實驗方法"來測量。發(fā)酵結(jié)果如圖19所示：
[0192] 圖19.重組菌株BL-Gf/pND-pet和BL21e-RB/pND_pet的混合糖消耗曲線。符號： (·)菌株BL-Gf/pND-pet的葡萄糖消耗；（〇）菌株BL-Gf/pND-pet的木糖消耗；（) 菌株BL21e_RB/pND_pet的葡萄糖消耗；（□)菌株BL21e_RB/pND_pet的木糖消耗。
[0193] 當運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)的葡萄糖促進基因 （glucose facilitator gene)glf引介到大腸桿菌中（即菌株BL-Gf/pND-pet),即可強補菌株缺乏 PtsG基因而導(dǎo)致葡萄糖代謝緩慢的問題，可于14小時內(nèi)將3%葡萄糖消耗完畢，而于發(fā)酵 時間結(jié)束后，則只能消耗掉1.8%的木糖，生產(chǎn)的酒精達2.3% (圖20)。此外，進一步加強 菌株五碳糖磷酸代謝路徑中的rpiA、tktA、rpe和talB(即菌株BL21e_RB/pND_pet)，其葡 萄糖的消耗速率大致與菌株BL-Gf/pND-pet相同，然其木糖消耗速率則增快，當發(fā)酵時間 結(jié)束后，可以消耗2. 3%的木糖，并能生產(chǎn)2. 7%酒精（圖20)。
[0194] 圖20.重組菌株BL21/pND_pet和BL-G/pND-pet發(fā)酵混合糖生產(chǎn)酒精曲線。符號： 符號：（·）菌株 BL21/pND-pet ;()菌株 BL-G/pND-pet。
[0195] 最后，依照上述的搖瓶培養(yǎng)方法，以含有3%葡萄糖與3%木糖的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)重 組菌株BL-A4/pND-pet，并隨著發(fā)酵時間取樣分析，其中葡萄糖、木糖和酒精濃度則依據(jù)"一 般實驗方法"來測量。發(fā)酵結(jié)果如圖21所示，進一步將大腸桿菌中產(chǎn)生其他有機酸的基因 如1(11^、口(《13、口七3、;1^(^基因剃除（即菌株1^-44/^冊161:)后，重組菌株可以十分快速的 同時代謝葡萄糖和木糖，并在12小時內(nèi)將3%葡萄糖消耗完畢，在17小時內(nèi)將3%木糖消 耗完畢；另如圖22所示，當發(fā)酵時間結(jié)束后，生產(chǎn)的酒精達2. 9%，轉(zhuǎn)化率高達98%以上。 以生產(chǎn)酒精為例，這個結(jié)果顯示，基于本發(fā)明技術(shù)來基因改質(zhì)的菌株（即菌株BL-A4)，具有 同時且快速代謝葡萄糖與木糖的能力。
[0196] 圖21重組菌株BL-A4/pND-pet的混合糖消耗曲線。符號：（·）葡萄糖消耗；（〇） 木糖消耗。
[0197] 圖22.重組菌株BL-A4/pND-pet發(fā)酵混合糖生產(chǎn)酒精曲線。
[0198] 實施例三：同時發(fā)酵葡萄糖和木糖生產(chǎn)乳酸
[0199] 為了驗證本發(fā)明技術(shù)所建構(gòu)的菌株的于葡萄糖和木糖同時發(fā)酵的效能，在此另 以生產(chǎn)乳酸為例，但本發(fā)明技術(shù)的運用范圍不局限于此例。
[0200] ( 一）建構(gòu)質(zhì)體 pTrc-H/D-Ldh
[0201] 根據(jù)美國國家生物科技信息中心（NCBI)基因體數(shù)據(jù)庫大腸桿菌IdhA基因的核苷 酸序列來合成引子：
[0202] 順向引子39:
[0203] (5, -AGCTCCATGGAACTCGCCGTTTATAGCAC)
[0204] 反向引子40:
[0205] (5, -AGCGAAGCTTAAACCAGTTCGTTCGGGCAG)
[0206] 上述順向引子被設(shè)計含有限制酶NcoI的切割位置（如底線所標示者），而反向引 子設(shè)計含有HindIII的切割位置（如底線所標示者）。以大腸桿菌BL21的染色體做為模 板，并以上述兩個引子進行PCR反應(yīng)，增幅出一含有IdhA基因的片段（Ikb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅的基因片段進行純化后，用限制酵素 NcoI以及HindIII 切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收； 另一方面，利用 High-Speed Plasmid Mini kit 純化質(zhì)體 pTrc99A (National Institute of Genetics, Japan)，以限制酵素 NcoI 以及 HindIII 切割，使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶（T41igase)將上述二 個DNA片段黏合后，依照前述"一般實驗方法"，將DNA黏合產(chǎn)物轉(zhuǎn)形入大腸桿菌菌株DH5 α 中，而得到質(zhì)體pTrc-H/D-Ldh，質(zhì)體圖譜如圖23所示。接著依照前述的"化學(xué)轉(zhuǎn)形法"，將 質(zhì)體pTrc-H/D-Ldh轉(zhuǎn)形入實施例一中步驟5. 4建構(gòu)的菌株BL-A4中，而得到菌株BL-A4/ pTrc-H/D-Ldh。
[0207] 圖23.質(zhì)體pTrc-H/D-ldh圖譜。符號簡寫說明：bla，安培西林抗性基因； pMBlori，大腸桿菌pMBl復(fù)制源點；IacIQ,抑制子IacI ;trc promoter, trc啟動子。
[0208] (二）葡萄糖和木糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸
[0209] 從固態(tài)培養(yǎng)基中分別選取重組菌株BL-A4/pTrc-H/D_Ldh單一菌落，培養(yǎng)于含有 安培西林抗生素的LB培養(yǎng)液（5mL)的搖瓶中，以37°C、200rpm培養(yǎng)隔夜后，接種至含有安 培西林抗生素的新鮮LB外加1%葡萄糖與1%木糖培養(yǎng)液（25mL)中，使得搖瓶中的初始細 胞密度達到0D550 = 0. 1，接著于37°C、150rpm下進行繼代培養(yǎng)，待細胞密度達到0D550 = 〇· 3 時，加入 300 μ M Isopropyl β -D-l-thiogalactopyranoside (IPTG)誘導(dǎo)質(zhì)體 pTrc-H/ D-Ldh的IdhA基因生產(chǎn)，隨著發(fā)酵時間取樣分析，其中葡萄糖、木糖、乳酸和有機酸濃度則 依據(jù)"一般實驗方法"來測量。發(fā)酵結(jié)果如圖24所示，菌株BL-A4/pTrc-H/D-Ldh可同時代 謝葡萄糖和木糖，而生產(chǎn)的乳酸亦隨發(fā)酵時間逐漸累積增加，當發(fā)酵48小時后，可生產(chǎn)約 160mM乳酸，幾乎無其他有機酸的生成。以生產(chǎn)乳酸為例，這個結(jié)果顯示，基于本發(fā)明技術(shù)來 基因改質(zhì)的菌株（即菌株BL-A4)，具有同時且快速代謝葡萄糖與木糖的能力。
[0210] 圖24. BL-A4/pTrc-H/D-Ldh的混合糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸曲線。符號：（·）葡萄糖消 耗；（▽)木糖消耗；（)乳酸。
【權(quán)利要求】
1. 一種使大腸桿菌可同時發(fā)酵五碳糖與六碳糖的方法，其特征在于，包含下列步驟： A. 剔除一大腸桿菌中的一 ptsG基因序列； B. 導(dǎo)入一 gif基因序列至該大腸桿菌； C. 導(dǎo)入一五碳糖代謝基因序列至該大腸桿菌，所述的該五碳糖代謝基因序列是一 rpiA基因序列、一 tktA基因序列、一 rpe基因序列、一 talB基因序列或其組合；以及 D. 剔除該大腸桿菌中的一有機酸代謝基因序列，所述的該有機酸代謝基因序列是一 ldhA基因序列、一 pta基因序列、一 poxB基因序列、一 frdA基因序列或其組合。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該gif?基因序列是運動發(fā)酵單胞菌的gif 基因序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該gif基因序列是導(dǎo)入至該大腸桿菌的染 色體中。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該gif基因序列是導(dǎo)入至一第一重組型質(zhì) 體中，而該第一重組型質(zhì)體又進一步導(dǎo)入至該大腸桿菌中。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該五碳糖代謝基因序列的上游包含一 入PA啟動子。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該五碳糖代謝基因序列是導(dǎo)入至一第二 重組型質(zhì)體中，而該第二重組型質(zhì)體又進一步導(dǎo)入至該大腸桿菌中。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進一步包含以下步驟： E. 導(dǎo)入一 pdc基因序列與一 adhll基因序列至該大腸桿菌。
8. -種同時代謝五碳糖與六碳糖的工程菌，其特征在于，該工程菌是經(jīng)下述基因工程 的一大腸桿菌： A. 剔除該大腸桿菌中的一 ptsG基因序列； B. 導(dǎo)入一 gif基因序列至該大腸桿菌； C. 導(dǎo)入一五碳糖代謝基因序列至該大腸桿菌，所述的該五碳糖代謝基因序列是一 rpiA基因序列、一 tktA基因序列、一 rpe基因序列、一 talB基因序列或其組合；以及 D. 剔除該大腸桿菌中的一有機酸代謝基因序列，所述的該有機酸代謝基因序列是一 ldhA基因序列、一 pta基因序列、一 poxB基因序列、一 frdA基因序列或其組合。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的工程菌，其特征在于，該五碳糖代謝基因序列包含一第一組 基因序列，而該第一組基因序列包含一 rpe基因序列與一 tktA基因序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的工程菌，其特征在于，該五碳糖代謝基因序列又進一步包含 一第二組基因序列，而該第二組基因序列包含一 rpiA基因序列與一 talB基因序列。
【文檔編號】C12N1/21GK104403983SQ201410616186
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月16日
【發(fā)明者】趙云鵬, 姜中人, 李泓旻, 王祉雯, 陳柏庭 申請人:逢甲大學(xué)