一個與普通菜豆抗炭疽病基因位點緊密連鎖的分子標記及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個與普通菜豆抗炭疽病基因位點緊密連鎖的分子標記及其檢測方法。該分子標記由SEQ ID No.1所示和SEQ ID No.2所示的DNA分子組成。結果表明：采用此分子標記對待測普通菜豆的基因組DNA進行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小可以有效檢測出待測普通菜豆是否抗菜豆炭疽病。該方法將會加速抗炭疽病新品種的選育進程，提高抗病育種效率、減少農藥防治炭疽病造成的環(huán)境污染，同時節(jié)約種植成本，具有明顯的經(jīng)濟效益、生態(tài)效益。
【專利說明】-個與普通菜豆抗炭疸病基因位點緊密連鎖的分子標記及 其檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體涉及一個與普通菜豆抗炭疽病基因位點緊密連鎖 的分子標記及其檢測方法。

【背景技術】
[0002] 普通菜豆（Phaseolus vulgaris L.)是全世界重要的食用豆類之一，含有豐富的 蛋白質、淀粉、礦物質和多種維生素等。普通菜豆作為我國主要的雜糧作物，種植區(qū)域廣泛， 但是在生產(chǎn)上經(jīng)常受到菜豆炭疽病的危害，炭疽病病原菌通過種子進而侵染植株整個地上 部分，危害菜豆的葉片、莖、莢等，在冷涼潮濕的環(huán)境下尤為嚴重，減產(chǎn)30%?90%，流行年 份植株萎蔫枯死，嚴重影響著普通菜豆的品質和產(chǎn)量。迄今為止，已經(jīng)定位到20個炭疽病 基因或QTL，但是缺乏有效應用于抗病育種的分子標記。因此，發(fā)掘抗病資源、開發(fā)抗病標記 和克隆抗病基因對于提高菜豆的產(chǎn)量具有非常重要的意義。


【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的引物對。
[0004] 本發(fā)明提供的用于檢測普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的引物對由SEQ ID No. 1所示 和SEQ ID No. 2所示的DNA分子組成。
[0005] 上述所述的引物對在檢測或輔助檢測普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的應用也是 本發(fā)明的保護范圍。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測或輔助檢測普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的 試劑盒。
[0007] 本發(fā)明提供的試劑盒包含上述所述的引物對。
[0008] 上述所述的試劑盒在檢測或輔助檢測普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的應用也是 本發(fā)明的保護范圍。
[0009] 本發(fā)明最后一個目的是提供一種檢測或輔助檢測普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的 方法。
[0010] 上述所述的檢測或輔助檢測普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的方法包括如下步驟：
[0011] (1)提取待測普通菜豆的基因組DNA ;
[0012] (2)以所述基因組DNA為模板，采用SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 2所示的DNA 分子為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；若擴增產(chǎn)物大小為273bp，則待檢測的普通 菜豆為抗炭疽??；若擴增產(chǎn)物大小為406bp，則表明待測的普通菜豆為感炭疽病。
[0013] 上述方法中，所述抗炭疽病為病情指數(shù)小于等于60,所述感炭疽病為病情指數(shù)大 于60。
[0014] 上述方法中，所述病情指數(shù)按照現(xiàn)有技術常規(guī)方法得到，具體可按如下方法得 到：
[0015] DI =Σ (CiXNi)/9N，其中DI為病情指數(shù)；Ci為單株發(fā)病級別；Ni為各級別植株 數(shù)；N為總株數(shù)。單株發(fā)病級別分為6級：0級，全株無癥狀表現(xiàn)；1級，葉片上有針尖大小病 斑；3級，葉片上病斑面積小于10% ;5級，葉片上病斑面積小于25% ;7級，葉片上病斑面積 50% ;9級，葉片萎蔫枯死。
[0016] 根據(jù)病情指數(shù)將普通菜豆對炭疽病的抗性劃分為5個等級：高抗（HR)(病情指數(shù) 彡2. 0);抗（R) (2. 0〈病情指數(shù)彡15. 0)沖抗（MR) (15. 0〈病情指數(shù)彡60. 0);感（S) (60. 0〈 病情指數(shù)彡80. 0);高感（HS)(病情指數(shù)>80. 0)。
[0017] 上述所述的方法在檢測或輔助檢測普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的應用也屬于 本發(fā)明的保護范圍。
[0018] 本發(fā)明提供了一個與普通菜豆抗炭疽病基因位點緊密連鎖的分子標記及其檢測 方法。結果表明：采用分子標記SNP+In/Del/Pr 〇7對待測普通菜豆的基因組DNA進行PCR擴 增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小可以有效檢測出待測普通菜豆的抗感炭疽病品種。該方法將會加 速抗炭疽病新品種的選育進程，提高抗病育種效率、減少農藥防治炭疽病造成的環(huán)境污染， 同時節(jié)約種植成本，具有明顯的經(jīng)濟效益、生態(tài)效益。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為SNP+In/Del/Pr〇7標記引物對兩個親本紅蕓豆和京豆擴增產(chǎn)物測序后的序 列比對結果。
[0020] 圖 2 為 SNP+In/Del/Pro7 標記在雜交組合 R)0002322XR)0005600 的 F2 分離群體 中的擴增。
[0021] 圖3為SNP+In/Del/Pro7標記在普通菜豆10份抗病材料和8份感病材料中的擴 增。

【具體實施方式】
[0022] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0023] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0024] 實施例1、分子標記SNP+In/Del/Pro7的獲得
[0025] 1、供試材料
[0026] 普通菜豆高抗炭疽病種質紅蕓豆，統(tǒng)一編號：F00002322 ;感炭疽病種質京豆， 統(tǒng)一編號：F00000777 ;以及其雜交F2:3群體。以上材料均來源于中國農業(yè)科學院作物 科學研究所，在文獻"Mingli Chen，Jing Wu，Lanf eng Wang, Xiaoyan Zhang, Matthew ff.Blair, Jizeng Jia, Shumin Wang. Development of mapped simple sequence repeat markers from common bean (Phaseolus vulgaris L. ) based on genome sequences of a Chinese landrace and diversity evaluation. Molecular breeding 201433:489-496"中 公開過。
[0027] 2、普通菜豆對炭疽病抗性鑒定
[0028] 對親本R)0002322、R)0000777及1，092個F2:3家系（每個F 2:3家系取30粒種子） 植株播種后，待植株三出復葉完全展開時，采用高壓噴霧接種法對整株進行苗期接種鑒定。 于人工氣候室溫度20?22°C，濕度95?100%條件下培養(yǎng)，7天后調查發(fā)病情況。
[0029] 利用F2:3家系抗病表型推測F2群體的基因型。每個F 2:3家系的30個單株表現(xiàn)全 部抗病，對應F2單株基因型與母本一致；30個單株表現(xiàn)全部感病，對應F 2單株基因型與父 本一致；30個單株表現(xiàn)抗、感分離，對應F2單株基因型為雜合型。
[0030] 3、SSR標記與抗病基因的連鎖分析
[0031] 根據(jù)初步的定位結果，參照普通菜豆基因組序列（http://www. phytozome. net/ search, php)，利用Primer Premier 5.0軟件在候選區(qū)段共開發(fā)了 282對SSR分子標記。分 別以抗、感病親本及分離群體中的抗、感池 DNA為模板，篩選282對SSR分子標記發(fā)現(xiàn)，其中 32對標記在抗、感病親本及分離群體中的抗、感池 DNA中同時表現(xiàn)多態(tài)性。
[0032] 利用32對多態(tài)性引物對群體進行遺傳作圖分析，利用軟件Mapmarker 3. 0中 Kosambi法計算位點間的距離，分析位于SSR標記與F2群體單株基因型間遺傳連鎖關 系；MapDrawV2. 1軟件進行連鎖圖譜繪制。結果顯示：標記PSSR0771和PSSR0869與基因 Co-2322緊密連鎖，標記之間的位置PSSR0771-C〇-2322-PSSR0869,遺傳距離分別為0. 2cM 和 0. 4cM。
[0033] 4、篩選與抗炭疽病基因共分離的分子標記
[0034] 進一步將標記PSSR0771和PSSR0869序列搜索普通菜豆全基因組序列數(shù)據(jù)庫 (http ://www. phytozome. net/search, php)，顯示兩個標記之間的序列長度為 76, 622bp，依 據(jù)76, 622bp的序列設計特異性標記在抗、感親本中進行序列擴增，基于序列差異開發(fā)了 3 個In/Del標記Clp-Nl、TFUPlcl用于精細定位（表1)。
[0035] 表1、In/Del分子標記序列
[0036]

【權利要求】
1. 一種用于檢測普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的引物對； 所述引物對由SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 2所示的DNA分子組成。
2. 權利要求1所述的引物對在檢測或輔助檢測普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的應用。
3. -種檢測或輔助檢測普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的試劑盒，該試劑盒包含權利要求 1所述的引物對。
4. 權利要求3所述的試劑盒在檢測或輔助檢測普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的應用。
5. -種檢測或輔助檢測普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的方法，包括如下步驟： (1)提取待測普通菜豆的基因組DNA ; ⑵以所述基因組DNA為模板，采用SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 2所示的DNA分子 為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；若擴增產(chǎn)物大小為273bp，則待檢測的普通菜豆 為抗炭疽病品種；若擴增產(chǎn)物大小為406bp，則表明待測的普通菜豆為感炭疽病品種。
6. 權利要求5所述的方法在檢測或輔助檢測普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104313143SQ201410549437
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月16日 優(yōu)先權日:2014年10月16日
【發(fā)明者】王述民, 陳明麗, 武晶, 王蘭芬, 朱振東 申請人:中國農業(yè)科學院作物科學研究所