一種ɑ-角蛋白底物特異性提高的角蛋白酶機(jī)器構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種ɑ-角蛋白(羊毛鱗片)的底物特異性提高的角蛋白酶及其應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明采用定點(diǎn)突變技術(shù)將地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis BBE11-1的角蛋白酶(ker)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變并克隆連接到枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pMA5，轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis WB600，經(jīng)純化驗(yàn)證得到一株可以產(chǎn)具有較好ɑ-角蛋白底物特異性的角蛋白酶的重組枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600-pMA5-kerMA，該菌株表達(dá)的角蛋白酶在對(duì)天青角蛋白(ɑ-角蛋白)的比酶活較野生型增加了50％。同時(shí)突變體較野生型角蛋白酶具有更好的羊毛織物防氈縮效果，這為角蛋白酶的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種α-角蛋白底物特異性提高的角蛋白酶機(jī)器構(gòu)建方法 和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種α_角蛋白（羊毛鱗片）的底物特異性提高的重組角蛋白酶及其 構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于遺傳工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 角蛋白酶（Keratinase)是一種可以特異性降解角蛋白的酶類(lèi)，由細(xì)菌、放線菌和 真菌等多種微生物產(chǎn)生。角蛋白酶可以將羽毛角蛋白轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白以及氨基酸，可以 代替糧食作物作為飼料喂養(yǎng)家禽。另外，角蛋白酶處理方法也可以應(yīng)用在紡織物處理上取 代污染較嚴(yán)重的化學(xué)處理方法進(jìn)而在保護(hù)環(huán)境的前提下改善織物的性能。同樣，角蛋白酶 在其他領(lǐng)域如清潔劑、醫(yī)藥、化妝品、皮革等行業(yè)也具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 羊毛是一種α-角蛋白，其蛋白組成形式主要為α螺旋，并含有較高含量的半胱氨 酸殘基（10.5-17%)形成二硫鍵。同時(shí)，羊毛鱗片蛋白還具有較高含量的精氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸和賴(lài)氨酸，眾多的二硫鍵結(jié)構(gòu)與賴(lài)氨酸和谷氨酸形成的離子鍵結(jié)構(gòu)使得羊毛鱗 片十分牢固因此很難被降解。由于羊毛鱗片是造成羊毛織物氈縮的主要原因，因此角蛋白 酶能否對(duì)鱗片進(jìn)行有效降解是評(píng)價(jià)該酶防氈縮應(yīng)用價(jià)值的主要指標(biāo)。
[0004] 來(lái)源于地衣芽胞桿菌的角蛋白酶與subtilisin ΒΡΝ' 一樣，具有較廣的底物特異 性。根據(jù)與底物結(jié)合位置的不同角蛋白酶底物結(jié)合區(qū)域可以分為SI、S2、S3、S4、SI'、S2'、 S3'，其中起主要作用的為S1和S4底物結(jié)合區(qū)域，分別與底物的P1和P4位置殘基相連。 雖然角蛋白酶催化中心直接作用于與S1結(jié)合區(qū)域結(jié)合的底物P1位置的殘基，但研究發(fā)現(xiàn) S4底物結(jié)合區(qū)域?qū)Φ孜锏钠眯耘cS1結(jié)合區(qū)域一樣同等重要。因此，本發(fā)明通過(guò)對(duì)角蛋白 酶S4底物結(jié)合區(qū)域進(jìn)行改造，提高了角蛋白酶對(duì)α-角蛋白的底物特異性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種對(duì)α-角蛋白（羊毛鱗片）的底物特異性提 高的角蛋白酶，其是對(duì)現(xiàn)有的角蛋白酶S4底物結(jié)合區(qū)域進(jìn)行定點(diǎn)突變。
[0006] 所述角蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] AQTVPYGIPLIKADKVQAQGFKGANVKVAVLDTGIQASHPDLNVVGGASFVAGEAYNTDGNGHGTHVAG TVAALDNTTGVLGVAPSVSLYAVKVLNSSGSGSYSGIVSGIEWATTNGMDVINMSLGGASGSTAAKQAVDNAYARGV VVVAAAGNSGSSGNTNTIGYPAKYDSVIAVGAVDSNSNRASFSSVGAELEVMAPGAGVYSTYPTNTYATLNGTSMAS PHVAGAAALILSKHPNLSASQVRNRLSSTATYLGSSFYYGKGLINVEAAAQ
[0008] 本發(fā)明還提供了一種獲得所述角蛋白酶的方法，其特征在于以GenBank登錄號(hào)為 JX504681公布的基因序列基礎(chǔ)上，對(duì)角蛋白酶S4底物結(jié)合區(qū)域進(jìn)行分子改造，具體將134 為Met替換為Ala。
[0009] 產(chǎn)所述產(chǎn)角蛋白酶的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也為本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0010] 本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種構(gòu)建產(chǎn)角蛋白酶的基因工程菌的構(gòu) 建方法，具體包括如下步驟：
[0011] 1)采用化學(xué)全合成或PCR方法克隆GenBank登錄號(hào)為JX504681 ;
[0012] 2)將步驟1)獲得的角蛋白酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，將134位Met替換為Ala，
[0013] 連接到枯草桿菌表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體；
[0014] 3)將步驟2)獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis WB600得到基因工程 菌。
[0015] 所述表達(dá)載體優(yōu)選pMA5。
[0016] 應(yīng)用上述產(chǎn)角蛋白酶基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的方法，將其斜面活化制備種 子后，以3%的接種量轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于37°C、200rpm條件下培養(yǎng)24h。
[0017] 所述基本發(fā)酵培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨l〇g/L，酵母抽提物5g/L，NaC110g/L，葡萄 糖 10g/L，MgS04 0· lg/L。
[0018] α-角蛋白活力測(cè)定方法：將發(fā)酵液離心10min(10000Xg，4°C )取發(fā)酵上清液，吸 取500uL適當(dāng)稀釋的酶液，加入2. 5mL0. 05mol/L gly-NaOH緩沖液（pH9. 0)溶解1%的底物 (天青角蛋白），50°C培養(yǎng)60min，加入2mL4M TCA溶液以終止反應(yīng)。離心lOmin，吸取上清 液移入到新的試管中?？瞻诪樵诩尤朊敢旱耐瑫r(shí)，加入500uL TCA溶液，經(jīng)過(guò)相同過(guò)程反應(yīng) 的過(guò)濾清液作為空白。在595nm處檢測(cè)吸光值，與空白相比較在595nm處每增加0. 01吸光 度定義為一個(gè)酶活單位。
[0019] 本發(fā)明采用定點(diǎn)突變技術(shù)將地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis BBE11-1 的角蛋白酶（ker)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變并克隆連接到枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pMA5,轉(zhuǎn)化 Bacillus subtilis WB600,經(jīng)純化驗(yàn)證得到一株可以產(chǎn)具有較好α-角蛋白底物特異性的 角蛋白酶的重組枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600-pMA5-kerMA，該菌株表達(dá)的角蛋 白酶在對(duì)天青角蛋白（α_角蛋白）的比酶活較野生型增加了 50%。同時(shí)突變體較野生型角 蛋白酶具有更好的羊毛織物防氈縮效果，這為角蛋白酶的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1 :野生型角蛋白酶與突變體SDS-PAGE圖
[0021] M :Marker ;泳道 1-4 :野生型，Ι106Α, Μ134Α, Υ103Α。
[0022] 圖2 :野生型與突變體角蛋白酶酶解后氨基酸分析。
[0023] 圖3 :野生型與突變體角蛋白酶XPS分析。
[0024] 圖4 :野生型及突變體角蛋白酶對(duì)羊毛防氈縮效果的影響。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 實(shí)施例1 α-角蛋白底物特異性提高的角蛋白酶
[0026] 本發(fā)明的角蛋白酶是在GenBank accession nos. JX504681公布的基因序列基 礎(chǔ)上，對(duì)S4底物結(jié)合區(qū)域進(jìn)行分子改造，具體將134為Met替換為Ala。其獲得方法為以 GenBank accession nos. JX504681公布的基因?yàn)槌霭l(fā)基因，通過(guò)化學(xué)全合成或定點(diǎn)突變的 方式進(jìn)行氨基酸的取代。
[0027] 實(shí)施例2產(chǎn)角蛋白酶基因工程菌的構(gòu)建及鑒定
[0028] 構(gòu)建產(chǎn)角蛋白酶基因工程菌的步驟如下：
[0029] 1)以pMAS-ker為模板，采用PCR方法或化學(xué)全合成方法獲得ker基因突變子 kerTB ；
[0030] 2)S4底物結(jié)合區(qū)域的分子改造：Ilel06以及Metl34分別位于S4底物結(jié)合區(qū)域的 兩個(gè)不同位置的低端，其直接決定著S4結(jié)合區(qū)域的大小。同時(shí)，Tyrl03被證明是另外一個(gè) 決定S4區(qū)域大小的重要位置的氨基酸殘基。為了保證S4結(jié)合區(qū)域的疏水框架結(jié)構(gòu)，分別 引入四個(gè)突變體來(lái)增大（Ι1〇6Α、Μ134Α和Y103A)和減?。↖106F)S4底物結(jié)合區(qū)域。
[0031] PCR方法突變引物序列如下：
[0032]

【權(quán)利要求】
1. 一種對(duì)α-角蛋白底物特異性提高的角蛋白酶，其特征在于對(duì)現(xiàn)有的決定角蛋白酶 底物特異性的S4底物結(jié)合區(qū)域進(jìn)行定點(diǎn)突變，通過(guò)對(duì)決定S4底物結(jié)合區(qū)域小的關(guān)鍵位點(diǎn) 氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，提高了角蛋白酶對(duì)α-角蛋白的底物特異性。
2. 如權(quán)利要求1所述的角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 權(quán)利要求1所述的角蛋白酶，其特征在于以GenBank登錄號(hào)為JX504681公布的基因 序列基礎(chǔ)上，對(duì)S4底物結(jié)合區(qū)域進(jìn)行分子改造，具體為將134為Met替換為Ala。
4. 產(chǎn)權(quán)利要求1-3任一所述產(chǎn)角蛋白酶的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
5. -種構(gòu)建產(chǎn)權(quán)利要求1或3所述角蛋白酶的基因工程菌的方法，其特征在于包括如 下步驟： 1) 采用化學(xué)全合成或PCR方法克隆GenBank登錄號(hào)為JX504681 ; 2) 將步驟1)獲得的角蛋白酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，將134位Met替換為Ala，連接到枯 草桿菌表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體； 3) 將步驟2)獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis WB600得到基因工程菌。
6. 權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述表達(dá)載體為pMA5。
7. -種發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的方法，其特征在于以權(quán)利要求5獲得的產(chǎn)角蛋白酶基因工 程菌為生產(chǎn)菌株，斜面活化制備種子后，以3%的接種量轉(zhuǎn)入已優(yōu)化的基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于 37 °C、200rpm條件下培養(yǎng)24h。
8. 權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于基本發(fā)酵培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨10g/L，酵母抽 提物 5g/L，NaC110g/L，葡萄糖 10g/L，0. lg/L MgS04。
【文檔編號(hào)】C12N9/56GK104232610SQ201410467083
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 劉柏宏, 張娟, 堵國(guó)成, 方真 申請(qǐng)人:江南大學(xué)