輻抗肽突變蛋白及其在降低炎癥反應(yīng)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了輻抗肽突變蛋白及其在降低炎癥反應(yīng)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)突變輻抗肽蛋白可以降低輻抗肽蛋白引起的驗證反應(yīng)，將輻抗肽第292位亮氨酸突變，其主要參與結(jié)合NLRs，降低輻抗肽與NLR的結(jié)合能力，進而降低了動物注射輻抗肽后NLR通路介導(dǎo)的炎癥性反應(yīng)，但是并未明顯降低TLR5介導(dǎo)的抗輻射生物學活性。
【專利說明】輻抗肽突變蛋白及其在降低炎癥反應(yīng)中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種輻抗肽突變蛋白及其在降低炎癥反應(yīng)中 的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] Toll樣受體（Toll-like receptor, TLR)家族在機體內(nèi)參與天然免疫過程，是 一種微生物介導(dǎo)的先天免疫受體家族。它能夠通過特異性識別細菌、病毒等病原體相 關(guān)分子模式活化 NF-kB 信號通路（Takeda K，et al.Toll-like receptors.Annu Rev Immunol, 2003, 21:335-376. Medzhitov R. Approaching the asymptote:20year later. Immunity, 2009, 3:766-775.)。TLR是Lemaitre等人在1996年研究果蠅過程中發(fā)現(xiàn)其在參 與由真菌感染引起的免疫應(yīng)答過程并且發(fā)揮重要作用。目前研究表明，在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 11 個TLRs家族成員，并且主要表達于免疫細胞等，揭示了大部分成員的特異性配體多為微生 物組分（Miggin SM, O'Neill LA. New insights into the regulation of TLR signaling. J Leukoc Biol, 2006, 80 (2) :220-226. )。TLR5 作為 TLRs 家族中一員，其唯一配體為細菌 的鞭毛蛋白，TLR5高表達于單核巨噬細胞、胃腸道上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞及肺上皮細胞 的細胞表面。近期研究表明，細菌鞭毛蛋白能夠顯著提高致死計量照射下小鼠的存活率， 并且初步證明這一防福射功能是通過激活TLR5-NF-K B信號通路而實現(xiàn)的（Burdelya, L. G. , et al. An agonist of toll-like receptor5has radioprotective activity in mouse and primate models. Science, 2008, 320 (5783) : 226-30.)。其中一些細胞因子如 IL-6、G-CSF等參與了鞭毛蛋白引起的抗福射作用（Krivokrysenko VI, Identification of granulocyte colony-stimulating factor and interleukin_6as candidate biomarkers of CBLB502efficacy as a medical radiation countermeasure. J Pharmacol Exp Ther. 2012Nov ;343(2) :497-508)。然而還有其他一些細胞因子如IL-I和IL-18等也可以 被鞭毛蛋白所誘導(dǎo)而在血液中升高，這些因子多參與炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致各種免疫性副反應(yīng)。
[0003] 輻抗肽（CBLB502)是細菌鞭毛蛋白經(jīng)過人工修飾改構(gòu)后的一種重組蛋白， 分子量約為31KD。此蛋白仍具有較高的防輻射功能并且于細菌鞭毛蛋白相比具有 較低的免疫原性，其在室溫情況下保存較長時間也不會喪失其生物學活性，對于開發(fā) 福射防護藥物提供了新的方向（Burdelya，L.G.，et al. An agonist of toll-like receptor5has radioprotective activity in mouse and primate models. Science, 2008, 320 (5783) :226-30.)。但由于輻抗肽蛋白通過TLR以及NLR刺激多種細胞 因子，除了發(fā)揮抗輻射作用，其中部分細胞因子還參與炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致產(chǎn)生感冒綜合征樣 副反應(yīng)。
[0004] 研究表明鞭毛蛋白在體內(nèi)不僅能與細胞表明的TLR5受體結(jié)合發(fā)揮抗輻射作用 以及參與免疫反應(yīng)，還與體內(nèi)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體（Nod-like receptors或 NLRs)家族中NLRC4和NAIP5(神經(jīng)元凋亡抑制蛋白5)兩個成員結(jié)合（Mariathasan S，et al.Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature，2004, 430:213-218 ;Lightfield KL，et al. Critical function for Naip5in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin. Nat Immunol，2008, 9:1171-1178.)，參與機體內(nèi)免疫應(yīng)答過程。NLRs家族是一組進化上保守的 胞內(nèi)模式識別受體在機體先天免疫和生理反應(yīng)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其普遍存在于動物 和植物體內(nèi)。
[0005] 鞭毛蛋白411位異亮氨酸參與結(jié)合TLR5,該氨基酸突變后TLR5結(jié)合能力減弱；而 470位亮氨酸突主要參與結(jié)合NLRs，該氨基酸突變后NLR結(jié)合能力減弱，當將這兩位氨基 酸同時突變則喪失生物學活性（Garaude J，et al. Simultaneous targeting of Toll-and Nod-like receptors induces effective tumor-specific immuneresponses. Sci Transl Med，2012, 4 (120) : 120ral6.)。鞭毛蛋白通過與TLR5受體結(jié)合，激活體內(nèi)NF-K B信號通路 來實現(xiàn)其輻射防護功能，而NLR在體內(nèi)參與免疫應(yīng)答過程，多介導(dǎo)炎癥細胞因子反應(yīng)。
[0006] 輻抗肽蛋白來源于沙門氏菌鞭毛蛋白，具有顯著的抗輻射作用。研究表明輻抗肽 通過細胞表面的TLR5受體激活NF- K B信號通路抑制細胞凋亡參與抗輻射作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個目的是提供一種輻抗肽突變蛋白。
[0008] 本發(fā)明提供的蛋白，為輻抗肽突變體L292A，是如下（a)或（b):
[0009] (a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0010] (b)將序列表中序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
[0011] 上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過1〇個氨基酸 殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0012] 編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護的范圍，其是如下⑴-⑶中任一種的 DNA分子：
[0013] (1)編碼區(qū)為序列表中的序列3所示的DNA分子；
[0014] (2)在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的蛋白的DNA分子；
[0015] (3)與⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具 有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至 少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
[0016] 上述嚴格條件可為用0. IX SSPE (或0. I XSSC)，0. 1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實驗中65°C下雜交并洗膜。
[0017] 含有上述DNA分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也是本發(fā)明保護 的范圍。
[0018] 上述蛋白在制備抑制其免疫動物引發(fā)的炎癥反應(yīng)產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護 的范圍。
[0019] 或上述蛋白在制備免疫原中的應(yīng)用，該應(yīng)用中所述蛋白抑制由其免疫動物引發(fā)的 炎癥反應(yīng)，也是本發(fā)明保護的范圍。
[0020] 上述應(yīng)用中，所述抑制其免疫動物引發(fā)的炎癥反應(yīng)為不激活炎癥反應(yīng)因子IL-18 活性。
[0021] 輻抗肽第292位氨基酸相當于鞭毛蛋白中的470位氨基酸，參與結(jié)合NLRs，輻抗肽 第292位氨基酸突變后形成輻抗肽突變體L292A，其激活NF- K B信號通路能力較輻抗肽蛋 白相比略有降低，輻射防護能力略有降低。但是血液中炎癥因子IL-18的水平與PBS對照 相當，其它細胞因子如G-CSF、KC與未突變蛋白相比未見明顯改變，可以看出其不激活炎癥 因子IL-18活性，或者與未突變的輻抗肽相比，降低了激活炎癥因子IL-18活性。
[0022] 上述蛋白在制備動物抗輻射產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0023] 上述應(yīng)用中，所述輻射為由6tlCo Y射線引起的輻射。
[0024] 上述應(yīng)用中，所述動物為人或鼠；所述動物具體為小鼠。
[0025] 上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品為藥物。
[0026] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明將輻抗肽第292位亮氨酸突變得到突變輻抗肽蛋白， 降低輻抗肽與NLR的結(jié)合能力，進而降低了動物注射輻抗肽后NLR通路介導(dǎo)的炎癥性反應(yīng)， 但是并未明顯降低TLR5介導(dǎo)的抗輻射生物學活性。本發(fā)明的關(guān)鍵在于利用輻抗肽蛋白通 過TLR通路而非NLR通路發(fā)揮抗輻射作用，通過改變輻抗肽中影響NLR結(jié)合能力的氨基酸， 使得突變輻抗肽蛋白不能通過NLR激活相應(yīng)的炎癥因子，從而實現(xiàn)降低輻抗肽蛋白導(dǎo)致的 炎癥反應(yīng)。本發(fā)明產(chǎn)生的突變輻抗肽蛋白與未突變蛋白相比，作用機制明顯，通過降低輻抗 肽與NLR的結(jié)合，降低或者消除NLR介導(dǎo)的已知或者未知的炎癥因子所帶來的副反應(yīng)。
[0027] 因此，改變輻抗肽蛋白中參與NLR受體結(jié)合的292位氨基酸，在不明顯降低輻抗肽 抗輻射活性的同時，明顯降低輻抗肽激活炎癥因子例如IL-18的能力，即降低了輻抗肽蛋 白作為抗輻射藥物的副反應(yīng)能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為輻抗肽及突變蛋白誘導(dǎo)表達后純化產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果
[0029] 圖2為?？闺募巴蛔兊鞍渍T導(dǎo)表達后純化產(chǎn)物的westernblot鑒定結(jié)果
[0030] 圖3為輻抗肽蛋白生物學活性測定
[0031] 圖4為輻抗肽小鼠輻射防護效果
[0032] 圖5為輻抗肽給藥對照射后小鼠外周血血象的影響
[0033] 圖6為小鼠注射輻抗肽后血液中細胞因子變化
[0034] 圖7為小鼠注射福抗膚后存活率

【具體實施方式】
[0035] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0036] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0037] 實施例1、輻抗肽突變體L292A的獲得
[0038] -、表達輻抗肽突變體L292A載體的獲得
[0039] 合成下列點突變引物：
[0040] 輻抗肽-I213A-F :TAACCCACTGGCTTCAe￡TGAITCTGCAITGTCA
[0041] 輻抗肽-1213A-R :TGACAATGCAGAATCAGCTGAAGCCAGTGGGTTA
[0042] 輻抗肽-L292A-F ：TTCCGCAAAACGTCGCGTCTTTACTGCGTTA
[0043] 輻抗肽-L292A-R :TAACGCAGTAAAGACGCGACGITITGCGGAA
[0044] 為了將輻抗肽全長序列克隆到pBV220原核表達載體，采用PCR方法，以 PMD-18T-FKT(王治東等，CBLB502蛋白原核表達及輻射防護作用驗證，中華放射醫(yī)學與防 護雜志，2010 (30) 4:169-172,公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研 究所獲得）為模板，以上述含有相應(yīng)酶切位點的輻抗肽特異性引物擴增了輻抗肽的全長序 列，分別獲得了大小均約為891bp的DNA片段1和DNA片段2。
[0045] 經(jīng)過測序，DNA片段1的核苷酸序列為序列表中序列1，為輻抗肽突變體I213A的 編碼基因，編碼的蛋白為輻抗肽突變體I213A，該蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2 ;
[0046] DNA片段2的核苷酸序列為序列表中序列3,為輻抗肽突變體L292A編碼基因，編 碼的蛋白為輻抗肽突變體L292A，該蛋白的氨基酸序列為序列表中序列4 ;
[0047] 輻抗肽的氨基酸序列為序列表中序列6,其編碼基因的核苷酸序列為序列表中序 列5。
[0048] 輻抗肽突變體L292A為將輻抗肽的氨基酸序列6第292位的賴氨酸（L)突變?yōu)楸?氨酸（A);輻抗肽突變體L292A編碼基因為將輻抗肽編碼基因的核苷酸序列5第874位的 CTC突變?yōu)镚CG。
[0049] 輻抗肽突變體I213A為將輻抗肽的氨基酸序列6第213位的異亮氨酸（I)突變?yōu)?丙氨酸（A);輻抗肽突變體I213A編碼基因為將輻抗肽編碼基因的核苷酸序列5第637位 的ATT突變?yōu)镚CT。
[0050] 將上述DNA片段1用Sal I和Smal I限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，得到的酶切產(chǎn) 物與經(jīng)過同樣酶切的PBV220表達載體（優(yōu)寶生物公司，VT1297)連接，得到的連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化入JM-109感受態(tài)細胞中，在含有氨芐抗生素的LB平板，30°C過夜培養(yǎng)，挑取克隆進 行擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA后，經(jīng)測序，該質(zhì)粒為將序列表中序列1所示的輻抗肽突變體 I213A的編碼基因插入pBV220表達載體的Sal I和Smal I酶切位點得到的載體，命名為 PBV220-I213A ；
[0051] 采用同樣的方法將DNA片段2入pBV220表達載體的Sal I和Smal I酶切位點得 到的載體，命名為PBV220-L292A。
[0052] 采用同樣的方法將輻抗肽編碼基因（序列5)插入pBV220表達載體的Sal I和 Smal I酶切位點得到的載體，命名為pBV220-A。
[0053] 二、輻抗肽突變體I213A和L292A的誘導(dǎo)表達和純化
[0054] 將上述pBV220-A、pBV220-I213A和pBV220-L292A分別轉(zhuǎn)化到BL21大腸桿菌中建 立表達工程菌，得到重組菌 BL21/pBV220-A、BL21/pBV220-I213A 和 BL21/pBV220-L292A，分 別提取質(zhì)粒測序驗證陽性菌。
[0055] 重組菌 BL21/pBV220-A、BL21/pBV220-I213A 和 BL21/pBV220-L292A 按照常規(guī)方法 進行誘導(dǎo)表達，經(jīng)超聲破碎，包涵體清洗，DEAE陰離子交換層析純化后，得到輻抗肽A、輻抗 肽突變體I213A和輻抗肽突變體L292A。
[0056] 以SDS-PAGE電泳鑒定純化后的輻抗肽A、輻抗肽突變體I213A和輻抗肽突變體 L292A，結(jié)果如圖1所示，M為蛋白分子量標準、1為輻抗肽、2為輻抗肽突變體I213A、3為輻 抗肽突變體L292A，可以看出，得到目標蛋白分子量均約為31KD。
[0057] 三、Western blot鑒定純化后?？闺牡鞍准巴蛔兊鞍?br> [0058] 取福抗肽、福抗肽突變體I213A、?？闺耐蛔凅wL292A經(jīng)Loading Buffer沸水煮 5min，進行12% SDS-PAGE電泳，濃縮膠電壓為80V，分離膠電壓為120V ;同時電泳結(jié)束后， 轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫封閉2h，l : 2000 -抗4°C過夜；TBST溶液洗滌4次，1 : 4000二 抗4°C 2h ;TBS清洗后，ECL顯色，并于暗室中曝光、顯影、定影。
[0059] 結(jié)果如圖2所示，1 :輻抗肽2 :輻抗肽突變體I213A3 :輻抗肽突變體L292A，可以看 至IJ，得到目標蛋白分子量均約為31KD。
[0060] 實施例2、輻抗肽突變體L292A在降低其引起的炎癥反應(yīng)中的應(yīng)用
[0061]1、輻抗肽突變體L292A的活性檢測
[0062] 采用堿性磷酸酶報告基因檢測，具體如下：
[0063]復(fù)蘇HEK293T細胞，并在孵育箱中以37°C，5% CO2條件下，用H-DMEM培養(yǎng)基常規(guī) 培養(yǎng)。當24孔板中的293T細胞培養(yǎng)至細胞密度達到70%，每孔細胞轉(zhuǎn)染50ng pcDNA-3. 1/ hTLR5質(zhì)粒（王磊等，Tol 1樣受體5激動劑CBLB502蛋白的輻射防護作用，國際藥學研究雜 志2012年6月第39卷第3期，225-230,公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與 輻射醫(yī)學研究所獲得）、IOOnglOOng pNF-K B/SEAP 質(zhì)粒（MGENEX，MK-515)、2ng pRL-TK 質(zhì)粒（Promega公司，E2241)共轉(zhuǎn)293T細胞。轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒分別用25ul無血清H-DMEM 培養(yǎng)基稀釋。轉(zhuǎn)染試劑稀釋后室溫靜置5min，將轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)?；靹?，室溫靜置15min，每 孔加入該混合液50ul ;
[0064] 轉(zhuǎn)染24h后，向培養(yǎng)板中加入不同濃度梯度的輻抗肽蛋白、輻抗肽突變體I213A蛋 白、輻抗肽突變體L292A蛋白，以無血清H-DMEM培養(yǎng)基為陰性對照；刺激12h后，PBS洗細 胞，加入 lOOullXPassive lysis buffer，室溫裂解 15min;
[0065] 結(jié)果測定：細胞刺激12h后，吸取上清IOul于96孔板中，加入IOul注射用水，根 據(jù)試劑盒說明書測定堿性磷酸酶活性，其活性強弱以405nm下的吸光值來表示。
[0066] 結(jié)果見圖3,輻抗肽蛋白、輻抗肽突變體I213A蛋白、輻抗肽突變體L292A蛋白的生 物學活性分別為 7. 63 X l(T6Units、6. 06 X KT5Units 和 6. 71 X KT6Units15
[0067] 2、輻抗肽突變體L292A在降低其引起的炎癥反應(yīng)
[0068] 采用細胞因子酶聯(lián)免疫分析（ELISA)檢測炎癥反應(yīng)因子表達量，具體如下：
[0069] 選取C56BL/6雄性小鼠，18?22g，隨機分組如下，每組20只小鼠：
[0070]PBS組：每只小鼠腹腔注射（10mM，pH7. 4) PBS ;
[0071] 輻抗肽蛋白組：每只小鼠腹腔注射4ug輻抗肽蛋白（溶解到PBS中）；
[0072] 輻抗肽突變體I213A蛋白組：每只小鼠腹腔注射4ug輻抗肽突變體I213A蛋白（溶 解到PBS中）；
[0073] 輻抗肽突變體L292A蛋白組：每只小鼠腹腔注射4ug輻抗肽突變體L292A蛋白（溶 解到PBS中）；
[0074] 2h后摘眼球取血，用ELISA法檢測TNFa、KC、G-CSF、IL-18等細胞因子的水平。 檢測過程和方法按照ELISA試劑盒說明書進行。
[0075] 結(jié)果見圖4,其中，1為PBS ;2為輻抗肽；3為輻抗肽突變體I213A4 :輻抗肽突變體 L292A ;輻抗肽突變體I213A組各細胞因子與PBS組相比均明顯升高，與輻抗肽組接近；輻 抗肽突變體L292A組除了 IL-18外各細胞因子與PBS組相比均明顯升高，與輻抗肽組接近， 輻抗肽突變體L292A組的IL-18與PBS對照組相當，未被激活。表明輻抗肽突變體L292A 不激活炎癥反應(yīng)因子IL-18活性，進而降低其引起的炎癥反應(yīng)。
[0076] 3、輻抗肽突變體L292A在抗輻射中的應(yīng)用
[0077] 對6tlCo Y射線照射后小鼠存活率以及血象的分析
[0078] C57BL/6雄性小鼠隨機分為5組，每組12只小鼠：
[0079] PBS組：每只小鼠腹腔注射10mM，pH7. 4PBS ;
[0080] 輻抗肽蛋白組：每只小鼠皮下給藥注射4ug輻抗肽蛋白（溶解到PBS中）；
[0081] 輻抗肽突變體I213A蛋白組：每只小鼠皮下給藥注射4ug輻抗肽突變體I213A蛋 白（溶解到PBS中）；
[0082] 輻抗肽突變體L292A蛋白組：每只小鼠皮下給藥注射4ug輻抗肽突變體L292A蛋 白（溶解到PBS中）；
[0083] Ih后，利用軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所6tlCoY射線照射源對所有小鼠 進行8.OGy-次性全身照射，照射后30天檢測血象變化并內(nèi)觀察其存活情況并記錄。
[0084] 輻抗肽與突變蛋白對照射后小鼠外周血象的影響結(jié)果見圖5所示，A :血紅蛋白； B :血小板；C :紅細胞；D :白細胞，可以看出，經(jīng)6. 5Gy60C〇 Y射線照射后小鼠外周血白細胞 (WBC)于照射后第3天急劇下降，PBS陰性對照組白細胞水平在照后第5天達到最低值，持 續(xù)到到第19天開始逐漸恢復(fù)。輻抗肽組、輻抗肽突變體I213A組、輻抗肽突變體L292A組白 細胞水平分別于照后第3、3、3天達到最低值，持續(xù)到第10、12、10天開始逐漸恢復(fù)。照射后 小鼠PBS陰性對照組外周血紅細胞（RBC)于照后第5天顯著下降，到第12天達到最小值，到 第26天恢復(fù)正常。輻抗肽組、輻抗肽突變體I213A組、輻抗肽突變體L292A組紅細胞水平 分別于照后第5、5、5天達到最小值后開始恢復(fù)，到第15、23、15恢復(fù)正常。照射后小鼠外周 血中血小板（PLT)水平，PBS陰性對照組在照后第5天達到最低值，輻抗肽組、輻抗肽突變體 I213A組、輻抗肽突變體L292A組血小板水平分別于照后第10、12、10天達到最低值并開始 恢復(fù)。照射后各組血紅蛋白水平開始下降，PBS陰性對照組、輻抗肽組、輻抗肽突變體I213A 組、輻抗肽突變體L292A組分別于照后第15、5、10、5達到最低值后開始恢復(fù)?？傮w而言，輻 抗肽突變體I213A組小鼠外周血各項指標在照射后開始恢復(fù)的時間均晚于輻抗肽組，而且 外周血各項指標最低值低于輻抗肽組；輻抗肽突變體L292A組小鼠外周血各項指標的最低 值以及恢復(fù)時間與輻抗肽組基本一致。
[0085] 圖6為輻抗肽與突變蛋白對細胞因子的影響，其中，1為PBS ;2為輻抗肽；3為輻 抗肽突變體I213A4 :輻抗肽突變體L292A，可以看出，輻抗肽突變體I213A組各細胞因子與 PBS組相比均明顯升高，與輻抗肽組接近。輻抗肽突變體L292A組除了 IL-18外各細胞因子 與PBS組相比均明顯升高，與輻抗肽組接近，而IL-18與PBS對照組相當，未被激活。
[0086] 統(tǒng)計各組存活率如圖7所示，PBS組、輻抗肽組、輻抗肽突變體I213A組和輻抗肽 突變體L292A組存活率分別為0、100%、58. 3%、91. 7%。輻抗肽組、輻抗肽突變體組存活率 明顯高于PBS。
【權(quán)利要求】
1. 一種蛋白，是如下（a)或（b): (a) 由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b) 將序列表中序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
3. 如權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下（1)-⑶中任一 種的DNA分子： (1) 編碼區(qū)為序列表中的序列3所示的DNA分子； (2) 在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的蛋白的DNA分子； (3) 與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少 具有99 %同源性且具有相同功能的DNA分子。
4. 含有權(quán)利要求2或3所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5. 權(quán)利要求1所述蛋白在制備抑制由其免疫動物引發(fā)的炎癥反應(yīng)產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1所述蛋白在制備免疫原中的應(yīng)用，該應(yīng)用中所述蛋白抑制由其免疫動物 引發(fā)的炎癥反應(yīng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述抑制其免疫動物引發(fā)的炎癥反應(yīng)為 不激活炎癥反應(yīng)因子IL-18活性。
7. 權(quán)利要求1所述蛋白在制備動物抗輻射產(chǎn)品中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述輻射為由6°C〇y射線引起的輻射。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述動物為人或鼠；所述動物具 體為小鼠。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述產(chǎn)品為藥物。
【文檔編號】C12N1/19GK104262482SQ201410458194
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月10日
【發(fā)明者】楊曉明, 葛常輝, 詹逸群, 來麗麗, 王磊 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所