體外酶法鉀測(cè)定試劑、其制備方法及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)體外酶法鉀測(cè)定試劑，包括分裝的體積相同的第一試劑和第二試劑，所述第一試劑內(nèi)物質(zhì)濃度如下：pH為7.3溫度為25℃的MOPS緩沖液200mmol/L、白蛋白1.00g/L、三磷酸苷5.62mmol/L、EGTA0.982mmol/L、α-酮戊二酸32.7mmol/L、尿素38.3mmol/L、尿素氨基水解酶230u/L、谷氨酸水解酶4320u/L和NaN30.50g/L，第二試劑內(nèi)物質(zhì)濃度如下：NaHCO330.9mmol/L、NADH0.845mmol/L、MgSO416mmol/L和NaN30.30g/L，所述第一試劑和第二試劑中的溶劑均為純水。本發(fā)明體外酶法鉀測(cè)定試劑可長(zhǎng)期穩(wěn)定保存，測(cè)定準(zhǔn)確性高、成本低、解決Shigeki方法不能應(yīng)用的問(wèn)題。
【專利說(shuō)明】體外酶法鉀測(cè)定試劑、其制備方法及其使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及鉀測(cè)定試劑，特別是涉及體外酶法鉀測(cè)定試劑。
[0002] 本發(fā)明還涉及上述體外酶法鉀測(cè)定試劑的制備方法以及該體外酶法鉀測(cè)定試劑 的使用方法。

【背景技術(shù)】
[0003] 人體血清中鉀的含量測(cè)定是臨床體外診斷測(cè)定項(xiàng)目之一，也是臨床常規(guī)急診診斷 中不可缺少的項(xiàng)目。血清鉀高于參考值上限，多見(jiàn)于腎上腺皮質(zhì)功能減退，特別危重患者， 血清鉀上升至8mmol/L，患者可能發(fā)生心室纖顫；血清鉀低于參考值下限，多見(jiàn)于腎小管疾 病，出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、嘔吐，腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)等癥狀。
[0004] 目前醫(yī)院測(cè)定血清鉀多使用離子選擇電極（ISE)。其電極是對(duì)鉀專一性強(qiáng)的纈霉 素膜，是比較理想的測(cè)定血清或尿中鉀離子濃度方法。纈霉素膜專一性強(qiáng)，但使用壽命短， 一般三個(gè)月左右就要更換一次。
[0005] 酶法測(cè)定鉀的優(yōu)點(diǎn)是利用分光光度計(jì)原理，在全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行測(cè)定，全 自動(dòng)生化儀是醫(yī)院測(cè)定其它眾多項(xiàng)目必備儀器，利用生化儀測(cè)定鉀，醫(yī)院不需要再購(gòu)置和 維護(hù)離子選擇電極設(shè)備。上生化儀測(cè)定，操作方便，節(jié)省開(kāi)支。酶法測(cè)定結(jié)果與離子電極法 等效。同樣是醫(yī)院測(cè)定鉀的理想方法之一。
[0006] 酶法測(cè)定鉀的方法是上世紀(jì)80年代末由Berry. MN等人提出的，他是利用K+是丙 酮酸激酶的激活劑原理，建立起酶法測(cè)定血清鉀的基本方法，隨后德國(guó)B. Μ公司正式推出 酶法測(cè)定鉀的試劑盒，并在全世界市場(chǎng)上銷售，受到醫(yī)院的歡迎。但Berry的原理中，Κ+離 子是丙酮酸激酶的激活劑，Na+離子也是該酶的激活劑，而且血清中Na+離子濃度是K+離子 的12倍。為了保證測(cè)定K+離子專一性，必須去除血清中的Na+離子，去除Na+離子依靠加 入一種對(duì)Na+專一的人工合成離子穴（Cryptand)。此離子穴價(jià)格昂貴，造成鉀試劑成本奇 高。這是Berry方法的不利方面。
[0007] 1987年日本人Shigeki Kimura等人提出另一個(gè)測(cè)定鉀的酶法原理，它利用K+是 尿素氨基水解酶（Urea amidolyase簡(jiǎn)稱UAL. EC3. 5. 1. 45)水解尿素的激活劑原理，建立測(cè) 定K+的方法。
[0008] 起反應(yīng)如下：
[0009] (l)Urca (尿素）+ATP(三磷酸腺苷）+HC03_(碳酸氫 鈉）UAL(願(yuàn)=縣角權(quán))-ADP (二磷酸腺苷）+HC03-+NHJ氨離子）+0H_ Mg2 ·Κ+
[0010] (2)NH； +a_酮戊二酸+NADH GLDH(谷氨酸脫氫酶）
[0011] UAL水解Urea時(shí)需加入ATP、HC03_作為底物，在Mg++和K+離子激活下，生成NH 4+和 0H+,生成的MV,加入a-酮戊二酸和NADH，在GLDH的作用下生成glutamate和NAD+,在 340nm波長(zhǎng)下，激活劑K+的多少與NADH下降成正比，建立起測(cè)定K+基本方法。
[0012] Shigeki等人的具體測(cè)定試劑分為試劑1和試劑2 :各試劑內(nèi)成分及濃度如下：
[0013] 試劑 1 :
[0014] BSA(白蛋白）....................3g/L
[0015] a-酮戊二酸…· · 14. 4mmol/L
[0016] NADH............................................0.53臟01/1
[0017] Urea............................................4. 47mmol/L
[0018] NaHC03........................................... 51. 4mmol/L
[0019] EGTA.............................................. 0. 5mmol/L
[0020] Magnesium acetate......................... . 7. 2mmol/L
[0021] UAL...............................................330.4U/L
[0022] GIDH.............................................· 43. 2Ku/L
[0023] Imidazole buffer......· · 200mmol/L pH7. 0 37°C
[0024] 試劑 2
[0025] BSA (白蛋白）....................................3g/L
[0026] ATP................................................9. 72mmol/L
[0027] Urea.............................................. 4. 47mmol/L
[0028] NaHC03........................................... 51. 4mmol/L
[0029] EDTA.............................................. 0. 5mmol/L
[0030] Magnuesium acetate (醋酸緩）............· 7. 2mmol/L
[0031] Imidazole buffer…·200mmol/L ρΗ7· 0 37°C
[0032] 其中，NADH為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，是一種轉(zhuǎn)遞質(zhì)子（更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是氫離子） 的輔酶，它出現(xiàn)在細(xì)胞很多代謝反應(yīng)中。EGTA為乙二醇二乙醚二胺四乙酸，即GEDTA，EGTA 是最為被廣泛使用的鈣離子選擇性的螯合劑，用于在鎂存在下，測(cè)定鈣。它與鈣離子形成的 復(fù)合物比與鎂離子形成的復(fù)合物要穩(wěn)定100, 〇〇〇倍，被用來(lái)制備鈣緩沖液和控制鈣離子 的濃度。容量分析及光度分析中測(cè)量微量金屬的絡(luò)合劑、掩蔽劑。也可滴定鋇、鍶、銅、鎂 和鋅。Magnesium acetate是乙酸鎂,無(wú)色單斜晶體，易潮解。溶于水，水溶液通常為中性 或弱酸性。在空氣中易潮解，加熱脫水。用作試劑、醫(yī)藥、催化劑等。UAL是尿素氨基水解 酶，別名 Urea-amidohydrolase。GIDH 是 glutamate dehydrogenase，即谷氨酸脫氫酶，催化 谷氨酸脫氨生成α-酮戊二酸和氨的反應(yīng)。且谷氨酸脫氫酶是唯一既能利用NAD+又能利 用NADH+作為還原當(dāng)量的酶。是一種不需氧的脫氫酶。Imidazole buffer為咪唑緩沖液， 分子式C3H4N2,分子量68,08g/mol，微溶于苯、石油醚，溶于乙醚、丙酮、氯仿、吡啶，易溶于 水、乙醇。緩沖范圍：6. 27. 8?？捎糜诤蠬is蛋白質(zhì)親和層析中做洗脫液（樹(shù)脂上的 二價(jià)陽(yáng)離子Ni2+可與咪唑基團(tuán)結(jié)合。BSA是牛血清白蛋白，是牛血清中的一種白蛋白，包含 583個(gè)氨基酸殘基，分子量為66. 430kDa，等電點(diǎn)為4. 7。牛血清白蛋白在生化實(shí)驗(yàn)中有廣泛 的應(yīng)用，例如在western blot中作為Blocking agent;在酶切反應(yīng)緩沖液中加入BSA，通過(guò) 提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度，對(duì)酶起保護(hù)作用。防止酶的分解和非特異性吸附，能減輕有些酶 的變性，能減輕有些不利環(huán)境因素如加熱，表面張力及化學(xué)因素引起的變性的。ATP是三磷 酸腺苷的縮寫(xiě)，其結(jié)構(gòu)式是:A-P?P?P，它是一種含有高能磷酸鍵的有機(jī)化合物，它的大 量化學(xué)能就儲(chǔ)存在高能磷酸鍵中。
[0033] 用Shigeki方法，基本原理與Berry相同，它的優(yōu)點(diǎn)不受Na+干擾，不需要用昂貴的 Na+離子穴（crgptand),試劑成本低，簡(jiǎn)單易行。但主要的缺點(diǎn)是試劑1和試劑2隨存放時(shí) 間延長(zhǎng)，其測(cè)定值迅速下降。
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 體外酶法鉀測(cè)定試劑，其特征在于：包括分開(kāi)包裝的體積相同的第一試劑和第 二試劑，所述第一試劑內(nèi)的物質(zhì)及各物質(zhì)濃度如下所示：pH為7. 3溫度為25°C的MOPS 緩沖液 200mmol/L、白蛋白 1. 00g/L、三磷酸苷 5. 62mmol/L、EGTA 0· 982mmol/L、α -酮 戊二酸32. 7mmol/L、尿素38. 3mmol/L、尿素氨基水解酶230u/L、谷氨酸水解酶4320u/ L和NaN30. 50g/L，第二試劑內(nèi)的物質(zhì)及各物質(zhì)濃度如下所示：NaHC0330. 9mmol/L、 NADHO. 845mmol/L、MgS0416mmol/L和疊氨鈉0. 30g/L，所述第一試劑和第二試劑中的溶劑均 為純水。
2. 權(quán)利要求1所述的體外酶法鉀測(cè)定試劑的制備方法，其特征在于：包括以下步驟： A. 制備第一試劑：在溫度為25°C的條件下將PH為7. 3的MOPS緩沖液200mmol、白蛋 白 1. 00g、三磷酸苷 5. 62mmol、EGTAO. 982mmol、α -酮戊二酸 32. 7mmol、尿素 38. 3mmol、尿 素氨基水解酶230u、谷氨酸水解酶4320u、NaN30. 50g依次加入純水中配置成1L溶液，攪拌 25-35分鐘后按照160ml -份分開(kāi)封閉包裝； B. 制備第二試劑：將 NaHC0330. 9mmol、NADH 0· 845mmol、MgS0416mmol、疊氨鈉 0· 30g 和 純水配置成1L溶液，攪拌25-35分鐘后按照160ml -份分開(kāi)封閉包裝； C. 組合包裝，將一份包裝后的第一試劑與一份包裝后的第二試劑封裝在測(cè)定試劑盒 內(nèi)。
3. 權(quán)利要求1或2所述的體外酶法鉀測(cè)定試劑的使用方法，其特征在于：每160 μ 1第 一試劑與160 μ 1第二試劑混合后對(duì)血清樣本進(jìn)行測(cè)定。
【文檔編號(hào)】C12Q1/34GK104152535SQ201410425391
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月26日
【發(fā)明者】朱以桂, 朱小暉 申請(qǐng)人:北京瑞正善達(dá)生物工程技術(shù)有限公司