穩(wěn)定共表達人源Siat7e和ST3GalIV的MDCK細胞系及用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及工程細胞系克隆MDCK-hSiat7e-ST3GalIV及其用途，更具體地涉及一株工程細胞系克隆MDCK-hSiat7e-ST3GalIV，它的保藏號是CGMCC?NO：9330。還公開了該細胞系在降低MDCK細胞貼壁性能和提高禽流感病毒分離株的生長滴度中的應(yīng)用；在抗禽流感病毒藥物的篩選、中和抗體的測定中的應(yīng)用。
【專利說明】穩(wěn)定共表達人源s i at7e和ST3Ga I IV的MDCK細胞系及用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及工程細胞系克隆MDCK-hSiat7e-ST3GalIV及其構(gòu)建方法，更具體地涉及一株工程細胞系克隆MDCK-hSiat7e-ST3GalIV，以及所述細胞系在降低MDCK細胞貼壁性能和提高禽流感病毒分離株的生長滴度，對于抗禽流感病毒藥物的篩選、中和抗體的測定以及用于MDCK的無血清全懸浮培養(yǎng)從而大規(guī)模生產(chǎn)細胞培養(yǎng)疫苗。

【背景技術(shù)】
[0002]禽流感病毒(AIV)屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氛酸酶(NA)分別有 16 種和 9 種[Webster RG, Bean WJ, Gorman OT, ChambersTM,&Kawaoka Y (1992)Evolut1n and ecology of influenza A viruses.Microb1logical reviews56 (I): 152-179.]。其中，高致病禽流感(H5 和 H7 亞型)在世界范圍內(nèi)給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，同時給人類健康帶來嚴重的威脅。哺乳動物中所有流感病毒均來源于水禽，但流感病毒很少發(fā)生跨種傳播，這是由流感病毒和其受體的相互作用決定的。流感病毒通過其表面的血凝素(HA)與細胞表面唾液酸寡糖受體結(jié)合侵染宿主細胞。細胞受體和病毒HA受體結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)是決定流感病毒宿主特異性的主要因素。常見的流感病毒受體有兩種，一種為唾液酸α 2，3半乳糖(SA α 2，3-GAL)，另一種為唾液酸α 2，3半乳糖(SAa2，6GAL)半乳糖。雖然所有的流感病毒都識別末端為唾液酸的寡糖，但不同流感病毒HA結(jié)合受體特性不同，大多數(shù)禽流感病毒優(yōu)先結(jié)合SA α 2，3-GAL受體，人流感病毒則優(yōu)先結(jié)合 SA α 2，6GAL 受:體[Rogers G, et al.(1983) Single amino acidsubstitut1ns in influe nza haemagglutinin change receptor binding specificity.Nature304(5921):76-78.]o
[0003]MDCK細胞是進行流感研究最常用的細胞，也是目前生產(chǎn)流感病毒疫苗的細胞系之一，但其表面SAa2，3Gal受體豐度較低，造成病毒滴度低。因此，提高MDCK細胞表面SAa2，3Gal受體豐度有可能改進禽流感疫苗株的繁殖滴度。α 2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶能將Neu5Ac轉(zhuǎn)移到糖蛋白和糖脂的末端Gal，Neu5Ac和Gal之間連鍵是a2,3[ItoT&Kawaoka Y (2000)Host-range barrier of influenza A viruses.Veterinarymicrob1logy74(l):71-75.]。唾液酸通常與糖鏈N末端倒數(shù)第2個糖一主要是半乳糖(galactose, Gal)以α 2，3或α 2，6糖苷鍵連接。已經(jīng)從人的細胞或組織中克隆并鑒定出到6個不同的α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶cDNA。遺傳進化樹分析表明[Tsuji S(1996)Molecular cloning and funct1nal analysis of sialyltransferases.Journal ofB1chemistryl20(l):1-13.]，該家族可以分為兩個亞家族，一個亞家族為ST3GalI和ST3GalII，另一亞家族為 ST3GalIII, ST3GalIV, ST3GalV 和 ST3GalVI。
[0004]傳統(tǒng)的流感疫苗生產(chǎn)都是采用雞胚生產(chǎn)的方法，雞胚來源的滅活疫苗，盡管采取了有效的純化工藝，但是仍然存在著許多不足。不僅成本昂貴，而且雞胚的殘留物可能引起過敏反應(yīng)。更主要的問題是雞胚來源的病毒在雞胚連續(xù)傳代后常常引起HA的變異，這種變異也可能發(fā)生在病毒其它節(jié)段[Rocha EPj et al.(1993)Comparisonof1influenza A(HlNland H3N2)haemagglutinin sequences obtained directly fromclinical specimens to those of MDCK cell-and egg-grown viruses.The Journalof general virology74:2513-2518.]，結(jié)果使雞胚來源的疫苗不能與人群中的流行毒株完全匹配。同時用雞胚生產(chǎn)的方法須較長的培養(yǎng)周期以及繁瑣的操作步驟而且很容易受污染[Tree JAj Richardson C，F(xiàn)ooks AR，Clegg JCj &Looby D (2001) Comparison oflarge-scale mammalian cell culture systems with egg culture for the product1nof influenza virus A vaccine strains.Vaccinel9 (25): 3444-3450.]。而應(yīng)用哺乳動物細胞生產(chǎn)的疫苗在動物模型顯示出比較好的保護作用[Govorkova Ej Murti Gj MeignierB，De Taisne C，&Webster R(1996)African green monkey kidney (Vero) cells providean alternative host cell system for influenza A and B viruses.Journal ofvirology70(8): 5519-5524.]。MDCK細胞被認為是培養(yǎng)甲型和乙型流感病毒最合適的細胞系[Robertson J(1998)An overview of host cell select1n.Developments inb1logical standardizat1n98:7-11 ;discuss1n73_14.]。此細胞系具有感染后迅速產(chǎn)生流感病毒，在短時間內(nèi)取得高滴度的特點。MDCK來源的病毒經(jīng)過連續(xù)傳代后，保持了抗原的穩(wěn)定性[Govorkova Ej Kodihalli Sj Alymova I, Fanget B, &Webster R(1998)Growthand immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and inembryonated chicken eggs.Developments in b1logical standardizat1n98:39-51 ；discuss1n73-34.]。
[0005]傳統(tǒng)的MDCK細胞培養(yǎng)多數(shù)釆用有血清貼壁培養(yǎng)，然而血清成份復(fù)雜，且含有對細胞有害的成分，并增加了產(chǎn)物分離純化的難度；血清來源有限，價格昂貴，生產(chǎn)成本高；血清的質(zhì)量因動物個體、血清產(chǎn)地、生產(chǎn)批號不同而產(chǎn)生波動，使得實驗和生產(chǎn)難以實現(xiàn)標準化。MDCK細胞是貼壁依賴性的細胞，只有貼附到基質(zhì)表面其才能存活、增殖和表達產(chǎn)物。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法采用二維單細胞層培養(yǎng)[Frisch SM&Francis H(1994)Disrupt1nof epithelial cell-matrix interact1ns induces apoptosis.The Journal of cellb1logyl24(4):619-626.]，由于受到基質(zhì)表面積限制，加之消化工藝復(fù)雜、生產(chǎn)時間長和生產(chǎn)成本高等困擾，難以實現(xiàn)MDCK細胞大規(guī)模培養(yǎng)和流感疫苗大規(guī)模生產(chǎn)。而動物細胞懸浮培養(yǎng)體系除了可以突破細胞生長表面限制之外，細胞培養(yǎng)環(huán)境更加均一，利于生產(chǎn)規(guī)模的放大和監(jiān)控。因此，迫切的需要能適應(yīng)懸浮生長的細胞來滿足擴大化的工業(yè)生產(chǎn)，MDCK全懸浮細胞系的建立對于疫苗生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化進程有著重大的意義。
[0006]已有文獻報道證明人類的Siat7e基因(ST6GalNac V)與細胞的貼壁性能有關(guān)，通過比較轉(zhuǎn)染了 Siat7e基因的Hela細胞與未轉(zhuǎn)染的貼壁的Hela細胞，轉(zhuǎn)染的細胞貼壁性能明顯得到了降低，而通過SiRNA技術(shù)抑制了 Siat7e基因的表達時其貼壁性能又得到了增強[Jaluria P, Betenbaugh M, Konstantopoulos K, Frank B, &Shiloach J (2007)Applicat1n of microarrays to identify and characterize genes involved inattachment dependence in HeLa cells.Metabolic engineering9(3):241-251.]0Siat7e基因又稱ST6GalNac V，屬于α 2_6唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族的成員，它的作用主要在于能將唾液酸從供體CMP_Neu5Ac上傳輸?shù)缴窠?jīng)節(jié)苷支上的N-乙酰半乳糖苷上[Tsuchida A, etal.(2003)Synthesis of disialyl Lewis a(Lea)structure in colon cancer cell linesby a sialyltransferase, ST6GalNAc VI, responsible for the synthesis of a -seriesgangl1sides.Journal of B1logical Chemistry278(25):22787-22794.]。
[0007]本發(fā)明首次建立了共表達人源Siat7e基因和ST3GalIV的MDCK細胞系MDCK-hSiat7e-ST3GalIV細胞的方法。通過穩(wěn)定共表達hSiat7e和ST3GalIV，可以使得人源Siat7e基因在MDCK細胞中表達，從而降低MDCK細胞的貼壁性能；同時人源ST3GalIV基因在MDCK細胞中表達，提高MDCK細胞表面SA α 2，3Gal受體豐度，進而提高禽流感疫苗株的繁殖滴度。不僅為研究MDCK的無血清全懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用，用于大規(guī)模生產(chǎn)細胞培養(yǎng)疫苗的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，同時提高禽流感疫苗株的繁殖滴度節(jié)約了生產(chǎn)工藝成本。此外，MDCK-hSiat7e-ST3GalIV細胞系在抗禽流感病毒藥物、疫苗株篩選以及細胞培養(yǎng)疫苗的生產(chǎn)方面都展示出較好的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的第一個目的在于提供了構(gòu)建MDCK-hSiat7e_ST3GalIV細胞系的方法，所述方法包括將hSiat7e的開放閱讀框cDNA和ST3GalIV的開放閱讀框cDNA克隆到MDCK細胞系中，建成穩(wěn)定共表達hSiat7e和ST3GalIV的MDCK細胞系。
[0009]本發(fā)明的一株hSiat7e和ST3GalIV為陽性的Madin-Darby犬腎細胞系MDCK-hSiat7e-ST3GalIV細胞克隆株于2014年6月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京市)，保藏號為CGMCC N0.9330。
[0010]本發(fā)明中利用人源Siat7e和ST3GalIV基因的高效真核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染MDCK細胞，經(jīng)G418抗性和R T-PCR篩選鑒定表達陽性的單克隆細胞株，我們對得到的3株單克隆細胞株進行了 qRT-PCR的檢測，得到了人源Siat7e和ST3GalIV基因同時表達量最高的單克隆細胞命名為MDCK-G5G4，獲得了穩(wěn)定雙表達Siat7e和ST3GAL4基因的MDCK細胞系。經(jīng)過流式細胞儀檢測MDCK-hSiat7e_ST3GalIV細胞中α-2，3及α 2，6唾液酸受體的含量顯著高于母本MDCK細胞。表明，人源Siat7e和ST3GalV基因在MDCK_hSiat7e_ST3GalIV細胞中得到穩(wěn)定表達。
[0011]本發(fā)明的第二個目的在于MDCK-hSiat7e-ST3GalIV細胞系能降低MDCK細胞貼壁性能同時提高禽流感病毒生長滴度。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了 Siat7e基因的細胞會失去與相鄰細胞形成緊密連接部的能力，同時伸展性不如母本細胞。因此降低了 MDCK細胞貼壁性能，為研究MDCK的無血清全懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用，用于大規(guī)模生產(chǎn)細胞培養(yǎng)疫苗的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。同時HA和TCID5tl試驗的結(jié)果均表明，不論是clade2.3.2.1H5N1亞型還是clade7.2H5N1亞型，均對MDCK-hSiat7e-ST3GalIV細胞系更加易感，病毒的滴度也均高于母本MDCK細胞。
[0012]本發(fā)明還公開了所述的細胞系在降低MDCK細胞貼壁性能和提高禽流感病毒分離株的生長滴度中的應(yīng)用。所述的細胞系在抗禽流感病毒藥物的篩選、中和抗體的測定、及在MDCK的無血清全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)細胞培養(yǎng)疫苗中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明中將人源Siat7e和ST3GalIV基因的真核表達載體轉(zhuǎn)染到MDCK細胞系中，構(gòu)建成穩(wěn)定共表達hSiat7e和ST3GalIV的MDCK細胞系。所述細胞中人源Siat7e基因得到了表達，降低MDCK細胞貼壁性能；同時α 2，3-唾液酸受體含量顯著高于母本MDCK細胞，禽流感病毒Η5Ν1亞型在MDCK-hSiat7e-ST3GalIV細胞系中測定的滴度高于在母本MDCK細胞上測定的結(jié)果。不僅為研究MDCK的無血清全懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用，用于大規(guī)模生產(chǎn)細胞培養(yǎng)疫苗的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，同時提高禽流感疫苗株的繁殖滴度節(jié)約了生產(chǎn)工藝成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1:不同G418濃度下MDCK細胞生存曲線。橫坐標:時間(天數(shù))縱坐標:細胞存活率)
[0015]圖2:1?0(和3株改造克隆細胞中人源1^丨&七76和ST3GalIV基因mRNA的表達情況。注:MDCK-G5G4 代表 MDCK_hSiat7e_ST3GalIV 細胞
[0016]圖3:MDCK 與 MDCK-hSiat7e-ST3GalIV 細胞 RT-PCR 鑒定結(jié)果
[0017](A)hSiat7e 基因的電泳結(jié)果，1:MDCK-hSiat7e_ST3GalIV 細胞，2:母本 MDCK 細胞，M:200bp Marker ; (B) ST3GalIV基因的電泳結(jié)果，1:MDCK-hSiat7e_ST3GalIV細胞，2 --母本 MDCK 細胞，M:200bp Marker。
[0018]圖4:MDCK 與 MDCK-hSiat7e-ST3GalIV 細胞形態(tài)變化
[0019]注:MDCK_G5G4代表 MDCK_hSiat7e_ST3Gal IV 細胞
[0020]圖5:流式細胞儀檢測MDCK細胞和MDCK-hSiat7e_ST3GalIV細胞對不同連接型特異性凝集素的反應(yīng)性
[0021 ] (A) MDCK 細胞對照；MDCK-hSiat7e_ST3GalIV 細胞對照；MDCK 細胞與 SNA 結(jié)合；MDCK-hSiat7e-ST3GalIV 細胞與 SNA 結(jié)合；MDCK 細胞與 MAA 結(jié)合；MDCK-hSiat7e_ST3GalIV細胞與MAA結(jié)合
[0022](B)MDCK細胞和MDCK_hSiat7e_ST3GalIV細胞表面唾液酸受體與SNA和MAA結(jié)合的3次檢測結(jié)果平均值的比較
[0023](*)表示與MDCK-SNA相比具有顯著差異(ρ〈0.05)；
[0024](#)表示與MDCK MAA相比具有顯著差異(ρ〈0.05)。
[0025]注:MDCK_G5G4代表 MDCK_hSiat7e_ST3Gal IV 細胞系。
[0026]圖6:禽流感病毒在MDCK細胞和MDCK_hSiat7e_ST3GalIV細胞上的繁殖曲線
[0027](A)YZC3在兩種細胞上的繁殖曲線；(B)rYZC3在兩種細胞上的繁殖曲線；
[0028](C)wt-DT在兩種細胞上的繁殖曲線；(D)rH5Nl/PR8在兩種細胞上的繁殖曲線。
[0029]注:M代表 MDCK 細胞系；G5G4 代表 MDCK_hSiat7e_ST3Gal IV 細胞系。
[0030]圖7:禽流感病毒毒株在母本MDCK細胞和MDCK-hSiat7e_ST3GalIV細胞上的感染滴度(TCID50)
[0031](*)表示MDCK-hSiat7e_ST3GalIV細胞與母本MDCK細胞測定結(jié)果相比具有顯著差異(Ρ〈0.05)；
[0032]注:MDCK_G5G4代表 MDCK_hSiat7e_ST3GalIV 細胞。
[0033]本發(fā)明中MDCK-hSiat7e-ST3GalIV 細胞克隆株(MDCK-G5G4)于 2014 年 6 月 26 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，分類命名為Madin-Darby canine kindey細胞,保藏號為 CGMCC N0.9330。

【具體實施方式】
[0034]!MDCK-hSiat7e-ST3GalIV 細胞系的構(gòu)建
[0035]引物
[0036]含人源Siat7e和ST3GalIV開放閱讀框的真核表達質(zhì)粒購自Genecopoeia公司(貨號:EX-V1581-M03 和 EX-C0523-M02);人源 Siat7e 和 ST3GalIV 基因的 GenBank 登錄號分別為NM_030965.1和ΝΜ_001254757.1。所用引物序列見表1。
[0037]表1.Siat7e 和 ST3GAL4 基因 RT-PCR 和 qRT-PCR 引物 Table 1.Primers fordetecting Siat7e and ST3GAL4genes by RT-PCR and qRT-PCR
[0038]

【權(quán)利要求】
1.一株穩(wěn)定共表達人源Siat7e和β -半乳糖苷α 2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶IV的MDCK細胞系 MDCK-hSiat7e-ST3GalIV，它的保藏號是 CGMCC NO:9330。
2.權(quán)利要求1所述的細胞系在降低MDCK細胞貼壁性能和提高禽流感病毒分離株的生長滴度中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要 求1所述的細胞系在抗禽流感病毒藥物的篩選、中和抗體的測定中的應(yīng)用。
4.以及權(quán)利要求1所述的細胞系在MDCK的無血清全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)細胞培養(yǎng)疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N7/00GK104178457SQ201410411768
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月20日
【發(fā)明者】劉秀梵, 李群輝, 劉曉文, 胡順林, 王曉泉, 顧敏, 胡嬌 申請人:揚州大學(xué)