一種結腸癌診斷試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了FOXD4L4基因在制備診斷結腸癌的試劑盒中的用途。本發(fā)明利用NCBI?GEO數據檢索將符合要求的5套結腸癌病例和正常人群基因組mRNA表達芯片數據納入研究范圍，通過對上述芯片數據進行Meta分析，篩選出FOXD4L4基因是差異顯著基因，相比正常組織，F(xiàn)OXD4L4基因在結腸癌組織中表達下調，并使用熒光實時定量PCR方法驗證了上述結論。據此，本發(fā)明還公開了一種診斷結腸癌的試劑盒以及利用該試劑盒診斷結腸癌的方法。本發(fā)明一方面為研究結腸癌的分子機理提供新的思路，另一方面為早期診斷結腸癌提供了更為靈敏的診斷試劑盒。
【專利說明】一種結腸癌診斷試劑盒及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及一種結腸癌診斷試劑盒及F0XD4L4基因在制備結 腸癌診斷試劑盒中的應用。

【背景技術】
[0002] 結腸癌是男性和女性第三位的常見惡性腫瘤，2013年美國癌癥統(tǒng)計報告中指出 2012年度美國結腸癌新發(fā)病例103170。而在我國，隨著近年來生活方式和飲食習慣的改 變，結腸癌發(fā)病及死亡均快速攀升，據2011年統(tǒng)計結果顯示，結腸癌位居我國惡性腫瘤發(fā) 病率第三位，是第四位導致死亡的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均已接近同時期世界水平，成 為嚴重威脅人群生命健康的公共衛(wèi)生問題。結腸癌的發(fā)病機制尚未完全闡明，但病因學研 究已經表明，絕大部分結腸癌的發(fā)生是一個多步驟、多階段，環(huán)境因素和遺傳因素共同作用 的復雜過程。它的發(fā)生發(fā)展涉及多個基因的改變，表現(xiàn)為多基因多步驟的協(xié)同累積以及相 互作用。近些年，國內外已應用基因芯片及高通量篩選等技術對結腸癌基因表達譜進行了 較多研究。但是不同的實驗平臺及樣本的差異導致分析結果存在很多不一致性。
[0003] Meta分析可對同一個問題所發(fā)表相關研究報告的結果進行收集、統(tǒng)計上的整合， 以期獲得更準確或更多的結果。這個分析能產生很多顯著的差異表達基因，能避免單個研 究帶來的不正確性。Meta分析是在多個芯片實驗研究中識別差異表達基因的強有力工具。 此外，用Meta分析能識別出單個研究不能識別的差異基因，并且能有效地降低單個芯片數 據的假陽性。
[0004] 本發(fā)明通過對已發(fā)表的結腸癌轉錄組表達數據進行Meta分析，篩選出影響結腸 癌發(fā)生發(fā)展的關鍵基因，并使用熒光實時定量PCR(QPCR)檢測驗證臨床樣本中的表達，本 發(fā)明通過生物信息學手段發(fā)掘這些基因在結腸癌中的作用，從而對結腸癌的發(fā)病機理進行 探究，為其診斷和治療提供一定的研究基礎。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明通過對已發(fā)表的結腸癌轉錄組表達數據進行Meta分析和QPCR驗證，發(fā)現(xiàn) F0XD4L4基因在結腸癌組織中的表達與在正常組織中的表達存在差異。與正常組織相比， F0XD4L4基因在結腸癌組織中表達下調，通過檢測F0XD4L4基因轉錄水平的表達情況，可以 判斷受試者是否患有結腸癌。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供F0XD4L4基因在制備結腸癌診斷試劑盒中的用途。所述診 斷試劑盒包含SYBR Green聚合酶鏈式反應體系、用于擴增F0XD4L4基因和管家基因的引物 對。SYBR Green聚合酶鏈式反應體系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
[0007] 上述技術方案中，PCR緩沖液為本領域技術人員公知的現(xiàn)有技術，優(yōu)選地，PCR緩 沖液包含：25mM KC1，2. 5mM MgCl2,200mM(NH4)2S04。
[0008] 引物對是本領域技術人員可以根據引物設計的常規(guī)設計原則設計。優(yōu)選的實施方 案中，擴增F0XD4L4基因的正向引物序列為5 ' -GAGGCGAGACAGCAGTTCCTAGAG-3 '，反向引物 序列為5' -GATGTACGAGTAGGGGGGCTTTG-3' ；管家基因優(yōu)選GAPDH，擴增該基因的正向引物序 列為 5' -ITTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'，反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'。
[0009] 在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉錄體 系，該逆轉錄體系包含：T重復寡核苷酸Oligo (dT)、逆轉錄反應液、M-MLV逆轉錄酶、RNA酶 抑制劑、dNTPs。
[0010] 優(yōu)選逆轉錄反應液包含：250mM PH8. 3 的 Tris-HCL，375mM 的 KCL，15mM 的 MgCl2， 50mM 的 DTT。
[0011] RNA酶抑制劑可選用本領域常用的RNA酶抑制劑，優(yōu)選為大腸桿菌表達的非競爭 性抑制RNA酶的重組蛋白酶。
[0012] 在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含RNA提取試劑， RNA酶提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
[0013] 本發(fā)明的診斷試劑盒保存于-20°c，盡量減少反復凍融。
[0014] 本發(fā)明的又一個目的在于提供一種診斷結腸癌的試劑盒。所述診斷試劑盒包含 SYBR Green聚合酶鏈式反應體系、用于擴增F0XD4L4基因和管家基因的引物對。所述SYBR Green聚合酶鏈式反應體系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBRGreen熒光染料。
[0015] 上述技術方案中，PCR緩沖液為本領域技術人員公知的現(xiàn)有技術，優(yōu)選地，PCR緩 沖液包含：25mM KC1，2. 5mM MgCl2,200mM(NH4)2S04。
[0016] 引物對是本領域技術人員可以根據引物設計的常規(guī)設計原則設計；優(yōu)選的實施方 案中，擴增F0XD4L4基因的正向引物序列為5 ' -GAGGCGAGACAGCAGTTCCTAGAG-3 '，反向引物 序列為5' -GATGTACGAGTAGGGGGGCTTTG-3' ；管家基因優(yōu)選GAPDH，擴增該基因的正向引物序 列為 5' -ITTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'，反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'。
[0017] 在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉錄體 系，該逆轉錄體系包含：T重復寡核苷酸Oligo (dT)、逆轉錄反應液、M-MLV逆轉錄酶、RNA酶 抑制劑、dNTPs。
[0018] 優(yōu)選逆轉錄反應液包含：250mM PH8. 3 的 Tris-HCL，375mM 的 KCL，15mM 的 MgCl2， 50mM 的 DTT。
[0019] RNA酶抑制劑可選用本領域常用的RNA酶抑制劑，優(yōu)選為大腸桿菌表達的非競爭 性抑制RNA酶的重組蛋白酶。
[0020] 在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含RNA提取試劑， RNA酶提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
[0021] 本發(fā)明還提供了診斷結腸癌的方法，所述方法包括：
[0022] (1)利用RNA提取試劑提取樣本總RNA ;
[0023] (2)將步驟（1)獲得的RNA逆轉錄成cDNA ;
[0024] (3)在熒光實時定量PCR儀上將F0XD4L4基因和管家基因進行擴增檢測；
[0025] (4)通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Λ Λ CT法進行相對定量；
[0026] (5)F0XD4L4基因表達下調，表明研究對象為結腸癌患者。
[0027] 步驟（1)的具體實施方法為：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預冷 的研缽中進行研磨，待組織樣本成粉末狀后：
[0028] ①加入Trizol，室溫保存5min ;
[0029] ②加氯仿0. 2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5min-10min ;
[0030] ③12000rpm高速離心15min后吸取上層水相（吸70%)到另一新離心管中，注意 不要吸到兩層水相之間的蛋白物質。移入新管，加入等體積的_20°C預冷異丙醇，充分顛倒 混勻，置于冰上lOmin ;
[0031] ④12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液，按lml/ml Trizol的比例加入75% DEPC乙醇洗滌沉淀（4°C保存），洗滌沉淀物，振蕩混合，4°C下12000rpm高速離心5min ;
[0032] ⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉 淀；
[0033] ⑥用Nan〇dr〇p2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-70°C。
[0034] 步驟（2)的具體實施方法為：用逆轉錄緩沖液對1 μ g總RNA進行逆轉錄合成 cDNA。采用25 μ 1反應體系，每個樣品取1 μ g總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入 以下組分：DEPC 水，5X 逆轉錄緩沖液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30ymmol/l Oligo (1Τ，20〇υ/μ1 M-MLV RT，模板 RNA。42°C孵育 lh，72°C 10min，短暫離心。
[0035] 步驟（3)的具體實施方法為：采用25μ1反應體系，每個樣本設置3個平行 管，所有擴增反應均重復三次以上以保證結果的可靠性。配制以下反應體系：SYBR Green聚合酶鏈式反應體系12. 5μ 1，正向引物（5μΜ/μ 1)1 μ 1，反向引物（5μΜ/ μ 1) 1 μ 1，模板cDNA 2. 0 μ 1，無酶水8. 5 μ 1 ;擴增F0XD4L4基因的正向引物序列為 5' -GAGGCGAGACAGCAGTTCCTAGAG-3'，反向引物序列為 5' -GATGTACGAGTAGGGGGGCTTTG-3' ； 擴增GAPDH基因的正向引物序列為5 ' -TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3 '，反向引物序列 為5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'，各項操作均于冰上進行。擴增程序為：95 °C 10min， (95°C15s，60°C 60s)*45個循環(huán)。以SYBR Green作為熒光標記物，在Light Cycler熒光定 量PCR儀上進行PCR反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Λ ACT法進行相對定 量。
[0036] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果在于：（1)本發(fā)明首次公開了 F0XD4L4基因與結腸癌相 關，F(xiàn)0XD4L4基因有望成為診斷結腸癌的分子標志物，并為研究結腸癌的分子機理提供新的 思路。（2)利用檢測基因表達的方式診斷結腸癌的存在與否的方法更加靈敏，有利于疾病早 期的診斷。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0037] 圖1表示熒光實時定量PCR測定在正常組織和結腸癌組織中F0XD4L4基因 mRNA 的相對表達量。
[0038] 具體的實施方式：
[0039] 下面結合具體的實施例進一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于解釋本發(fā)明， 并不意味著限制本發(fā)明的保護范圍。
[0040] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0041] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0042] 實施例1篩選與結腸癌相關的基因
[0043] 1. 1NCBI GEO (Gene Expression Omnibus)數據檢索
[0044] GEO (Gene Expression Omnibus)數據庫是由NCBI (美國國立生物技術信息中心） 開發(fā)維護，GEO數據庫作為最大的基因表達數據的數據庫，該數據庫以芯片數據為主，此外 亦包含一些非芯片類型的數據如SAGE (基因表達系列分析）數據、SARST (核糖體序列標簽 連續(xù)分析）數據、MS (質譜）數據、蛋白質組數據和新一代高通量測序數據（MPSS，大規(guī)模平 行測序技術）等。
[0045] a.檢索關鍵詞：（"colorectal cancer" [MeSH Terms] 0R"colorectal cancer"
[0046] [All Fields])AND//Homo sapiens^[porgn]
[0047] b.研究中的樣本篩選策略：
[0048] 限制研究類型為"expression profiling by array"符合以下標準的數據集將納 入我們的研究中：①所選數據集必須是全基因組的表達mRNA轉錄組數據，且都為RNA-seq 數據集；②這些數據來自于大腸癌病例組和對照組的活檢組織或培養(yǎng)的細胞；③本研究均 考慮經標準化或者原始數據集；最后，有5套RNA-seq數據集納入我們的研究中（表1)。
[0049] 表1 8套結腸癌全基因組數據集的基本情況
[0050]

【權利要求】
1. F0XD4L4基因在制備結腸癌診斷試劑盒中的用途，其特征在于，所述診斷試劑盒包含 SYBR Green聚合酶鏈式反應體系、用于擴增F0XD4L4基因和管家基因的引物對；所述SYBR Green聚合酶鏈式反應體系包含：PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
2. 根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述擴增F0XD4L4基因的引物對 的序列如下：正向引物序列為5 ' -GAGGCGAGACAGCAGTTCCTAGAG-3 '，反向引物序列為 5' -GATGTACGAGTAGGGGGGCTTTG-3' ；所述管家基因是GAPDH，擴增GAPDH基因的正向引物序 列為 5' -ITTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'，反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'。
3. 根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述PCR緩沖液包含：25mMKCL、2. 5mM MgCL2、200mM(NH4)2S04。
4. 根據權利要求1-3中任一項所述的用途，其特征在于，所述診斷試劑盒還包含M-MLV 逆轉錄體系或RNA提取試劑；所述逆轉錄體系包含T重復寡核苷酸Oligo dT、逆轉錄反應 液、M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs ;所述RNA提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、 75%乙醇。
5. 根據權利要求4所述的用途，其特征在于，所述逆轉錄反應液包含：250mM PH8. 3的 Tris-HCL、375mM 的 KCL、15mM 的 MgCL2、50mM 的 DTT。
6. -種結腸癌的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒包含SYBRGreen聚合酶鏈 式反應體系、用于擴增F0XD4L4基因和管家基因的引物對；所述SYBR Green聚合酶鏈式反 應體系包含：PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
7. 根據權利要求6所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述擴增F0XD4L4基因的引物 對的序列如下：正向引物序列為5 ' -GAGGCGAGACAGCAGTTCCTAGAG-3 '，反向引物序列為 5' -GATGTACGAGTAGGGGGGCTTTG-3' ；所述管家基因是GAPDH，擴增GAPDH基因的正向引物序 列為 5' -ITTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'，反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'。
8. 根據權利要求6所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖液包含：25mM KCL、 2.5mM MgCL2、200mM(NH4)2S04。
9. 根據權利要求6-8中任一項所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒還包 含M-MLV逆轉錄體系或RNA提取試劑；所述逆轉錄體系包含T重復寡核苷酸Oligo dT、逆 轉錄反應液、M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs ;所述RNA提取試劑包含Trizol、氯仿、 異丙醇、75 %乙醇。
10. 根據權利要求9所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述逆轉錄反應液包含：250mM PH8. 3 的 Tris-HCL、375mM 的 KCL、15mM 的 MgCL2、50mM 的 DTT。
【文檔編號】C12Q1/68GK104141013SQ201410389777
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權日:2014年8月8日
【發(fā)明者】肖文華, 屈雪玲, 王碩, 李小梅, 董偉偉, 趙慧霞 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院