一種去除pcv2病毒中支原體污染的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術領域】，旨在提供一種去除PCV2病毒中支原體污染的方法。該種去除PCV2病毒中支原體污染的方法包括步驟：0.1μm濾菌器過濾PCV2病毒并繁殖四代，PCV2病毒用終濃度2.5μg/ml的Plasmocin處理兩代，常規(guī)繁殖PCV2兩代。本發(fā)明采用先過濾再用抗生素的方法，不僅節(jié)省了實驗成本，更為重要的是抗生素使用次數少，濃度小，去除支原體時間短，整個處理過程僅需8代，約16～20天可完成，且不會使PCV2病毒效價降低，可為疫苗生產提供無支原體且病毒效價高的PCV2病毒，并為單位體積內疫苗半成品病毒含量的提高提供了保障。
【專利說明】一種去除PCV2病毒中支原體污染的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，特別涉及一種去除PCV2病毒中支原體污染的方法。

【背景技術】
[0002]豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬，無囊膜，由單股、共價的閉合環(huán)狀DNA組成，病毒粒子直徑約17nm，呈二十面體對稱，是目前發(fā)現的最小的一種脊椎動物病毒。該病毒可分為兩種血清型，即PCVl和PCV2。其中PCVl對豬無致病性，廣泛存在于豬體內和豬源傳代細胞系中，PCV2可在豬群內引發(fā)多種傳染病，如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)等。PCV2不僅可造成仔豬生長緩慢，還會侵害豬的免疫系統(tǒng)，導致豬群免疫抑制，直接引起其他傳染病免疫的失敗，并引發(fā)其他病原的繼發(fā)感染。PCVl基因組全長1759bp，PCV2為1767bp或1768bp，共包括ORFl和0RF2在內的11個開放閱讀框。目前已證實，PCV2的ORFl編碼與病毒復制有關的蛋白(Itep蛋白)，0RF2編碼病毒衣殼蛋白(Cap蛋白)，Cap蛋白為病毒的主要結構蛋白，是刺激機體產生免疫應答的主要抗原，成為該病在流行病學診斷和疫苗研究中的熱點。
[0003]我國自2000年首次報道豬群中存在PCV2感染，之后在全國各地陸續(xù)有報道，呈逐漸蔓延趨勢。流行病學調查顯示，目前我國豬群中PCV2陽性率高達80%，且PCV2的基因組也在不斷發(fā)生變化，PCV2b基因型已取代PCV2a基因型，成為當前流行的優(yōu)勢基因型毒株，豬群中PCV2的發(fā)生率和嚴重程度也高于以前，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。
[0004]疫苗免疫接種被認為是防控PCV2的有效手段，商品化疫苗的推廣應用為有效防控PCV2疫情發(fā)揮了重要作用。目前針對該病的國內外商品化疫苗主要為全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗和嵌合病毒疫苗，其中全病毒滅活疫苗使用得較為廣泛。
[0005]無論是哪種類型的疫苗，獲得純凈的病毒都是疫苗研究與生產的前提。但實際采集病料的場所通常不能保證無菌，或在后續(xù)實驗中，由于實驗器材或者操作者本身及環(huán)境帶來污染，甚至可能是用已經污染支原體的細胞來培養(yǎng)病毒，會直接或間接造成病毒污染支原體。對于PCV2病毒繁殖來說，支原體的污染不僅干擾了病毒的增殖，降低病毒產量，還會使培養(yǎng)的細胞遭受污染，從而使研究結果的真實性和可靠性大大降低。
[0006]支原體是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，大小一般在0.3~0.5 μ m之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。支原體約有I %可通過濾菌器，用普通染色法不易著色，因此在普通光學顯微鏡下不易被發(fā)現。
[0007]商品化的支原體抗生素Plasmocin主要用于治療或預防細胞培養(yǎng)中支原體污染。Plasmocin含有兩種殺菌成分，可以強效對抗支原體及相關的無胞壁的細菌。它的顯著效果主要是其含有兩種獨特的抗菌成分，一種成分通過干擾核糖體的翻譯功能而使蛋白合成受阻，另一種成分則通過干擾復制叉的形成而阻止DNA的復制，而這兩種成分的靶分子只存在于支原體和許多其他細菌中而并不存在于真核細胞中。
[0008]使用推薦濃度5倍的高濃度Plasmocin處理細胞，雖未觀察到藥物對細胞新陳代謝的副作用，但據此項試驗檢測，若在繁殖PCV2的過程中，細胞培養(yǎng)液中反復加入Plasmocin,則會使PCV2病毒效價降低。
[0009]PCV2大小17nm，0.1 μ m濾菌器過濾不會影響其毒價，而支原體直徑一般在0.3~
0.5 μ m之間，由于其具有多形性，0.1 μ m濾菌器過濾后，不能徹底截留支原體，殘留少量的支原體可用Plasmocin清除。所以單使用上述任何一種方法都不能保證徹底清除支原體的同時保證PCV2病毒效價不降低。


【發(fā)明內容】

[0010]本發(fā)明的主要目的在于克服現有技術中的不足，提供一種聯(lián)合0.1 μ m濾菌器和Plasmocin兩種方法去除PCV2中污染的支原體。為解決上述技術問題，本發(fā)明的解決方案是:
[0011]提供一種去除PCV2病毒中支原體污染的方法，具體步驟包括:
[0012](1)0.1 μ m濾菌器過濾PCV2病毒并繁殖四代；
[0013](2)PCV2病毒用終濃度2.5 μ g/ml的Plasmocin處理兩代；
[0014](3)常規(guī)繁殖PCV2兩代；
[0015]所述步驟(1)具體包括下述步驟:
[0016]A、用含 5% 胎牛血清(PAA, A10209-1611)的 MEM 培養(yǎng)基(GIBC0, 574131)培養(yǎng)PK-15細胞，細胞密度為2X 15個/ml，將PCV2病毒用0.1 μ m濾菌器過濾后，向MEM培養(yǎng)基中接種PCV2病毒，使PCV2病毒接種量為MEM培養(yǎng)基體積的I %，然后將裝有接種PCV2病毒的MEM培養(yǎng)基的細胞瓶，置于溫度為37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h ；
[0017]B、將步驟A培養(yǎng)后的細胞瓶，進行凍融操作:將細胞瓶置于溫度為_70°C的冰箱中冷凍12h，然后再取出細胞瓶置于常溫(15~25°C )中融化；
[0018]C、再將細胞瓶進行步驟B的凍融操作兩次，即共反復三次凍融操作，得到細胞瓶中凍融好的PCV2病毒懸液；
[0019]D、將步驟A中的PCV2病毒替換成步驟C中得到的凍融好的PCV2病毒懸液，再依次重復步驟A、步驟B、步驟C的處理3次，即制得PCV2病毒；
[0020]所述步驟(2)具體包括下述步驟:
[0021]E、用含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細胞，細胞密度2X 15個/ml，再向MEM培養(yǎng)基中接種步驟(1)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接種量為MEM培養(yǎng)基體積的I %，并向 MEM 培養(yǎng)基中加入 Plasmocin(Invivogen, MPT-34-01B),使 Plasmocin 的終濃度為2.5 μ g/ml，然后將裝有接種了 PCV2病毒的MEM培養(yǎng)基的細胞瓶，置于溫度為37°C、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72~96h ;細胞鋪滿后，將細胞瓶反復進行3次步驟B中的凍融操作，得到細胞瓶中凍融好的PCV2病毒懸液；
[0022]F、將步驟E中的PCV2病毒替換成步驟E中得到的凍融好的PCV2病毒懸液，重復一次步驟E的操作，繁殖一代PCV2病毒；
[0023]所述步驟(3)具體包括下述步驟:
[0024] G、用含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細胞，細胞密度2X 15個/ml，再向MEM培養(yǎng)基中接種步驟(2)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接種量為MEM培養(yǎng)基體積的I %，然后將裝有接種了 PCV2病毒的MEM培養(yǎng)基的細胞瓶，置于溫度為37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h ;將培養(yǎng)后的細胞瓶取出后，反復進行3次步驟B中的凍融操作，得到細胞瓶中凍融好的PCV2病毒懸液；
[0025]H、將步驟G中的PCV2病毒替換成步驟G中得到的凍融好的PCV2病毒懸液，重復一次步驟G的操作，繼續(xù)繁殖一代PCV2病毒，即制得所需的PCV2病毒。
[0026]為檢測制得的PCV2病毒中支原體的去除情況，對制備得到的PCV2病毒進行支原體鑒定，具體方法為:參考豬支原體基因序列，Genbank登錄號NR-103095.1，采用DNAMAN軟件設計兩對上下游引物:P1:AAGTCGTAACAACCTATCCCTA, P2:GTGTCTGGTTAGTATTTAGCCTTA ；P3:GCAAGTCGATGAAGGACG, P4:GCTTCGCTCGCCACTACT,采用套式 PCR 法，以步驟 H 中制得的PCV2病毒為樣品模板，并設滅菌雙蒸水為陰性對照，豬滑液囊支原體為陽性對照，先用Pl和P2引物進行PCR擴增，將其擴增產物作為PCR反應模板，再用P3和P4引物擴增目的基因片段，將第二次PCR擴增的產物，用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測支原體。
[0027]為進一步檢測制得的PCV2病毒經處理后，其病毒效價是否受到影響，采用IFA法，即間接免疫熒光法 ，對制備得到的PCV2病毒進行TCID5tl測定，具體方法為:
[0028]先將PK-15細胞用MEM培養(yǎng)基稀釋成密度為2 X 15個/ml的細胞懸液，細胞懸液加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，100 μ I/孔，再將步驟H中繁殖得到的PCV2病毒10倍系列梯度稀釋，選擇10_2、10' 10' 10_5、10_6、10_7這6個梯度，100 μ I/孔加到細胞懸液中，每個梯度重復6個孔，同時設MEM培養(yǎng)液作陰性對照、107_3TCID5ciAil的PCV2病毒作陽性對照，陰性、陽性對照各I孔，然后將細胞培養(yǎng)板置于溫度為37°C、5%濃度CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h ；
[0029]培養(yǎng)結束后，取出細胞培養(yǎng)板并棄掉細胞培養(yǎng)板中的液體，每孔加入100 μ I冷的甲醇-丙酮固定液(甲醇和丙酮體積比1:1配制)，然后在溫度為-20°C的冰箱固定30分鐘，棄固定液，再用pH為7.4的PBST洗滌I次細胞培養(yǎng)板后甩干；
[0030]將鼠源Cap蛋白單克隆抗體用PBS進行1:2000倍稀釋得到鼠源Cap蛋白單克隆抗體稀釋液，將鼠源Cap蛋白單克隆抗體稀釋液按100μ I/孔加入到甩干的細胞培養(yǎng)板中，然后將細胞培養(yǎng)板在37°C下?lián)u床孵育60分鐘，棄細胞培養(yǎng)板中液體，再用pH為7.4的PBST洗滌3次細胞培養(yǎng)板后甩干；
[0031]將FITC-羊抗鼠二抗用PBS進行1:200倍稀釋得到FITC-羊抗鼠二抗稀釋液，將FITC-羊抗鼠二抗稀釋液按100μ I/孔加入到甩干的細胞培養(yǎng)板中，錫箔紙包裹細胞培養(yǎng)板避光，然后將細胞培養(yǎng)板在37°C下?lián)u床孵育60分鐘，棄細胞培養(yǎng)板中液體，再用pH為
7.4的PBST洗滌3次細胞培養(yǎng)板后甩干；
[0032]將甩干的細胞培養(yǎng)板于倒置熒光顯微鏡下觀察，按Reed和Muench法計算PCV2病毒的效價。
[0033]本發(fā)明的工作原理:聯(lián)合0.1 μ m的濾菌器和Plasmocin兩種方法去除PCV2中污染的支原體，先用0.1 μ m的濾菌器過濾PCV2病毒并繁殖四代，每次接種PCV2病毒前均過濾一次，再用終濃度2.5 μ g/ml的Plasmocin處理PCV2病毒兩代，為徹底消除Plasmocin對病毒繁殖的影響，再常規(guī)繁殖兩代PCV2，最終快速、徹底清除了 PCV2中污染的支原體，且PCV2的病毒效價仍可維持在107 3TCID50/ml以上。
[0034]與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0035]采用先過濾再用抗生素的方法，不僅節(jié)省了實驗成本，更為重要的是抗生素使用次數少，濃度小，去除支原體時間短，整個處理過程僅需8代，約16~20天可完成，且不會使PCV2病毒效價降低，可為疫苗生產提供無支原體且病毒效價高的PCV2病毒，并為單位體積內疫苗半成品病毒含量的提高提供了保障。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品中支原體結果圖。
[0037]圖2為試驗組樣品、陽性對照、陰性對照IFA檢測TCID5tl測定結果圖。

【具體實施方式】
[0038]下面結合附圖與【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細描述:
[0039]本發(fā)明提供的一種去除PCV2病毒中支原體污染的方法，具體步驟包括:
[0040](I) 0.1um濾菌器過濾PCV2病毒并繁殖四代；
[0041](2)PCV2病毒用終濃度2.5 μ g/ml的Plasmocin處理兩代；
[0042](3)常規(guī)繁殖PCV2兩代。
[0043]所述步驟(1)具體包括下述步驟:
[0044]A、用含 5% 胎牛血清(PAA, A10209-1611)的 MEM 培養(yǎng)基(GIBC0, 574131)培養(yǎng)PK-15細胞，細胞密度為2X 15個/ml，將PCV2病毒用0.1 μ m濾菌器過濾后，向MEM培養(yǎng)基中接種PCV2病毒，使PCV2病毒接種量為MEM培養(yǎng)基體積的I %，然后將裝有接種PCV2病毒的MEM培養(yǎng)基的細胞瓶，置于溫度為37°C、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h ；
[0045]B、將步驟A培養(yǎng)后的細胞瓶，進行凍融操作:將細胞瓶置于溫度為_70°C的冰箱中冷凍12h，然后再取出細胞瓶置于常溫(15~25°C )中融化；
[0046]C、再將細胞瓶進行步驟B的凍融操作兩次，即共反復三次凍融操作，得到細胞瓶中凍融好的PCV2病毒懸液；
[0047]D、將步驟A中的PCV2病毒替換成步驟C中得到的凍融好的PCV2病毒懸液，再依次重復步驟A、步驟B、步驟C的處理3次，即制得PCV2病毒。
[0048]所述步驟(2)具體包括下述步驟:
[0049]E、用含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細胞，細胞密度2X 15個/ml，再向MEM培養(yǎng)基中接種步驟(1)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接種量為MEM培養(yǎng)基體積的I %，并向 MEM 培養(yǎng)基中加入 Plasmocin(Invivogen, MPT-34-01B),使 Plasmocin 的終濃度為2.5 μ g/ml，然后將裝有接種了 PCV2病毒的MEM培養(yǎng)基的細胞瓶，置于溫度為37°C、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72~96h ;細胞鋪滿后，將細胞瓶反復進行3次步驟B中的凍融操作，得到細胞瓶中凍融好的PCV2病毒懸液；
[0050]F、將步驟E中的PCV2病毒替換成步驟E中得到的凍融好的PCV2病毒懸液，重復一次步驟E的操作，繁殖一代PCV2病毒。
[0051]所述步驟(3)具體包括下述步驟:
[0052]G、用含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細胞，細胞密度2X 15個/ml，再向MEM培養(yǎng)基中接種步驟(2)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接種量為MEM培養(yǎng)基體積的I %，然后將裝有接種了 PCV2病毒的MEM培養(yǎng)基的細胞瓶，置于溫度為37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h ;將培養(yǎng)后的細胞瓶取出后，反復進行3次步驟B中的凍融操作，得到細胞瓶中凍融好的PCV2病毒懸液；
[0053]H、將步驟G中的PCV2病毒替換成步驟G中得到的凍融好的PCV2病毒懸液，重復一次步驟G的操作，繼續(xù)繁殖一代PCV2病毒，即制得所需的PCV2病毒。
[0054]為檢測PCV2病毒中支原體的去除情況，對制備得到的PCV2病毒進行支原體鑒定，具體方法為:參考豬支原體基因序列，Genbank登錄號NR-103095.1，用DNAMAN軟件設計兩對上下游引物 Pl:AAGTCGTAACAACCTATCCCTA, P2:GTGTCTGGTTAGTATTTAGCCTTA ；P3:GCAAGTCGATGAAGGACG, P4:GCTTCGCTCGCCACTACT,采用套式 PCR 法，以步驟 H 中制得的 PCV2病毒為模板，滅菌雙蒸水為陰性對照，豬滑液囊支原體為陽性對照，先用Pl和P2引物進行PCR擴增，將其擴增產物作為模板，再用P3和P4引物擴增基因片段，將第二次PCR擴增的產物，用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測支原體。
[0055]為進一步檢測PCV2病毒經處理后，其病毒效價是否受到影響，采用IFA法，即間接免疫熒光法，對制備得到的PCV2病毒進行TCID5tl測定，具體方法為:
[0056]先將PK-15細胞用MEM培養(yǎng)基稀釋成密度為2 X 15個/ml的細胞懸液，細胞懸液加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，100 μ I/孔，再將步驟H繁殖得到的PCV2病毒10倍系列梯度稀釋，選擇10_2、10' 10' 10_5、10_6、10_7這6個梯度，100 μ I/孔加到細胞懸液中，每個梯度重復6個孔，同時分別設MEM培養(yǎng)基作陰性對照，107_ 3TCID5tZml的PCV2病毒作陽性對照，陰性、陽性對照各I孔，然后將細胞培養(yǎng)板置于溫度為37°C、5%濃度CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h ；
[0057]培養(yǎng)結束后，取出細胞培養(yǎng)板并棄掉細胞培養(yǎng)板中的液體，加入冷的甲醇-丙酮固定液(按甲醇和丙酮體積比1:1配制)，100 μ I/孔，然后在-20°c冰箱固定30分鐘，棄固定液，再用pH為7.4的PBST洗滌I次細胞培養(yǎng)板，將細胞培養(yǎng)板甩干；
[0058]將鼠源Cap蛋白單克隆抗體用PBS進行1:2000倍稀釋得到鼠源Cap蛋白單克隆抗體稀釋液，將鼠源Cap蛋白單克隆抗體稀釋液按100 μ I/孔加入到甩干的細胞培養(yǎng)板中，然后將細胞培養(yǎng)板在37°C下?lián)u床孵育60分鐘，棄細胞培養(yǎng)板中的液體，再用pH為7.4的PBST洗滌3次細胞培養(yǎng)板后甩干；
[0059]將FITC-羊抗鼠二抗用PBS進行1:200倍稀釋得到FITC-羊抗鼠二抗稀釋液，將FITC-羊抗鼠二抗稀釋液按100μ I/孔加入到甩干的細胞培養(yǎng)板中，錫箔紙包裹細胞培養(yǎng)吧避光，然后將細胞培養(yǎng)板在37°C下?lián)u床孵育60分鐘，棄細胞培養(yǎng)板中的液體，再用pH為
7.4的PBST洗滌3次細胞培養(yǎng)板后甩干；
[0060]將甩干的細胞培養(yǎng)板于倒置熒光顯微鏡下觀察，按Reed和Muench法計算PCV2病毒的效價。
[0061]下面的實施例可以使本專業(yè)的專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0062](1) 0.1um濾菌器過濾PCV2病毒并繁殖四代
[0063]用含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)PK-15細胞，細胞密度2X 15個/ml，將PCV2病毒用0.1 μ m濾菌器過濾后，向MEM培養(yǎng)基中接種PCV2病毒，使PCV2病毒的接種量為MEM培養(yǎng)基體積的1%，將接種PCV2的細胞瓶置于溫度為37°C、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h ；
[0064]將培養(yǎng)后的細胞瓶取出，置于溫度為-70°C的冰箱中冷凍12h，再將細胞瓶常溫(15~25°C )中融化，再將細胞瓶進行兩次凍融操作，即共反復三次凍融操作，得到細胞瓶中凍融好的PCV2病毒懸液；
[0065]然后，將凍融好的PCV2病毒懸液作為接種種毒，采用步驟(1)中的方法處理3次，制得PCV2病毒；
[0066](2)PCV2病毒用終濃度2.5 μ g/ml的Plasmocin處理兩代
[0067]用含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)PK-15細胞，細胞密度2X 15個/ml，向MEM培養(yǎng)基中接種步驟⑴中制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接種量為與MEM培養(yǎng)基體積的I %，并加入終濃度2.5 μ g/ml的Plasmocin，將接種PCV2的細胞瓶置于溫度為37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72~96h細胞鋪滿后，將細胞瓶按照步驟(1)的凍融操作，反復3次凍融，得到細胞瓶中凍融好的PCV2病毒懸液。
[0068]然后，將凍融好的PCV2病毒懸液作為接種病毒，再重復一次步驟(2)中的操作，制得PCV2病毒。
[0069](3)常規(guī)繁殖PCV2兩代
[0070]用含5 %胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細胞，細胞密度2 X 15個/ml，再向MEM培養(yǎng)基中接種步驟(2)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接種量為MEM培養(yǎng)基體積的I %，然后將接種PCV2病毒的細胞瓶，置于溫度為37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h ;將細胞瓶反復進行3次凍融操作，得到細胞瓶中凍融好的PCV2病毒懸液；
[0071]將凍融好的PCV2病毒懸液作為接種病毒，重復一次步驟(3)的操作，繼續(xù)繁殖一代PCV2病毒，即制得所需的PCV2病毒。
[0072](4)支原體鑒定
[0073]為鑒定PCV2經處理后支原體的去除情況，用套式PCR法鑒定PCV2中的支原體，將步驟(3)中凍融好的PCV2病毒懸液為樣品，將樣品在沸水中煮沸5分鐘，然后8000rpm離心10分鐘，取上清作為PCR反應模板，并設豬滑液囊支原體作陽性對照，滅菌雙蒸水作陰性對照，按下述方法進行PCR擴增。
[0074]第一次循環(huán):
[0075]擴增上游引物Pl:AAGTCGTAACAACCTATCCCTA
[0076]下游引物P2:GTGTCTGGTTAGTATTTAGCCTTA
[0077]擴增體系:在PCR小管內依次加入=1XPCR buffer3 μ I,上游引物I μ 1，下游引物I μ I, dNTP2 μ I, TaqEl μ I,模板I μ I，補足滅菌雙蒸水至30 μ I。
[0078]反應程序:
[0079]第一步94°C預變性3分鐘，94°C變性I分鐘，56°C退火I分鐘，68 °C延伸I分鐘，共30個循環(huán)；68°C延伸10分鐘。
[0080]將第一次循環(huán)的PCR產物，取I μ I作為模板，進行第二次PCR循環(huán)，反應擴增體系中各成分加入量與第一次循環(huán)相同。
[0081]第二次循環(huán):
[0082]擴增上游引物Ρ3:GCAAGTCGATGAAGGACG
[0083]下游引物P4: GCTTCGCTCGCCACTACT
[0084]反應程序94 °C預變性3分鐘，94 V變性I分鐘，58 V退火30秒，68 °C延伸30秒，共30個循環(huán)；68°C延伸10分鐘。
[0085]核酸電泳檢測:用I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測第二次PCR擴增的產物，結果出現預期大小22Ibp的目的條帶。
[0086]具體可參考圖1的電泳檢測樣品中支原體結果圖，圖中由左至右的5條光帶，依次是指:1、處理的PCV2 ;2、未處理的PCV2 ;3、陰性對照；4、陽性對照；5、Marker (2000bp)。
[0087](5)PCV2TCID5Q 測定
[0088]先用MEM培養(yǎng)基將PK-15細胞稀釋成密度為2 X 105/ml的細胞懸液，將細胞懸液100 μ I/孔加入96孔細胞板中，再將步驟(3)中凍融好的PCV2病毒懸液10倍系列梯度稀釋，選擇10' 10' 10_4、10_5、10' 10_7這6個梯度，100 μ I/孔加入到細胞懸液中，每個梯度重復6個孔，同時設MEM作陰性對照、107_3TCID5ciAil的PCV2病毒作陽性對照，陰性、陽性對照各I孔。37°C 5%濃度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。棄掉細胞培養(yǎng)板中的液體，每孔加入100 μ I冷的甲醇-丙酮固定液(按甲醇與丙酮體積比1:1配制)，_20°C冰箱固定30分鐘，棄固定液，用PH7.4的PBST洗I次，自然晾干。將鼠源Cap蛋白單克隆抗體用PBS進行1:2000倍稀釋，稀釋后的鼠源Cap蛋白單克隆抗體按100 μ I/孔加入到晾干的培養(yǎng)板中，于37°C下?lián)u床孵育60分鐘。棄培養(yǎng)板中液體，PBST洗滌3次后甩干。FITC-羊抗鼠二抗用PBS1:200稀釋后，稀釋后的FITC-羊抗鼠二抗按100 μ I/孔加入上述甩干的細胞板中，錫箔紙包裹細胞培養(yǎng)板避光，并置37°C下?lián)u床孵育60分鐘。棄細胞培養(yǎng)板中液體，PBST洗滌3次后甩干。將甩干的細胞培養(yǎng)板于倒置熒光顯微鏡下觀察，按Reed和Muench法計算PCV2的病毒效價。
[0089]具體可參考圖2的PCV2TCID5Q病毒效價測定的IFA圖片，其中圖A、B、C、D、E、F依次為試驗組樣品稀釋10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7的熒光測定圖片；圖G、H、1、J、K、L依次為陽性對照稀釋10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7的熒光測定圖片；M為陰性對照的熒光測定圖片(顯微鏡放大倍率為1X 10)。
[0090](6)將PCV2病毒按MEM培養(yǎng)基I %的體積，接種密度為2 X 15個/ml的PK-15細胞懸液，并將接種PCV2含MEM培養(yǎng)基的細胞瓶置于溫度為37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，反復凍融操作3次，并按此方法連續(xù)繁殖3代，瓊脂糖凝膠電泳未檢測到支原體，說明該方法已徹底去除了 PCV2中污染的支原體，重復性好，為PCV2各種類型疫苗的研制與開發(fā)提供了無支原體且效價高的病毒。
[0091]最后，需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有很多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容中直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種去除PCV2病毒中支原體污染的方法，其特征在于，具體步驟包括: (1)0.1ym濾菌器過濾PCV2病毒并繁殖四代； (2)PCV2病毒用終濃度2.5 μ g/ml的Plasmocin處理兩代； (3)常規(guī)繁殖PCV2兩代； 所述步驟(1)具體包括下述步驟: A、用含5%胎牛血清(PAA，A10209-1611)的 MEM 培養(yǎng)基(GIBC0，574131)培養(yǎng) PK-15 細胞，細胞密度為2X 15個/ml，將PCV2病毒用0.1 μ m濾菌器過濾后，向MEM培養(yǎng)基中接種PCV2病毒，使PCV2病毒接種量為MEM培養(yǎng)基體積的I %，然后將裝有接種PCV2病毒的MEM培養(yǎng)基的細胞瓶，置于溫度為37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h ； B、將步驟A培養(yǎng)后的細胞瓶，進行凍融操作:將細胞瓶置于溫度為_70°C的冰箱中冷凍12h，然后再取出細胞瓶置于常溫(15~25°C )中融化； C、再將細胞瓶進行步驟B的凍融操作兩次，即共反復三次凍融操作，得到細胞瓶中凍融好的PCV2病毒懸液； D、將步驟A中的PCV2病毒替換成步驟C中得到的凍融好的PCV2病毒懸液，再依次重復步驟A、步驟B、步驟C的處理3次，即制得PCV2病毒； 所述步驟(2)具 體包括下述步驟: E、用含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細胞，細胞密度2X15個/ml，再向MEM培養(yǎng)基中接種步驟(1)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接種量為MEM培養(yǎng)基體積的1%，并向MEM 培養(yǎng)基中加入 Plasmocin (Invivogen,MPT-34_01B),使 Plasmocin 的終濃度為 2.5 μ g/ml，然后將裝有接種了 PCV2病毒的MEM培養(yǎng)基的細胞瓶，置于溫度為37°C、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72~96h ;細胞鋪滿后，將細胞瓶反復進行3次步驟B中的凍融操作，得到細胞瓶中凍融好的PCV2病毒懸液； F、將步驟E中的PCV2病毒替換成步驟E中得到的凍融好的PCV2病毒懸液，重復一次步驟E的操作，繁殖一代PCV2病毒； 所述步驟(3)具體包括下述步驟: G、用含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細胞，細胞密度2X15個/ml，再向MEM培養(yǎng)基中接種步驟(2)制得的PCV2病毒，使PCV2病毒接種量為MEM培養(yǎng)基體積的I %，然后將裝有接種了 PCV2病毒的MEM培養(yǎng)基的細胞瓶，置于溫度為37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h ;將培養(yǎng)后的細胞瓶取出后，反復進行3次步驟B中的凍融操作，得到細胞瓶中凍融好的PCV2病毒懸液； H、將步驟G中的PCV2病毒替換成步驟G中得到的凍融好的PCV2病毒懸液，重復一次步驟G的操作，繼續(xù)繁殖一代PCV2病毒，即制得所需的PCV2病毒。
【文檔編號】C12N7/00GK104073472SQ201410309926
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月1日 優(yōu)先權日:2014年7月1日
【發(fā)明者】李少麗 申請人:杭州薦量獸用生物制品有限公司