一株用于拮抗太子參?；图怄哏牭毒慕獾矸垩挎邨U菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株用于拮抗太子參?；图怄哏牭毒慕獾矸垩挎邨U菌。該菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）BN-D，已于2014年5月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCCNo.9114。該菌株可高效抑制太子參根際土壤的?；图怄哏牭毒?，在該領域的應用前景廣闊。
【專利說明】一株用于拮抗太子參?；图怄哏牭毒慕獾矸垩挎邨U菌

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一株用于拮抗太子參專化型尖孢鐮刀菌的解淀粉芽孢桿菌。

【背景技術】
[0002]太子參iPseudstellariae heterophylla)是一種比較名貴的中藥材,含氨基酸、糖類、苷類、磷脂類、環(huán)肽類以及微量元素等。有補氣益血、生津補脾胃的作用，適于小兒夏季久熱不退，咳嗽，飲食不振，心悸等虛弱之癥及小兒病后體弱無力、盜汗、口平等癥。隨著太子參藥效藥理研究的日益深入，太子參作為補益藥物，逐漸成為我國常用大宗藥材之一。
[0003]太子參用途廣泛，市場需求很大。但是，其連作障礙極其嚴重，即在同一塊地里連續(xù)種植太子參的情況下，即使在加強田間管理的情況下，其生長狀況變差，甚至絕收，其品質(zhì)變劣，多糖和總?cè)藚⒃碥蘸匡@著下降。 申請人:經(jīng)過研究證實，太子參連作后，根際土壤中太子參?；图怄哏牭毒?Fusarium oxysporum f.sp.heterophylla)數(shù)量極顯著增加，重巷太子參?；图怄哏牭毒鷉.sp.heterophylla)傲照近5倍；將分離到的太子參?；图怄哏牭毒臃N于種植太子參的健康土壤中，太子參?；图怄哏牭毒诮】低寥乐写罅吭鲋常仪秩咎訁⒏?，引發(fā)太子參病害。
[0004]近幾年，隨著綠色農(nóng)業(yè)、有機農(nóng)業(yè)以及微生物防治的特殊作用機制的研究正在蓬勃發(fā)展，而獲得高效拮抗菌并使其作用發(fā)揮到最大則是生物防治的基礎。對尖孢鐮刀菌的生物防治在其他作物( 香蕉、西瓜、黃瓜，草莓等)中研究比較多，分離報道的拮抗菌種類也較全面。如木霉、叢枝菌根真菌(AM)、非致病尖孢鐮刀菌、淡紫擬青霉、假單胞細菌、芽孢桿菌、放線菌等，戴君勇等從香石竹、棉花植物根際土壤分離過解淀粉芽孢桿菌KL-1，并用于香石竹尖孢鐮刀菌(F.0xysporum f.sp.Diathi)、棉花枯萎病菌(F.0xysporum f.sp.vasinfectum)的防治。但本研究分離的菌株和他們相比來源不同，針對的對象也不同，由于尖孢鐮刀菌存在著遺傳多態(tài)性的緣故。作為一種世界性分布的土傳病原真菌，尖孢鐮刀菌種內(nèi)的致病菌株具有高度的寄主專化性，從棉花地里分離的解淀粉芽孢桿菌KL-1并不一定對太子參專化型鐮刀菌有很好的效果。目前已經(jīng)分離的針對太子參專化型尖孢鐮刀菌的拮抗菌種類只有《用于拮抗太子參根際土壤尖孢鐮刀菌的多粘類芽孢桿菌》(專利號:CN 102676435 B)，還未見針對太子參?；图怄哏牭毒慕獾矸垩挎邨U菌的相關報道。本課題組在前期研究中，通過稀釋涂平板法和平板對峙試驗從福建省寧德市柘榮縣溪源村太子參GAP基地試驗田采集重茬太子參根際土樣中分離到了一株可高效抑制太子參專化型尖孢鐮刀菌的解淀粉芽孢桿菌amyloliquefaciens'),命名為BN_D,該拮抗菌的分離可為太子參根腐病的生物防治提供新的生防菌劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為此，本發(fā)明從太子參重茬根際土壤中篩選到一株用于拮抗太子參?；图怄哏牭毒慕獾矸垩挎邨U菌。
[0006]本發(fā)明提供的一株用于拮抗太子參根際土壤太子參?；顽牭毒慕獾矸垩挎邨U菌，為解淀粉芽抱桿菌{Bacillus amyloliquefaciens) BN-D,已于2014年5月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCCN0.9144。
[0007]該菌可在芽孢桿菌通用培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵。培養(yǎng)基成分:胰蛋白胨(Tryptone)10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 5g/L, pH 7.0。
[0008]在油鏡下(目鏡10X，物鏡100X)下觀察該菌革蘭氏染色結(jié)果，該菌為桿菌，革蘭氏染色呈陰性。該菌株經(jīng)形態(tài)學和16s RNA分子生物學鑒定，確定為解淀粉芽孢桿菌(.Baci Ilus amyloli quefaci ens )。
[0009]該菌株能較廣泛利用碳源，包括:L_鼠李糖、蔗糖、D-葡萄糖和D-甘露醇，但對部分碳源不利用，包括:D-果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-肌醇、麥芽糖及纖維二糖，也能較廣泛利用氮源，可使淀粉水解，不利用纖維素。
[0010]本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌{Bacillus amyloli quefaci ens )BN_D,可高效抑制太子參根際土壤的專化型尖孢鐮刀菌，在該領域的應用前景廣闊。該菌株已于2014年5月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保蕆，其簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCCN0.9144。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為解淀粉芽抱桿菌iBaci Ilus amyloli quefaci ens ) BN-D在NA培養(yǎng)基生長圖。
[0012]圖2為解淀粉芽孢桿菌(ifeci77i/5.BN-D對太子參?；怄哏牭毒囊志Ч?。左圖為太子參專化型尖孢鐮刀菌對照；右圖為解淀粉芽孢桿菌BN-D拮抗太子參?；图怄哏牭毒囊志Ч?。
[0013]圖3為解淀粉芽孢桿菌(BaciUw1S對太子參毒性試驗；圖片中第一排為未加解淀粉芽孢桿菌BN-D的對照太子參盆栽苗，第二排為加入解淀粉芽孢桿菌BN-D的處理后的太子參盆栽苗。
[0014]圖4為解淀粉芽抱桿菌{Bacillus amyloli quefaci ens ) BN-D太子參專化型尖抱鐮刀菌太子參組培苗共培試驗。圖片從左到右依次為:不加任何菌的太子參組培苗；只加太子參?；顽牭毒奶訁⒔M培苗；同時加太子參?；顽牭毒?、解淀粉芽孢桿菌BN-D的太子參組培苗。

【具體實施方式】
[0015]1、解淀粉芽孢桿菌BN-D的分離與純化
土樣的采集:2012年從福建省寧德市柘榮縣溪源村太子參GAP基地試驗田采集重茬太子參根際土樣。采用5點采樣法，混合均勻做為樣品。
[0016]采用稀釋分離法對土樣微生物分離純化，稱取1g 土壤加入裝有90mL無菌水的三角瓶中，120r/min，振蕩 30min，將震蕩好的土壤懸液制成 10-1，10_2，10_3，10_4，10_5，10_6，10_7等不同稀釋度的土壤溶液。將上述稀釋的懸液涂抹于裝有LB培養(yǎng)基(配方如下:胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 10g/L,用 NaOH 調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的PH到7.0-7.4，每升加10g~15g瓊脂粉)的平板法上，每個濃度重復3次，置于30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，選取菌落數(shù)適宜的平板，挑取其中的單菌落，采用平行劃線的方法進行純化，連續(xù)3次轉(zhuǎn)接，確認為單一細菌。分別取分離純化后的土壤微生物接種到LB培養(yǎng)基上，30°C活化2天，然后接到PDA培養(yǎng)基上，用打孔器打取太子參尖孢鐮刀菌菌餅接到PDA (馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂每升加15~20克，自然PH)平板上進行平板對峙實驗，選取有明顯拮抗作用的菌株進行純化后保存、備用。
[0017]2、解淀粉芽孢桿菌的篩選及抑菌效果測定
將上述純化的有一定拮抗作用的各菌株與太子參尖孢鐮刀菌采用對峙培養(yǎng)法進行進一步篩選:取出上述純化的菌液100 μ L倒入LB平板培養(yǎng)基上，用滅菌的玻璃涂棒將稀釋液均勻的涂布，30°C培養(yǎng)7天。用直徑5_打孔器打取拮抗菌菌塊接入PDA培養(yǎng)基平板一邊，并打取同樣大小的尖孢鐮刀菌菌塊接入另一端，進行平板對峙培養(yǎng)。篩選拮抗效果好的菌株對其進行鑒定，經(jīng)形態(tài)學和16s rRNA分子生物學鑒定,確定為解淀粉芽孢桿菌、Bacillusamyloli quefaci ens ),命名為 BN-D。
[0018]解淀粉芽孢桿菌BN-D菌株經(jīng)種子罐發(fā)酵，至中試發(fā)酵罐進一步放大發(fā)酵后，在太子參種植后立即噴霧施用于土壤，或菌液發(fā)酵后，拌基肥施用于即將種植太子參的土壤。菌液噴霧施用或拌基肥施用，其施用濃度為106-108CFUs/mL。施用后將顯著提高太子參產(chǎn)量和品質(zhì)。
[0019]3、解淀粉芽孢桿菌BN-D的抑菌效果測定
在實驗室中，用打孔器將尖孢鐮刀菌及解淀粉芽孢桿菌BN-D各打成直徑為5_的小菌塊并分別將其移入PDA平板培養(yǎng)基的兩端。未接種該菌的PDA平板培養(yǎng)基中心位置接入相同大小的菌塊為空照。28°C恒溫培養(yǎng)5日，進行菌落直徑大小測量及抑制率計算，確定菌株的拮抗性能。
[0020]抑菌率計算公式:抑菌率(%)=(對照的尖孢鐮刀菌菌落直徑一接種該菌的尖孢鐮刀菌菌落直徑)/對照的尖孢鐮刀菌菌落直徑X100%。
[0021]結(jié)果，該菌株對尖孢鐮刀菌5天抑菌率達到93.2%，如圖2所示。
[0022]4、解淀粉芽孢桿菌BN-D菌株毒性試驗
將該解淀粉芽孢桿菌BN-D接入10mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天后，取培養(yǎng)3天的該菌菌液100 mL用無菌水稀釋5倍后施入太子參盆栽中，每天觀察太子參的生長情況，觀察該解淀粉芽孢桿菌對太子參是否有毒害作用。如圖3所示，與對照相比，太子參組盆栽苗生長良好，表明該解淀粉芽孢桿菌BN-D對太子參本身生長沒有毒害，不會使太子參致病。
[0023]5、解淀粉芽孢桿菌BN-D、太子參尖孢鐮刀菌及太子參組培苗共培試驗。
[0024]將200 μ L該拮抗菌菌液加入到太子參組培苗根際周圍,培養(yǎng)2天后在組培瓶邊緣接入鐮刀菌，每天觀察病原菌、拮抗菌、太子參組培苗之間的互作效果。
[0025]如圖4所示，太子參組培苗生長良好，只接入鐮刀菌的太子參組培苗則被鐮刀菌侵染而逐漸枯萎并最終死亡。而在接有太子參尖孢鐮刀菌及解淀粉芽孢桿菌BN-D的太子參組培瓶內(nèi)，解淀粉芽孢桿菌BN-D圍繞在組培苗周圍形成抑制區(qū),致使鐮刀菌無法越過抑制區(qū)而對太子參致病，并且太子參苗生長狀況與空白對照一樣長勢良好。最終在接入拮抗菌的組培瓶內(nèi)形成了以太子參苗為中心，外圍分別為拮抗菌、拮抗菌抑制區(qū)、鐮刀菌三者互作的局面。
[0026]5、解淀粉芽孢桿菌BN-D的應用前景
植物病害80%以上是由真菌引起的，控制真菌病害對于提高農(nóng)作物產(chǎn)量極其重要。尖孢鐮刀菌是一類典型的土傳病害真菌，在土壤和有機質(zhì)中數(shù)量多而活躍，其寄居范圍非常廣泛，可引起瓜類、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多種植物發(fā)生枯萎病，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中導致嚴重的作物減產(chǎn)，降低品質(zhì)，影響供應和外銷，甚至引起人畜中毒，造成嚴重的經(jīng)濟損失。 申請人:經(jīng)過研究證實:種植太子參后，根際土壤中太子參?；图怄哏牭毒鷶?shù)量極顯著增加；將分離到的尖孢鐮刀菌接種于種植太子參的健康土壤中，尖孢鐮刀菌在健康土壤中大量增殖，且侵染太子參根部，引發(fā)太子參病害。全國每年太子參總栽培面積約5萬多畝，按目前市場價格估算，全國產(chǎn)值約50億多元人民幣，但是連作后太子參根際土壤中?；图怄哏牭毒戎虏【筒≡龆?，使得產(chǎn)量急劇下降為頭茬(對照)的1/3以下，產(chǎn)生嚴重的經(jīng)濟損失，是一個急需解決的重要問題。解淀粉芽孢桿菌BN-D可高效抑制太子參專化型尖孢鐮刀菌，在該領域的應用前景廣闊。
【權利要求】
1.一株用于拮抗太子參?；图怄哏牭毒慕獾矸垩挎邨U菌{BacillusBN-D,已于2014年5月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏， 保藏編號為CGMCCN0.9144。
【文檔編號】C12N1/20GK104164383SQ201410263153
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年6月14日 優(yōu)先權日:2014年6月14日
【發(fā)明者】趙永坡, 林文雄, 吳林坤, 張志興, 方長旬, 初雷霞 申請人:福建農(nóng)林大學