一種嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列SEQ?ID?NO：2所示，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶性質(zhì)有利于纖維素高溫同步糖化發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用，該酶具有較高酶活和明顯作用效果，整個(gè)發(fā)酵期間纖維二糖保持在底濃度水平，能有效消除終端產(chǎn)物抑制，可以應(yīng)用于生產(chǎn)燃料乙醇工藝中，表明本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶在能源方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】-種嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶及其編碼基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶 及其編碼基因和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】：
[0002] β_葡萄糖苷酶（EC3. 2. 1.21)屬于纖維水解酶類，是一類催化水解或轉(zhuǎn)移 β-1，4-糖苷鍵的酶。是纖維素酶系的重要組成部分，在纖維素酶水解纖維素的過程中， 纖維素類物質(zhì)經(jīng)酶促作用成葡萄糖至少需要三種酶的協(xié)同作用，葡聚糖內(nèi)切酶，葡聚糖外 切酶和β-葡萄糖苷酶。葡聚糖內(nèi)切酶和葡聚糖外切酶把纖維素降解成纖維二糖，它再被 β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖釋放葡萄糖是纖維素水解的 一個(gè)關(guān)鍵限速步驟。
[0003] 但是，β_葡萄糖苷酶在纖維素酶系中含量最低，不足1 %，且活性普遍偏低，是纖 維素酶解轉(zhuǎn)化的瓶頸。長期以來，酶性質(zhì)不夠優(yōu)良、酶的產(chǎn)量低及酶的比活力低下一直是影 響酶實(shí)際應(yīng)用的重要因素。雖然葡萄糖苷酶在微生物中廣泛存在，但是真菌、細(xì)菌等微 生物的產(chǎn)酶效率不高，難以獲得大量產(chǎn)品，且熱穩(wěn)定性較差。目前β_葡萄糖苷酶的活力仍 不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，而且成本較高。在纖維素糖化過程中，纖維素酶的最適作用溫度 通常為50°C左右，而酵母發(fā)酵的最適溫度為30°C左右。如何使這兩個(gè)過程的溫度協(xié)調(diào)，是 采用同步糖化發(fā)酵（SSF)高效生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵，解決這種矛盾辦法之一就是采用耐高溫酵 母。因此，對(duì)β-葡萄糖苷酶基因的克隆與表達(dá)，已成為研究纖維素酶重要環(huán)節(jié)之一。到目 前為止，已有上百個(gè)微生物的β-葡萄糖苷酶基因得以克隆，許多微生物來源的β-葡萄糖 苷酶基因也已獲得異源表達(dá)。近年來，國際上通過基因重組技術(shù)構(gòu)建工程菌，分泌表達(dá)高活 性、熱穩(wěn)定的β-葡萄糖苷酶研究是纖維素酶學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
[0004] 關(guān)于嗜溫β -葡萄糖苷酶及其基因已有的專利和文獻(xiàn)報(bào)道：Piyanun Harnpicharnchai等報(bào)道的Periconia sp. β -葡萄糖苷酶基因片段BCC2871 [蛋白質(zhì)表 達(dá)與純化（Protein Expres Purif)67 :61 - 69,2009] ;Patrick Murraya 等報(bào)道嗜熱真菌 Talaromyces emersonii的β -葡萄糖苷酶基因 Cel3a[蛋白質(zhì)表達(dá)與純化（Protein Expres Purif)38 :248 - 257,2004] ;Qiaojuan Yan 等報(bào)道的 Paecilomyces thermophilaP -葡 萄糖苷酶基因 PtBglu3[蛋白質(zhì)表達(dá)與純化（Protein Expres Purif)84 :64 - 72,2012]; Xiao-Qiong Pei等報(bào)道的嗜熱Thermobifida FuscaP -葡萄糖苷酶基因 BglC[生物資源 技術(shù)（Bioresour. Technol.) 102 :3337 - 3342, 2011] ;Linguo Zhao 等報(bào)道的 Thermotoga thermarum DSM5069T高溫β -葡萄糖苷酶基因 Tt-bgl [分子催化雜志，B輯：酶催化（J MolCatalB-Enzym)95:62 - 69,2013]等。微生物產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的種類眾多，不同來源 的β-葡萄糖苷酶具有不同的性質(zhì)。由于工業(yè)上應(yīng)用的不同，因此需要不斷開發(fā)出具有新 特性的β-葡萄糖苷酶以更好的適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的需要。其中耐熱酶具有很大優(yōu)越性，可以 提高反應(yīng)速度、延長作用時(shí)間，減少污染、增強(qiáng)對(duì)化學(xué)試劑的耐受性等，以及可以在所需要 的特殊條件下進(jìn)行反應(yīng)，因此開發(fā)嗜溫β -葡萄糖苷酶已成為研究熱點(diǎn)。
[0005] 我們之前研究中，獲得了 2株β -葡萄糖苷酶的產(chǎn)生菌：綠色木霉 (Trichoderma viride) W2,專利號(hào) ZL201010577713. 6 和肉座菌（Hypocrea sp.) W63,專利 號(hào)ZL201110417104. 9,這2株菌均有嗜溫、耐乙醇的特性，其中綠色木霉（Trichoderma viride) W2最適反應(yīng)pH值為4. 8,最適反應(yīng)溫度為70°C，乙醇濃度為10% (v/v)對(duì)酶活有 最大促進(jìn)作用，對(duì)β_葡萄糖苷酶酶活提高1.6倍，乙醇耐受能力高達(dá)30% (v/v);肉座菌 (Hypocrea sp. )W63最適反應(yīng)pH值為4. 8,最適反應(yīng)溫度為65°C，乙醇濃度為10% (v/v) 對(duì)酶活有最大促進(jìn)作用，對(duì)β_葡萄糖苷酶酶活提高將近1倍，乙醇耐受能力高達(dá)30% (v/ v)。
[0006] 通常情況下，真菌所產(chǎn)的纖維素酶系主要是內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，β -葡 萄糖苷酶在纖維素酶系中含量最低，不足1 %。利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建的基因工程菌具有 遺傳穩(wěn)定性高、產(chǎn)酶迅速、產(chǎn)酶量大等優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)的重組酶擬滿足未來大量工業(yè)應(yīng)用需求。 據(jù)國內(nèi)外已有的報(bào)道來看,嗜熱型β-葡萄糖苷酶基因克隆主要集中來自于嗜熱性細(xì)菌、 真菌，然而這些嗜熱型微生物所產(chǎn)的β_葡萄糖苷酶并不一定就具有嗜熱及熱穩(wěn)定性能。 在產(chǎn)β_葡萄糖苷酶微生物研究中，木霉是研究最早和最廣泛的種屬之一，但是從肉座菌 屬克隆的具有嗜溫耐乙醇性能的β_葡萄糖苷酶基因尚未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種嗜溫耐乙醇葡萄糖苷酶及其編碼基因。
[0008] 本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID Ν0 :2 所示。
[0009] 本發(fā)明的編碼嗜溫耐乙醇葡萄糖苷酶的基因，其特征在于，編碼氨基酸序列 如SEQ ID Ν0 :2所示的嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶。
[0010] 所述的編碼嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶的基因，優(yōu)選，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0 : 1所示。
[0011] 肉座菌（Hypocrea sp.)W63(ZL201110417104. 9)生產(chǎn)嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶， 該酶具有水解4-nitrophenyl β -D-glucopyranoside (pNPG)底物特異性，其最適反應(yīng)pH 值為4. 8,最適反應(yīng)溫度為65°C，反應(yīng)中乙醇濃度為10% (v/v)對(duì)酶活有最大促進(jìn)作用，對(duì) β -葡萄糖苷酶酶活提高將近1倍，乙醇耐受能力高達(dá)30% (v/v)。
[0012] 本發(fā)明從肉座菌（Hypocrea sp.)W63得到的嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶基因 印B-BGL，具有2202bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示，該嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶基 因編碼由733個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID Ν0 :2所示。本發(fā)明通過分子 生物學(xué)方法獲得了含有該基因片段的以PPIC9K為表達(dá)載體的重組質(zhì)粒，以畢赤酵母GS115 為表達(dá)宿主，使重組菌株胞外分泌表達(dá)嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶。因此，本發(fā)明成功通過 基因工程或分子生物學(xué)手段，將嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶基因克隆到其他受體菌，由其 他受體菌產(chǎn)生本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶。
[0013] 與已知的葡萄糖苷酶相比，本發(fā)明的嗜溫耐乙醇葡萄糖苷酶是一種新型 的具有新功能的β_葡萄糖苷酶，通過對(duì)本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β_葡萄糖苷酶的基因推導(dǎo) 氨基酸的序列比較分析，本發(fā)明的嗜溫耐乙醇葡萄糖苷酶與其他已報(bào)道的葡萄糖 苷酶的氨基酸序列相比，SEQ ID Ν0 :2所示的氨基酸序列與來源于里氏木霉Trichoderma reesei的β-葡萄糖苷酶（Genbank索引號(hào)AAA18473. 1)同源性最高，它們的氨基酸序列相 似性為79%，相似性高于79%的β -葡萄糖苷酶來源于深綠木霉Trichoderma atroviride 的 IMI206040(Kubicek, C. Ρ·等，Genome Biol. 12(4)，R40 (2011)，未做功能鑒定）；綠木霉 Trichoderma virens 的 Gv29_8,（Kubicek，C.P.等，Genome Biol. 12(4)，R40 (2011)，未做功 能鑒定）。本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶與其它已報(bào)道的β-葡萄糖苷酶氨基酸序 列比對(duì)以后發(fā)現(xiàn)，相似性大于79%的菌株中，都是進(jìn)行序列比對(duì)或蛋白結(jié)構(gòu)的研究，目前為 止并沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)相應(yīng)菌株的β_葡萄糖苷酶基因的功能進(jìn)行鑒定的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。由此可 見，本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶基因 epB-BGL是一個(gè)新的基因。本發(fā)明的嗜溫耐 乙醇β -葡萄糖苷酶已在GenBank上提交核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示， 其序列號(hào)為KJ502670。
[0014] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種重組表達(dá)載體，其特征在于，含有本發(fā)明的嗜溫 耐乙醇β-葡萄糖苷酶基因。
[0015] 所述的重組表達(dá)載體，其表達(dá)載體優(yōu)選為pPIC9K表達(dá)載體。
[0016] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種宿主細(xì)胞，其特征在于，含有上述重組表達(dá)載體 的真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。
[0017] 所述的原核細(xì)胞，可以為各種細(xì)菌，如酵母工程菌、大腸桿菌或枯草桿菌。
[0018] 所述的酵母工程菌，優(yōu)選為畢赤酵母GS115菌株。
[0019] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供嗜溫耐乙醇葡萄糖苷酶在纖維素高溫同步糖化 發(fā)酵乙醇中的應(yīng)用。
[0020] 通過對(duì)酶的氨基酸序列相似性分析，目前已知的β -葡萄糖苷酶分別有屬于糖苷 水解酶第1和第3家族。通過對(duì)本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶序列比對(duì)分析，認(rèn)為 其屬于糖苷水解酶第3家族的一員。
[0021] 此外，本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶的酶學(xué)特性不同于已知的β -葡萄糖 苷酶，其反應(yīng)酶活經(jīng)活性測(cè)定，其反應(yīng)溫度為40-90°C，其最適反應(yīng)溫度為70°C ;反應(yīng)pH值 為4. 0-6. 5,最適反應(yīng)pH值為5.0;乙醇濃度在30 % (v/v)以內(nèi)均能對(duì)β-葡萄糖苷酶酶 活有促進(jìn)作用，其中反應(yīng)體系中乙醇濃度為10-20% (ν/ν)時(shí)對(duì)β -葡萄糖苷酶活力促進(jìn)效 果最強(qiáng)，β -葡萄糖苷酶活力提高86. 29 %，證明該酶具有在高溫、乙醇存在條件下保持較 高酶活的特點(diǎn)。該嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶的分子量為76740道爾頓，pi為6. 01。純化 后該酶的最佳比活力為194.25U/mg，其特異底物為pNPG，該酶是一種特異催化水解β-葡 萄糖苷鍵將纖維二糖降解成葡萄糖的酶，是纖維素酶系中一類關(guān)鍵的酶，將本發(fā)明的嗜溫 耐乙醇β -葡萄糖苷酶應(yīng)用在高溫同步糖化上生產(chǎn)乙醇，首先對(duì)生物質(zhì)原料預(yù)水解，然后 加入嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶酶液和耐高溫酵母進(jìn)行高溫同步糖化發(fā)酵，能有效消除纖 維二糖抑制，乙醇產(chǎn)量提高39%。在以纖維素為原料生產(chǎn)燃料乙醇的同步糖化發(fā)酵工藝中 的纖維素酶酶解和酵母菌發(fā)酵的最適條件下，該酶具有較高酶活，可以應(yīng)用該工藝中以生 產(chǎn)燃料乙醇，因此，本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶在能源方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0022] 圖1是重組質(zhì)粒pPIC9K的構(gòu)建模式圖；
[0023] 圖2是本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶cDNA的凝膠電泳圖，其中，Μ泳道是 Marker，泳道1為目的基因的cDNA ;
[0024] 圖3是本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶克隆質(zhì)粒pPIC9K-印B的EcoRI，AvrII 雙酶切電泳圖，其中Μ泳道為Marker，泳道1為質(zhì)粒pPIC9K-印B的EcoRI，AvrII雙酶切；
[0025] 圖4是P. pastoris GS115表達(dá)嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶純化的電泳圖，其中Μ 泳道為Marker,泳道1為Micro-Prep DEAE柱純化；
[0026] 圖5是本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶蛋白質(zhì)譜的二級(jí)峰圖；
[0027] 圖6是本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶最佳反應(yīng)溫度及pH值；
[0028] 圖7是乙醇添加對(duì)本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶酶活的影響；
[0029] 圖8是添加本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶對(duì)高溫同步糖化發(fā)酵效果。

【具體實(shí)施方式】：
[0030] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0031] 在本發(fā)明的實(shí)施例中所用到的材料包括：真菌總RNA快速抽提試劑盒（購自生工 生物工程有限公司）；cDNA第一鏈合成試劑盒（購自Thermo公司）；巴氏畢赤酵母（Pichia pastoris)GS115、引物合成（購自 Invitrogen 公司）；pPIC9K表達(dá)載體（購自 Invitrogen 公司）；感受態(tài)細(xì)胞 Trans-Tl、pEASY-Blunt Zero Cloning Kit(購自 TransGen Biotech); PCR試劑、限制性內(nèi)切酶EcoRI、Avr II和Sal I，T4DNA連接酶（購自Takara公司），纖維 素酶（購自Genencor公司），高溫酵母菌NCYC587 (購于英國國立酵母保藏中心）；肉座菌 (Hypocreasp.)W63于2011年9月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心（CGMCC)，其保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 5209(該菌株公布于中國專利201110417104. 9)。
[0032] P. pastoris GS115感受態(tài)細(xì)胞的制備為現(xiàn)有技術(shù)。
[0033] 實(shí)施例1 :本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶基因克隆
[0034] 1、肉座菌（Hypocrea sp. ) W63 總 RNA 的提取
[0035] 前期研究證明，由肉座菌（Hypocrea sp. )W63所產(chǎn)的β -葡萄糖苷酶具有嗜溫耐乙 醇的酶學(xué)性能，在高溫和乙醇存在的情況下保持酶的高活性，不同于已知的β-葡萄糖苷 酶。因此，在本實(shí)施例中，利用真菌總RNA快速抽提試劑盒提取肉座菌（Hypocrea sp.)W63 的RNA，具體操作步驟如下：
[0036] (1)、取 450 μ L Buffer Rlysis-F 加入 1. 5mL RNase-free 的離心管中備用；
[0037] (2)、取其新鮮培養(yǎng)物，離心收集菌體，0. lg菌絲在液氮中充分研磨，移入上述lmL 離心管中，立即震蕩混勻，室溫放置5min ;
[0038] (3)、向裂解樣品中加入0. 2mL氯仿，用旋渦震蕩器混勻。于4°C下12, 000g離心 5min，小心吸取上清夜；
[0039] (4)、上清液轉(zhuǎn)移至1. 5mL RNase-free的離心管中，加入1/2體積無水乙醇，充分混 勻；
[0040] (5)、將吸附柱放入收集管中，用移液器將全部溶液加至吸附柱中，靜置lmin， 12, 000g離心lmin，倒掉收集管廢液；
[0041] (6)、在吸附柱中分別加入 10XDNase I Buffer3 μ L ;Recombinant DNase I (5U/ μ L) 1. 5 μ L ;RNase Inhibitor (40U/ μ L) 1. 5 μ L ;DEPC-treated water24 μ L，37。。反應(yīng) 20-30min，除去 DNA 干擾；
[0042] (7)、在吸附柱中加入 500 μ L GT Solution，靜置 lmin，10, OOOg 離心 lmin，倒掉收 集管廢液；
[0043] (8)、將吸附柱放入收集管中，加入500 μ L NT Solution，靜置lmin，10, 000g離心 lmin，倒掉收集管廢液；
[0044] (9)、將吸附柱放入收集管中，12, 000g離心2min，打開蓋子數(shù)分鐘（揮發(fā)殘留乙 醇）；
[0045] (10)、將吸附柱放入 1. 5mL RNase-free 的離心管中，加入 30-50 μ L DEPC-treated water，靜置2min，12, 000g離心2min，將所得的RNA置于-70°C凍存。
[0046] 2、本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶基因 cDNA克隆
[0047] 采用cDNA第一鏈合成試劑盒，取上述的總RNA溶液1 μ L作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 cDNA連接，然后從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索到7種β -葡萄糖苷酶相似性較高的氨基酸序列， 利用DNAman軟件中的Multiple Sequence Alignment對(duì)這些序列進(jìn)行同源性比較，根據(jù)同 源β-葡萄糖苷酶基因的兩段高度保守序列和已知序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物Pi和匕。對(duì)反轉(zhuǎn)錄 的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0048] Pi ：5-WSN ATH TGG GAY ACN TT-3
[0049] P3 :5-CC NAR YTG YTT NCK CAT-3
[0050] TOUCHDOWN PCR (降落 PCR):
[0051] 反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性3min ;然后進(jìn)行以下循環(huán)：94°C變性30s ;60-45°C退火 30s ;72°C延伸30s，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；94°C變性30s ;45°C退火30s ;72°C延伸30s，進(jìn)行25個(gè) 循環(huán)；最后72°C延伸6min。進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有無適當(dāng)大小的目的條帶。然 后于-20°C保存PCR產(chǎn)物。獲得目的條帶，大小約1.8kb。
[0052] 根據(jù)已知序列比對(duì)設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序如下：94°C預(yù)變性 5min，然后進(jìn)行以下循環(huán)：94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最 后72°C延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。目的基因片段的連接、轉(zhuǎn)化、 鑒定和測(cè)序。獲得目的基因全長cDNA，大小約2. 2kb (如圖2所示）。
[0053] 將獲得的序列用NCBI上的軟件BLAST對(duì)序列進(jìn)行分析，得到嗜溫耐乙醇β -葡萄 糖苷酶的編碼基因，命名為epB-BGL，由2202個(gè)核苷酸組成，嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶基 因 epB-BGL編碼一個(gè)含733個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，用DNAstar軟件預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)理論分子量 大小為76550. 45道爾頓，等電點(diǎn)pi為6. 01。和印B-BGL基因催化功能域同源性最高的是 來源于里氏木霉Trichodermareesei的β-葡萄糖苷酶（Genbank索引號(hào)AAA18473. 1)，它 們的氨基酸序列相似性為79%。本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶基因 epB-BGL已在 GenBank上提交核苷酸序列，獲得序列號(hào)為KJ502670。
[0054] 實(shí)施例2 :本發(fā)明的β -葡萄糖苷酶在酵母工程菌中表達(dá)和純化
[0055] 1、印B-BGL基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0056] 根據(jù)已獲得的嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶全長cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)表達(dá)引物印3、 印5,去除信號(hào)肽序列和3'、5'非編碼區(qū)序列，為保證印B-BGL基因定向插入載體pPIC9K，在 上下游引物兩端分別引入EcoRI和Avr II酶切位點(diǎn)。兩引物間距約2. 5kb，擴(kuò)增產(chǎn)物包含嗜 溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶成熟蛋白編碼序列，
[0057] 印3 :5'-CGGAATTCATGCTTTACACAGCCGTAGCG-3'
[0058] 印5 :5'-CCCCTAGGCTATGAGACCGTGAAGCTTCC-3'
[0059] 以擴(kuò)增嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶全長cDNA的PCR產(chǎn)物為模板，以印5、印3為上 下游引物進(jìn)行PCR，獲得嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶成熟肽的基因表達(dá)序列。將目的基因片 段回收后，利用pEASY-Blunt Zero Cloning Kit將目的片段與pPIC9K表達(dá)載體進(jìn)行連接， 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans-Tl，通過菌落PCR、質(zhì)粒DNA的酶切鑒定篩選出陽性克隆 并測(cè)序，將測(cè)序鑒定正確的質(zhì)粒命名為PPIC9K-印B。
[0060] 將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證含嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶基因正確讀碼框的質(zhì)粒PPIC9K-印B 用EcoRI和Avr II雙酶切，回收插入片斷，并與同樣雙酶切的酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K用T4DNA 連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans-Tl，轉(zhuǎn)化的Trans-Tl經(jīng)Amp抗性篩選，菌 落經(jīng)37°C搖培過夜后抽提質(zhì)粒，重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定并測(cè)序，酶切鑒定結(jié)果如圖3所示， 將該重組質(zhì)粒命名為PPIC9K-印B，其構(gòu)建模式圖如圖1所示。
[0061] 2、重組質(zhì)粒pPIC9K-印B在巴氏畢赤酵母GS115中的表達(dá)、純化
[0062] 用Sal I限制性內(nèi)切酶（位于His4區(qū)域內(nèi)）將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pPIC9K-印B進(jìn) 行線性化酶切，同時(shí)將空PPIC9K載體質(zhì)粒與含印B-BGL基因的重組質(zhì)粒pPIC9K-印B的線 性化酶切及酵母轉(zhuǎn)化同步進(jìn)行，作陽性對(duì)照。
[0063] 酵母轉(zhuǎn)化和篩選：
[0064] (l)、P.pastorisGSll5 感受態(tài)細(xì)胞的制備；
[0065] (2)、重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K_epB電擊轉(zhuǎn)化P. pastoris GS115感受態(tài)細(xì)胞，電擊法的 具體步驟如下：
[0066] a、將10 μ L線性化DNA與80 μ L的上述步驟（1)所得的菌體混勻，轉(zhuǎn)至0· 2cm預(yù) 冷的電轉(zhuǎn)化杯中；
[0067] b、將電轉(zhuǎn)化杯置冰上冰浴5min
[0068] c、根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀的內(nèi)置酵母轉(zhuǎn)化程序進(jìn)行電擊：電壓1.5-1. 8kV，電容25yF;電 阻200 Ω。電擊時(shí)間為4-5msec
[0069] d、電擊完畢后，立即向電轉(zhuǎn)杯加入lmLIM山梨醇溶液，將菌體混勻，轉(zhuǎn)至新的EP管 中，將菌體均勻涂布于MD平板上，30°C培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)，觀察菌落的大小并計(jì)數(shù)，篩選在 MD平板上菌落形態(tài)生長飽滿的轉(zhuǎn)化子。
[0070] (3)、將電擊轉(zhuǎn)化后的待檢酵母轉(zhuǎn)化子用無菌的一次性牙簽按一定方向?qū)?yīng)接種 于MD平板上，30°C倒置培養(yǎng)2-4d，甘油種保存。
[0071] 酵母工程菌的培養(yǎng)和嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶的誘導(dǎo)分泌表達(dá)：
[0072] (1)、挑取上述陽性菌落，接種于含25mL BMGY培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，28-30°C振蕩 培養(yǎng)（250-300rpm)至對(duì)數(shù)生長期（0D600達(dá)2-6,約16-18小時(shí)），以轉(zhuǎn)化pPIC9K空載體的 GS115菌株作為對(duì)照；
[0073] (2)、室溫下以3000g離心5min回收酵母細(xì)胞，棄去上清，將細(xì)胞重懸于適當(dāng)體積 的BMMY培養(yǎng)基中，至0D600值為1. 0-2. 0 (約100-200mL)將培養(yǎng)液置于500mL搖瓶中，覆 蓋8層無菌紗布，置搖床中，28-30°C繼續(xù)培養(yǎng)并開始誘導(dǎo)表達(dá)（注意誘導(dǎo)溫度應(yīng)嚴(yán)格控制， 不要超過30°C );
[0074] (3)、誘導(dǎo)表達(dá)起始后，每隔24h補(bǔ)加100%甲醇至終濃度為1%以維持誘導(dǎo)；
[0075] (4)、誘導(dǎo)表達(dá)5d，取發(fā)酵上清液，4°C，12000rpm離心，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的酶活性進(jìn)行 檢測(cè)分析。
[0076] 嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶工程菌表達(dá)產(chǎn)物的純化：
[0077] 將提取的粗酶液用90%飽和度的硫酸銨沉淀4h后，4°C，14000rpm離心20min，收 集沉淀，用適量的緩沖液A(20mm 〇l/LTris-HCl緩沖液，pH7.0)回溶，將上清液施于經(jīng)緩沖 液A預(yù)先平衡好的Desalting脫鹽柱，收集A280nm處出峰的2mL，將脫鹽后收集的酶液施 于經(jīng)緩沖液A預(yù)先平衡好的Micro-Prep DEAE柱，酶蛋白先用3倍柱體積的緩沖液A洗脫 至A280不變后，再用5倍緩沖液A(20mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH7. 0和緩沖液B(lmol/ LTris-HCl緩沖液，pH7.0)的相同比例緩沖溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為lmL/min，每管收集 lmL。每管進(jìn)行酶活性測(cè)定和蛋白濃度測(cè)定，最后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度（結(jié)果如圖4 所示），純化后酶的最佳比活力為194. 25U/mg。經(jīng)SDS-PAGE電泳后切膠回收，對(duì)目的蛋白 進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定分析，測(cè)得酶的分子量為76740道爾頓，與理論推算的分子量（76550道 爾頓）相似，其蛋白質(zhì)譜結(jié)果二級(jí)峰圖如圖5所示。
[0078] 實(shí)施例3 :本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶酶學(xué)特性
[0079] 本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶的酶活力測(cè)定：用4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside (pNPG)作為底物，反應(yīng)體系為 2mL，先將 lmL pNPG(5mmol/L)和 0· 9mL pH5. 0Na2HP04-檸檬酸緩沖液混勻，再加入0. lmL適當(dāng)稀釋的上一步驟得到的嗜溫耐乙醇 β -葡萄糖苷酶制劑，50°C反應(yīng)lOmin，立即加入3mL 1 mol/L的Na2C03溶液終止反應(yīng)，室溫 放置5min，于400nm處測(cè)光吸收值（0D)。
[0080] 酶活定義：在lmin內(nèi)催化產(chǎn)生1 μ mol/L對(duì)硝基酚的量定義為一個(gè)酶單位。
[0081] 嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定：β -葡萄糖苷酶制劑，按pNPG測(cè) 定方法，其他條件不變情況下，調(diào)節(jié)不同pH緩沖液、不同溫度、不同乙醇濃度進(jìn)行酶活測(cè)定 反應(yīng)，以測(cè)得最高酶活為100%，該條件為測(cè)得嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)條件。 [0082] 本發(fā)明的嗜溫耐乙醇葡萄糖苷酶具有高溫和乙醇存在條件下保持高酶活 的特性，其反應(yīng)溫度為40-90°C，其最適反應(yīng)溫度為70°C (如圖6Α所示）；反應(yīng)pH值為 4. 0-6. 5,最適反應(yīng)pH值為5. 0-5.5 (如圖6B所示）；乙醇濃度在30 % (v/v)以內(nèi)均能對(duì) 嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶酶活有促進(jìn)作用，其中反應(yīng)體系中乙醇濃度為10-20% (v/v) 時(shí)對(duì)嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶活力促進(jìn)效果最強(qiáng)，嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶活力提高 86. 29%。
[0083] 實(shí)施例4 :本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶應(yīng)用于高溫同步糖化發(fā)酵
[0084] (1)、底物：甘蔗渣粉碎至60目，2%Na0H，80°C預(yù)處理2h，自來水沖洗至中性，65°C 烘干至恒重；
[0085] (2)、高溫酵母菌NCYC587用YM液體培養(yǎng)基42°C培養(yǎng)24h活化；
[0086] (3)、向反應(yīng)體系加入纖維素酶30FPU/g底物酶量，50°C預(yù)水解24h ;
[0087] (4)、再加入嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶制劑15FPU/g底物進(jìn)反應(yīng)體系，按10%的 接種量接種酵母至反應(yīng)體系中，45°C發(fā)酵，以接種酵母時(shí)算為0h，于0,24,48,96,120h取 樣，HPLC檢測(cè)乙醇、還原糖含量。
[0088] 所述的反應(yīng)體系為：500mL搖瓶裝反應(yīng)液200mL，該反應(yīng)液中含有堿處理甘鹿 渣 30g、無機(jī)鹽成分：（ΝΗ4)2ΗΡ040· 5g/L，MgS04 · 7Η200· 025g/L，酵母膏 1. 0g/L，余量為 pH5. 0Na2HP04-檸檬酸緩沖液。
[0089] 以不加本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β_葡萄糖苷酶制劑作為對(duì)照，研究嗜溫耐乙醇 β-葡萄糖苷酶應(yīng)用于高溫同步糖化發(fā)酵的效果。
[0090] 結(jié)果如圖8所示，所得嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶應(yīng)用于高溫同步糖化發(fā)酵中， 發(fā)酵至24h即可得乙醇最高產(chǎn)量，所產(chǎn)乙醇含量高達(dá)28. 2g/L，與對(duì)照相比，乙醇產(chǎn)量提高 39%。由此可見本發(fā)明的嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶性質(zhì)有利于纖維素高溫同步糖化發(fā)酵 技術(shù)的應(yīng)用，整個(gè)發(fā)酵期間纖維二糖保持在底濃度水平，有效消除終端產(chǎn)物抑制，在以纖維 素為原料生產(chǎn)燃料乙醇的高溫同步糖化發(fā)酵工藝中的纖維素酶酶解和酵母菌發(fā)酵的最適 條件下，該酶具有較高酶活和明顯作用效果，可以應(yīng)用該工藝中以生產(chǎn)燃料乙醇，表明本發(fā) 明的嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶在能源方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0091] 上述詳細(xì)說明是針對(duì)本發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說明，該實(shí)施例并非用以限制本 發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專利范圍中。
[0001] 序列表 <110>中國科學(xué)院)' 州能源研究所 <120〉一種嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶及其編碼基因和應(yīng)用 <160>2 <210>1 <211)2202 <212>DNA <213〉肉座菌（坊sp· ) W63 <400〉1 ATGCTTTACA CAGCCGTAGC GGCGTTGGCC ATTGCCACAA CGCCCTTTGT AAGGGCAGGG 60 AGTGCAGTCA CTCCTCCAGC AGGCTCTCCT TGGGCCACCG CATATTCCAA AGCTCAGACG 120 GCATTGGCCA AGCTCTCGCT CCAGGATAAA GTCGGCATCG TGACTGGCGT TGGCTGGAAC 180 AAGGGGCCCT GCGTTGGAAA CACATCTCCA GCGTCAAGTA TCAGCTATCC TCAGTTGTCT 240 CTTCAAGATT CACCACTGGG CATCCGGTTC TCAACGGGCA ACACTGCTTT CACGCCAGGC 300 GTCCAAGCCG CCTCAACATG GGATCTAGAT TTAATCGGCC AGCGCGGTCA ATTCATCGGC 360 CAGGAGAATA AAGCCGCAGG CGTTCACGTC ACTTTGGGGC CGGTGGCTGG GCCGCTAGGA 420 AAGACGCCAC AGGGCGGCCG CAACTGGGAG GGCTTCAGTC CCGATCCATA TCTCACTGGG 480 TTGGCAATGG CTGCAACCAT TAACGGCATT CAGGGCGCTG GAGTGCAAGC AACTGCCAAG 540 CACTACATCC TCAACGAGCA GGAGCTGAAC CGGGAGAGCA TGTCCAGCAA TGCTGACGAC 600 CGCACCCTTC ATGAGCTTTA TGCGTGGCCC TTTGCCGACG CCGTAAACGC CAATGTGGCT 660
[0002] GCCGTCATGT GCTCGTACAA CCGAGTCAAT AGCACGTATG CGTGTCAGGA CACGTATACG 720 Cl'GCAGACAC TGCTGAAGAA CCAGCl'GGGA TTCCCl'GGAT ACGTCATGAC CGATTGGAAC 780 GCGCAGCACT CGACTGTGCA AAGTGCGCTG GCAGGTCTCG ACATGTCGAT GCCTGGCACT 840 GACTTCAACG GTGGCAGCCT GTACTGGGGA TCGGCTCTGA CCAATGCTGT GAACAGCAAC 900 CAGGl'CCCTC TGAGCAGGCT CAATGACAl'G Gl'GACGCGl'A I'CCTCGCTGC GTGGTACTTG 960 ACGGGCCAAG ATTCGGGCTT TCCATCAGTC AGCTTCAGCA GGAATGTCCA GGGAAGTCAC 1020 AACACCAACG TACGATCCAT CGCCAGAGAC GGCATTGTAC TTCTCAAGAA CACCGGCAAT 1080 ATTCTGCCGC TGAAAACGCC GTCGAGCATC GCCCTCATTG GATCAGCCAC CATTGTCGGT 1140 GCCCACGCAA ATAACTCGGC CTCATGCTCT GACCATGGCT GCAACCTTGG TGCCCTCGGA 1200 ATGGGATGGG GATCTGGTAC CGCCAACTAC CCATACTTTG TGGCGCCTTA CGACGCCATC 1260 AACACMAGG CTTCTTCGAT TGGCGCCAAA CTGACTCTGA GCAGTACTGA TAACACCTCT 1320 GCTGGCGCGT CTGCGGCAAG CGGCAAGGAC GTTGCCATTG TCGTCATCAC TGCAGACTCA 1380 GGCGAAGGCT ACATCACTGT TGAGGGCAAC GCAGGCGATC GTAATGACCT GAACGCATGG 1440 CACAGCGGCA CTGCTCTGGT ACAGGCCGTG GCAGCAGCCA ACAGCAACGT CATCGTCGTT 1500 GTCCACAGTG TCGGCGCCAT TAATCTAGAG CAGATTGTCG CTCTCTCCCA GGTCAAGGCG 1560 ATTGTTTGGG CGGGTCTCCC CTCTCAGGAG AACGGCAATG CGCTGGTCGA TATCCTATGG 1620 GGAGCCATCA GCCCGTCTGG CAAGCTGGTG TATACAATTG CCAAGAGCCC AAGCGACTAT 1680 AACACGCGCA TTTCTTCGGG CGACGACAAC TACAGCGAGG GGCTGTTTAT CGATTACAAG 1740 CACTTTGACG ACGCCGGCAT CACGCCGCGA TACGAGTTCG GCTTTGGACT GGCCTACACA 1800 AACTTTACCT ACTCTGGGCT TTCCATCACC TCAMCGCCA AGTCTGGACC AGCCACCGGC 1860
[0003] GCTGTGGTTC CTGGAGGCCC CAGCGATCTG TTCCAGGATG TCGCCACCGT GACTGTGAGC 1920 ATCAAAAACA CTGGAGCCGT GACTGGCGCC GAGGTTGCCC AGCTGTACAT CACCTACCCG 1980 TCCTCTGCAC CCAGAACCCC CGTGAGGCAG CTTCGAGGCT TCGACAAGCT CAGCTTGACG 2040 GCTGGCCAGA GCGGMCCGC GACGTTCAAC ATTCGCAAGC GAGATCTGAC CTACTGGAAC 2100 GTGGCGTCGC AGCAGTGGGT GGTGCCGTCG GGGACTTTTG GCGTGAGCGT TGGAGCGAGC 2160 AGCAGAGATT TGCGTTTGAC GGGAAGCTTC ACGGTCTCAT AG 2202 <210〉 2 <211>733 <212>PRT <213〉肉座菌（坊您 sp· ) W63 <400>2 Met Leu Tyr Thr Ala Val Ala Ala Leu Ala lie Ala Thr Thr Pro 1 5 10 15 Phe Val Arg Ala Gly Ser Ala Val Thr Pro Pro Ala Gly Ser Pro 20 25 30 Trp Ala Thr Ala, Tyr Ser Lys Ala Gin Thr Ala Leu Ala [,ys Leu 35 40 45 Ser Leu Gin Asp Lys Val Gly T]e Val Thr Gly Val Gly Trp Asn 50 55 60 Lys Gly Pro Cys Val Gly Asn Thr Ser Pro Ala Ser Ser lie Ser 65 70 75 Tyr Pro Gin Leu Cys Leu Gin Asp Ser Pro Leu Gly lie Arg Phe 80 85 90 Scr Thr Gly Asn Thr Ala Phe Thr Pro Gly Val Gin Ala Ala Scr
[0004] 95 100 105 Thr Trp Asp Leu Asd Leu lie Gly Gin Arg Gly Gin Phe lie Gly 110 115 120 Gin Glu Asn Lys Ala Ala Gly Val His Val Thr Leu Gly Pro Val 125 130 135 Ala Gly Pro Leu Gly Lys Thr Pro Gin Gly Gly Arg Asn Trp Glu 140 145 150 Gly Phe Ser Pro Asp Pro Tyr Leu Thr Gly Leu Ala Met Ala Ala 155 160 165 Thr Tie Asn Gly Tie Gin Gly Ala Gly Val Gin Ala Thr Ma Lys 170 175 180 His Tyr lie Leu Asn Glu Gin Glu Leu Asn Arg Glu Ser Met Ser 185 190 195 Ser Asn Ala Asp Asp Arg Thr Leu Ills Glu Leu Tyr Ala Trp Pro 200 205 210 Phe Ala Asp Ala Val Asn Ala Asn Val Ala Ala Val Met Cys Ser 215 220 225 Tyr Asn Arg Val Asn Ser Thr Tyr Ala Cys Glu Asp Thr Tyr Thr 230 235 240 Leu Gin Thr Leu Leu Lys Asn Gin Leu Gly Phe Pro Gly Tyr Val 245 250 255 Met Thr Asp Trp Asn Ala Gin His Ser Thr Val Gin Ser Ala Leu 260 265 270 Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Thr Asp Phe Asn Gly Gly 275 280 285 Sex' Leu Tyr Trp Gly Ser Ala Leu Thr Asn Ala Val Asn Ser Asn 290 295 300 Gin Val Pro Leu Ser Arg Leu Asn Asp Met Val Thr Arg lie Leu 305 310 315 Ala Ala Trp Tyr Leu Thr Gly Gin Asp Ser Gly Phe Pro Ser Val
[0005] 320 325 330 Ser Phe Ser Arg Asn Val Gin Gly Ser His Asn Thr Asn Val Arg 335 340 345 Ser lie Ala Arg Asp Gly lie Val Leu Leu Lys Asn Thr Gly Asn 350 355 360 lie Leu Pro Leu Lys Thr Pro Ser Ser lie Ala Leu lie Gly Ser 365 370 375 Ala Thr lie Val Gly Ala His Ala Asn Asn Ser Ala Ser Cys Ser 380 385 390 Asp His Gly Cys Asm I.eu Gly Ala Leu Gly Met Gly Trp Gly Ser 395 400 405 Gly Thr Ala Asn Tvr Pro Tyr Phe Val Ala Ρ-- Tyr Asp Ala lie 410 415 420 Asn Thr Lys Ala Ser Ser lie Gly Ala Lys Leu Thr Leu Ser Ser 425 430 435 丁hr Asp Asn Thr Ser Ala Gly Ala Ser Ala Ala Ser Gly Lys Asp 440 445 450 Val Ala lie Val Val lie Thr Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr lie 455 460 465 Thr Val Glu Gly Asn Ala Gly Asp Arg Asn Asp Leu Asn Ala Trp 470 475 480 His Ser Gly Thr Ala Leu Val Gin Ala Val Ala Ala Ala Asn Ser 485 490 495 Asn Val lie Val Val Val Ilis Ser Val Gly Ala lie Asn Leu Glu 500 505 510 Gin lie Val Ala Leu Ser Gin Val Lys Ala He Val Trp Ala Gly 515 520 525 Leu Pro Ser Gin Glu Asn Gly Asn Ala Leu Val Asp lie Leu Trp 530 535 540 Gly Ala lie Ser Pro Ser Gly Lys Leu Val Tyr Thr lie Ala Lys
[0006] 545 550 555 Ser Pro Ser Asp Tyr Asn Thr Arg lie Ser Ser Gly Asp Asp Asn 560 565 570 Tyr Ser Glu Gly Leu Phe lie Asp Tyr Lys His Phe Asp Asp Ala 575 580 585 Gly lie Thr Pro Arg Tyr Glu Phe Gly Phe Gly Leu Ala Tyr Thr 590 595 600 Asn Phe Thr Tyr Ser Gly Leu Ser lie Thr Ser Asn Ala Lys Ser 605 610 615 Gly Pro Ala Thr Gly Ala Val Val Pro Gly Gly Pro Ser Asp Leu 620 625 630 Phe Gin Asp Val Ala Thr Val Thr Val Ser lie Lys Asn Thr Gly 635 640 645 Ala Val Thr Gly Ala Glu Val Ala Gin Leu Tyr lie Thr Tyr Pro 650 655 660 Ser Ser Ala Pro Arg Thr Pro Val Arg Gin Leu Arg Gly Phe Asp 665 670 675 Lys Leu Ser Leu Thr Ala Gly Gin Ser Gly Thr Ala Thr Phe Asn 680 685 690 lie Arg Lys Arg Asp Leu Thr Tyr Trp Asn Val Ala Ser Gin Gin 695 700 705 Trp Val Val Pro Ser Gly Thr Phe Gly Val Ser Val Gly Ala Ser 710 715 720 Ser Arg Asp Leu Arg Leu Thr Gly Ser Phe Thr Val Ser 氺氺氺 725 730
【權(quán)利要求】
1. 一種嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
2. -種編碼權(quán)利要求1所述的嗜溫耐乙醇β -葡萄糖苷酶的基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶的基因，其特征在于，其核苷 酸序列如SEQ ID NO :1所示。
4. 一種重組表達(dá)載體，其特征在于，含有權(quán)利要求2或3所述的編碼嗜溫耐乙醇β-葡 萄糖苷酶的基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體為pPIC9K。
6. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，含有權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體的真核細(xì)胞或 原核細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的原核細(xì)胞為酵母工程菌、大腸 桿菌或枯草桿菌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的酵母工程菌為巴氏畢赤酵母 GS115菌株。
9. 權(quán)利要求1所述的嗜溫耐乙醇β-葡萄糖苷酶在纖維素高溫同步糖化發(fā)酵乙醇中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P19/14GK104046605SQ201410235451
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】袁振宏, 梁翠誼, 許敬亮, 陳小燕, 莊新姝, 張宇, 郭穎, 周衛(wèi)征 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院廣州能源研究所