使用信號(hào)探針的方法和材料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用在與靶序列雜交后可以產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)探針分離細(xì)胞或產(chǎn)生細(xì)胞系的方法。利用該信號(hào)探針的其它方法包括定量RNA表達(dá)水平的方法、鑒定活細(xì)胞中的遺傳重組事件的方法、和使用該分離的細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。本發(fā)明還涉及蛋白酶探針。本發(fā)明提供形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)、三臂聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)和啞鈴結(jié)構(gòu)的信號(hào)探針和蛋白酶探針。
【專利說明】使用信號(hào)探針的方法和材料
[〇〇〇1] 本申請(qǐng)要求2004年2月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/546, 075的優(yōu)先權(quán)，該臨時(shí) 申請(qǐng)的公開內(nèi)容完整地并入此處作為參考。 【背景技術(shù)】
[0002] 識(shí)別和報(bào)道特定核酸序列的存在的核酸探針已經(jīng)用于主要在體外反應(yīng)中檢測(cè)特 定核酸。見例如美國(guó)專利5, 925, 517,該專利并入此處作為參考。一類探針經(jīng)過設(shè)計(jì)而具 有發(fā)夾形狀的結(jié)構(gòu)，其中中間一段核苷酸序列與靶序列互補(bǔ)，而兩末端包含短相互互補(bǔ)序 列。見例如，Tyagi 和 Kramer, Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)，并入此處作為 參考。該莖環(huán)形狀的探針的一個(gè)末端與熒光團(tuán)共價(jià)結(jié)合，而另一末端與淬滅部分共價(jià)結(jié) 合。當(dāng)探針處于具有雜交的兩末端的天然狀態(tài)時(shí)，熒光團(tuán)和淬滅劑接近以致產(chǎn)生相對(duì)低的 熒光或基本不產(chǎn)生熒光。莖環(huán)探針在與其靶核酸雜交時(shí)發(fā)生構(gòu)象改變，導(dǎo)致從熒光團(tuán)產(chǎn) 生的熒光出現(xiàn)可檢測(cè)的變化。研究者已經(jīng)使用發(fā)夾形狀的探針在活細(xì)胞中原位顯現(xiàn)信使 RNA(Matsuol998, Biochim. Biophys. Actal379:178-184)。
[0003] 發(fā)明概述
[0004] 本發(fā)明提供用于分析或分離細(xì)胞或產(chǎn)生細(xì)胞系的包含新信號(hào)探針（signaling probes)的方法和組合物，其中所述細(xì)胞和細(xì)胞系表達(dá)一種或多種RNA。該方法基于檢測(cè)探 針在與靶序列雜交時(shí)所產(chǎn)生的信號(hào)。所述RNA可以通過DNA構(gòu)建體引入細(xì)胞中，或者細(xì)胞 可能被懷疑內(nèi)源性地表達(dá)該RNA。DNA構(gòu)建體可以進(jìn)一步編碼標(biāo)簽序列，而信號(hào)探針與該標(biāo) 簽序列互補(bǔ)。一個(gè)實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞或產(chǎn)生的細(xì)胞系功能性地不表達(dá)一種或多種預(yù) 定的蛋白質(zhì)或RNA，或者降低地表達(dá)一種或多種預(yù)定的蛋白質(zhì)或RNA。本發(fā)明還提供使用根 據(jù)所述方法分離的細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。
[0005] 本發(fā)明提供在用于定量一種或多種RNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平的方法中使用的信號(hào) 探針。此外，該信號(hào)探針可以在用于鑒定調(diào)節(jié)至少一種預(yù)定RNA的轉(zhuǎn)錄的化合物或RNA序列 的方法中使用。另一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)探針在用于鑒定活細(xì)胞中的遺傳重組事件的方法 中使用。信號(hào)探針包含一條或多條核苷酸鏈，其中信號(hào)探針包含與目的靶核酸（例如RNA) 互補(bǔ)的核苷酸，并且其中信號(hào)探針還包含含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)部分（moieties)的相互作用對(duì)。信 號(hào)探針的結(jié)構(gòu)使得當(dāng)該信號(hào)探針未與靶序列雜交時(shí)該相互作用對(duì)的這兩個(gè)結(jié)構(gòu)部分的物 理位置將造成無信號(hào)產(chǎn)生或造成背景信號(hào)產(chǎn)生。當(dāng)信號(hào)探針與靶序列雜交時(shí)，這兩個(gè)組分 部分將導(dǎo)致信號(hào)產(chǎn)生?；蛘撸盘?hào)探針的這些結(jié)構(gòu)部分可以使得當(dāng)探針未與靶雜交時(shí)產(chǎn)生 特定的信號(hào)而在探針與靶序列雜交時(shí)產(chǎn)生不同的信號(hào)。相互作用對(duì)的這兩個(gè)結(jié)構(gòu)部分可以 附著于信號(hào)探針的一條或多條鏈的一個(gè)或多個(gè)末端?；蛘?，所述結(jié)構(gòu)部分可以摻入到信號(hào) 探針的一條或多條鏈的內(nèi)部。信號(hào)探針的核苷酸也可以被修飾。
[0006] 本發(fā)明還提供蛋白酶探針。一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)探針或蛋白酶探針包含兩條分 開的核酸鏈或修飾的核酸鏈，其中這兩條鏈的一個(gè)或多個(gè)部分相互退火，并且一條鏈的至 少一個(gè)末端與另一條鏈的末端相鄰。所述核酸可以是DNA或RNA。對(duì)于具有兩條分開的鏈的 信號(hào)探針，在一個(gè)實(shí)施方案中，一條鏈至少在一個(gè)末端具有淬滅部分（quencher moiety), 而另一條鏈至少在所述相鄰末端具有熒光團(tuán)。對(duì)于蛋白酶探針，一個(gè)實(shí)施方案中，一條鏈至 少在一個(gè)末端具有蛋白水解酶，而另一條鏈至少在所述相鄰末端具有該蛋白水解酶的抑制 劑。
[0007] 另一實(shí)施方案中，信號(hào)探針或蛋白酶探針經(jīng)設(shè)計(jì)而包含至少一個(gè)相互互補(bǔ)區(qū)和至 少一個(gè)非互補(bǔ)區(qū)。一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)非互補(bǔ)區(qū)可以經(jīng)設(shè)計(jì)而形成環(huán)區(qū)。在一個(gè)實(shí) 施方案中，設(shè)計(jì)探針以形成至少一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。另一實(shí)施方案中，探針形成啞鈴結(jié)構(gòu)或三臂 聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)（three-arm junction structure)。一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)探針具有至少一個(gè)突 光團(tuán)和至少一個(gè)淬滅部分各分別位于鏈的一個(gè)末端。一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶探針具有蛋 白水解酶和該蛋白水解酶的抑制劑各分別位于鏈的一個(gè)末端。
[0008] 另一實(shí)施方案中，信號(hào)探針或蛋白酶探針是化學(xué)修飾的。糖-磷酸二酯類型主鏈、 2'0H和嘌呤或嘧啶堿基中的一個(gè)或多個(gè)被修飾。一個(gè)實(shí)施方案中，脫氧核糖主鏈被肽核酸 替代。
[0009] -個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)簽序列是結(jié)構(gòu)RNA，S卩，該RNA具有二級(jí)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地三臂聯(lián)結(jié) 結(jié)構(gòu)。一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)簽序列包含根據(jù)圖42A、B或C的結(jié)構(gòu)或序列。本發(fā)明還提供包 含至少一個(gè)編碼至少一種目的RNA和標(biāo)簽序列的DNA的DNA構(gòu)建體。本發(fā)明還提供包含該 DNA構(gòu)建體的載體和細(xì)胞。
[〇〇1〇] 在其它實(shí)施方案中，提供：
[0011] 1.分離表達(dá)至少一種RNA的細(xì)胞的方法，包括步驟：
[0012] a)向細(xì)胞中引入編碼至少一種RNA的至少一種DNA ;
[0013] b)將所述細(xì)胞暴露于至少一種在與所述至少一種RNA雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的 信號(hào)探針；和
[0014] c)分離產(chǎn)生該信號(hào)的所述細(xì)胞。
[0015] 2.段1的方法，還包括步驟：通過使所述分離的細(xì)胞生長(zhǎng)，產(chǎn)生表達(dá)所述至少一種 RNA的細(xì)胞系或多個(gè)細(xì)胞系。
[0016] 3.分離表達(dá)兩種或兩種以上RNA中的至少一種RNA的細(xì)胞的方法，包括步驟：
[0017] a)將編碼第一 RNA的第一 DNA引入細(xì)胞；
[0018] b)將編碼至少一種第二RNA的至少一種第二DNA引入所述細(xì)胞；
[0019] c)將所述細(xì)胞暴露于至少一種在與所述第一 RNA雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的第一 信號(hào)探針；
[0020] d)將所述細(xì)胞暴露于至少一種在與所述至少一種第二RNA雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信 號(hào)的第二信號(hào)探針；和
[0021] e)分離在所述信號(hào)探針與它們相應(yīng)的RNA雜交時(shí)產(chǎn)生所述信號(hào)中的至少一種的 細(xì)胞。
[0022] 4.段3的方法，還包括步驟：通過使所述分離的細(xì)胞生長(zhǎng)，產(chǎn)生表達(dá)所述兩種或兩 種以上RNA中的至少一種RNA的一個(gè)細(xì)胞系或多個(gè)細(xì)胞系。
[0023] 5.分離多個(gè)細(xì)胞的方法，其中所述細(xì)胞中的至少一部分細(xì)胞表達(dá)至少一種不同的 RNA，所述方法包括步驟：
[0024] a)將編碼多種RNA的多種DNA引入細(xì)胞，其中至少一部分所述細(xì)胞中引入了編碼 至少一種不同的RNA的至少一種不同的DNA ;
[0025] b)將所述細(xì)胞相繼地或同時(shí)地暴露于多種信號(hào)探針，其中所述信號(hào)探針在與所述 多種RNA雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)；和
[0026] c)分離產(chǎn)生該信號(hào)的所述細(xì)胞。
[0027] 6.段5的方法，還包括步驟：通過使所述分離的細(xì)胞生長(zhǎng)，產(chǎn)生多個(gè)表達(dá)至少一種 不同的RNA的細(xì)胞系。
[0028] 7.分離表達(dá)至少一種RNA的細(xì)胞的方法，包括步驟：
[0029] a)將至少一種編碼所述至少一種RNA和至少一種標(biāo)簽序列的DNA引入細(xì)胞；
[0030] b)將所述細(xì)胞暴露于至少一種信號(hào)探針，其中所述探針在與標(biāo)簽序列雜交時(shí)產(chǎn)生 可檢測(cè)的信號(hào)；和
[0031] c)分離產(chǎn)生該信號(hào)的所述細(xì)胞。
[0032] 8.段7的方法，還包括步驟：通過使所述分離的細(xì)胞生長(zhǎng)，產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)表達(dá)所 述至少一種RNA的細(xì)胞系。
[0033] 9.分離表達(dá)兩種或兩種以上RNA中的至少一種RNA的細(xì)胞的方法，包括步驟：
[0034] a)將編碼第一 RNA和至少一種第一標(biāo)簽序列的第一 DNA引入細(xì)胞；
[0035] b)將至少一種編碼至少一種另外的RNA和至少一種第二標(biāo)簽序列的第二DNA引入 所述細(xì)胞，其中所述第二標(biāo)簽序列與第一標(biāo)簽序列相同或不同；
[0036] c)將所述細(xì)胞暴露于至少一種第一信號(hào)探針，其中所述探針在與第一標(biāo)簽序列雜 交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)；
[0037] d)將所述細(xì)胞暴露于至少一種第二信號(hào)探針，其中所述探針在與第二標(biāo)簽序列雜 交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)；和
[0038] e)分離在所述信號(hào)探針與它們相應(yīng)的RNA雜交時(shí)產(chǎn)生所述信號(hào)中的至少一種信 號(hào)的細(xì)胞。
[0039] 10.段9的方法，還包括步驟：通過使所述分離的細(xì)胞生長(zhǎng)，產(chǎn)生表達(dá)所述兩種或 兩種以上RNA中的至少一種RNA的一個(gè)細(xì)胞系或多個(gè)細(xì)胞系。
[0040] 11.段3或9的方法，其中所述第一 RNA的所述步驟與所述至少一種另外的RNA的 相應(yīng)步驟同時(shí)地或相繼地實(shí)施。
[0041] 12.段3或9的方法，其中所述兩種或兩種以上RNA或由所述兩種或兩種以上RNA 編碼的蛋白質(zhì)選自：相同或相關(guān)生物學(xué)途徑中的RNA或蛋白質(zhì)、在彼此上游或下游起作用 的RNA或蛋白質(zhì)、相互具有調(diào)節(jié)、激活或阻遏功能的RNA或蛋白質(zhì)、對(duì)于功能或活性而言相 互依賴的RNA或蛋白質(zhì)、形成復(fù)合物的RNA或蛋白質(zhì)、來自蛋白質(zhì)家族的蛋白質(zhì)。
[0042] 13.分離過表達(dá)至少一種RNA的細(xì)胞的方法，包括步驟：
[0043] a)向細(xì)胞中引入編碼所述至少一種RNA和至少一種第一標(biāo)簽序列的至少一種第 一 DNA ;和編碼所述至少一種RNA和至少一種第二標(biāo)簽序列的至少一種第二DNA，其中第一 和第二DNA構(gòu)建體的引入相繼地或同時(shí)地進(jìn)行，其中第一和第二標(biāo)簽序列相同或不同；
[0044] b)將所述細(xì)胞暴露于至少一種在與所述至少一種第一標(biāo)簽序列雜交時(shí)產(chǎn)生可檢 測(cè)信號(hào)的第一信號(hào)探針，和至少一種在與所述至少一種第二標(biāo)簽序列雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信 號(hào)的第二信號(hào)探針；和
[0045] c)分離在所述信號(hào)探針與它們相應(yīng)的RNA雜交時(shí)產(chǎn)生所述信號(hào)中的至少一種信 號(hào)的細(xì)胞。
[0046] 14.段13的方法，還包括步驟：通過使所述分離的細(xì)胞生長(zhǎng)，產(chǎn)生過表達(dá)所述RNA 的一個(gè)細(xì)胞系或多個(gè)細(xì)胞系。
[0047] 15.段3、9和13的方法，其中第一信號(hào)探針產(chǎn)生的信號(hào)與第二信號(hào)探針產(chǎn)生的信 號(hào)不同。
[0048] 16.段13的方法，其中所述第一信號(hào)探針的所述步驟與所述第二信號(hào)探針的相應(yīng) 步驟同時(shí)或相繼地進(jìn)行。
[0049] 17.段3、9和13之任一的方法，其中所述第一 DNA和所述第二DNA位于相同構(gòu)建 體或不同構(gòu)建體上。
[0050] 18.分離多個(gè)細(xì)胞的方法，其中所述細(xì)胞中的至少一部分表達(dá)至少一種不同的 RNA，所述方法包括步驟：
[0051] a)將編碼多種RNA和至少一種標(biāo)簽序列的多種DNA引入細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞中 的至少一部分細(xì)胞被引入了編碼至少一種不同RNA的至少一種不同的DNA ;
[0052] b)將所述細(xì)胞暴露于至少一種在與所述標(biāo)簽序列雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的信號(hào) 探針；和
[0053] c)分離產(chǎn)生該信號(hào)的所述細(xì)胞。
[0054] 19.段18的方法，其中所述多種RNA形成至少一個(gè)表達(dá)文庫(kù)。
[0055] 20.段18的方法，還包括步驟：通過使所述分離的細(xì)胞生長(zhǎng)，產(chǎn)生多個(gè)表達(dá)至少一 種不同的RNA的細(xì)胞系。
[0056] 21.分離兩種或兩種以上RNA表達(dá)文庫(kù)細(xì)胞中的至少一種的方法，包括步驟：
[0057] a)向細(xì)胞中引入編碼至少一種第一 RNA表達(dá)文庫(kù)和至少一種第一標(biāo)簽序列的 DNA ；
[0058] b)向細(xì)胞中引入編碼至少一種第二RNA表達(dá)文庫(kù)和至少一種第二標(biāo)簽序列的 DNA，其中所述第二標(biāo)簽序列與第一標(biāo)簽序列相同或不同；
[0059] c)將所述細(xì)胞暴露于至少一種第一信號(hào)探針，其中所述第一信號(hào)探針在與所述至 少一種第一標(biāo)簽序列雜交時(shí)可產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)；
[0060] d)將所述細(xì)胞暴露于至少一種第二信號(hào)探針，其中所述第二信號(hào)探針在與所述至 少一種第二標(biāo)簽序列雜交時(shí)可產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，其中來自第一信號(hào)探針的可檢測(cè)信號(hào)與來 自第二信號(hào)探針的可檢測(cè)信號(hào)相同或不同；和
[0061] e)分離產(chǎn)生所述信號(hào)中的至少一種信號(hào)的所述細(xì)胞。
[0062] 22.段21的方法，還包括步驟：通過使所述分離的細(xì)胞生長(zhǎng)，產(chǎn)生所述兩種或兩種 以上RNA表達(dá)文庫(kù)中的至少一種。
[0063] 23.段5或18的方法，其中所述多種RNA或由所述多種RNA編碼的蛋白質(zhì)選自：相 同或相關(guān)生物學(xué)途徑中的RNA或蛋白質(zhì)、在彼此上游或下游起作用的RNA或蛋白質(zhì)、相互具 有調(diào)節(jié)、激活或阻遏功能的RNA或蛋白質(zhì)、對(duì)于功能或活性而言相互依賴的RNA或蛋白質(zhì)、 形成復(fù)合物的RNA或蛋白質(zhì)、來自蛋白質(zhì)家族的蛋白質(zhì)。
[0064] 24.段18的方法，其中所述多種DNA中的至少一部分編碼相同標(biāo)簽序列。
[〇〇65] 25.段7、9、13、18或21的方法，其中標(biāo)簽序列包含多個(gè)待被至少一種信號(hào)探針?biāo)?識(shí)別的靶序列。
[0066] 26.段7、9、13、18和21之任一的方法，其中標(biāo)簽序列是結(jié)構(gòu)RNA。
[0067] 27.段25的方法，其中標(biāo)簽序列形成三臂聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)。
[0068] 28.段27的方法，其中莖區(qū)包含8-9個(gè)堿基對(duì)，第一莖環(huán)區(qū)包含4-6個(gè)堿基對(duì)，第 二莖環(huán)區(qū)包含13-17個(gè)堿基對(duì)。
[〇〇69] 29.段27的方法，其中三個(gè)臂的莖區(qū)還包含非互補(bǔ)區(qū)。
[〇〇7〇] 30.段27的方法，其中莖區(qū)和第一莖環(huán)區(qū)均還包含一個(gè)錯(cuò)配區(qū)，第二莖環(huán)區(qū)還包 含2-7個(gè)錯(cuò)配或凸起區(qū)。
[0071] 31.段27的方法，其中莖區(qū)之間的連接具有總共8-12個(gè)核苷酸。
[0072] 32.段26的方法，其中標(biāo)簽序列選自圖42A、B和C中顯示的序列。
[0073] 33.段32的方法，其中標(biāo)簽序列形成由圖42A、B或C中所示序列預(yù)測(cè)的能量上更 有利的結(jié)構(gòu)。
[0074] 34.段27的方法，其中靶序列是從第一莖環(huán)區(qū)莖3'側(cè)的全部或部分至第一和第二 莖環(huán)區(qū)之間的連接、至第二莖環(huán)區(qū)莖5'側(cè)的全部或部分的區(qū)域。
[0075] 35.段7、9、13、18和21之任一的方法，其中DNA的至少一部分編碼多個(gè)相同的標(biāo) 簽序列。
[0076] 36.段35的方法，其中DNA的至少一部分編碼至多50個(gè)的相同標(biāo)簽序列。
[0077] 37.段7、9、13、18和21之任一的方法，其中編碼所述標(biāo)簽序列的DNA與編碼所述 RNA的DNA閱讀框相符。
[0078] 38.段7、9、13、18和21之任一的方法，其中編碼所述標(biāo)簽序列的DNA與編碼所述 RNA的DNA閱讀框不相符。
[0079] 39.分離表達(dá)至少一種RNA的細(xì)胞的方法，包括步驟：
[0080] a)提供潛在地表達(dá)所述至少一種RNA的細(xì)胞；
[0081] b)將所述細(xì)胞暴露于至少一種信號(hào)探針，其中所述探針在與所述至少一種RNA雜 交時(shí)可產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)；
[0082] c)分離產(chǎn)生該信號(hào)的所述細(xì)胞。
[0083] 40.段39的方法，還包括步驟：通過使所述分離的細(xì)胞生長(zhǎng)，產(chǎn)生表達(dá)所述至少一 種RNA的細(xì)胞系或多個(gè)細(xì)胞系。
[0084] 41.段39的方法，其中所述細(xì)胞還潛在地表達(dá)一種或多種另外的RNA，所述方法還 包括步驟：
[0085] a)將所述細(xì)胞暴露于至少一種另外的信號(hào)探針，其中所述探針在與所述至少一種 另外的RNA雜交時(shí)可產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)；和
[0086] b)分離產(chǎn)生該信號(hào)的細(xì)胞。
[0087] 42.段41的方法，還包括步驟：通過使所述分離的細(xì)胞生長(zhǎng)，產(chǎn)生表達(dá)所述至少一 種RNA和另外的RNA的細(xì)胞系或多個(gè)細(xì)胞系。
[0088] 43.段1、3、5、7、9、13、18和21之任一的方法，還包括步驟：在步驟a)之前向細(xì)胞 添加化合物，其中所述化合物調(diào)制或調(diào)節(jié)所述RNA、另外的RNA或多種RNA的表達(dá)。
[0089] 44.段43的方法，其中化合物誘導(dǎo)所述RNA、另外的RNA或多種RNA的表達(dá)。
[〇〇9〇] 45.段5或18的方法，其中有關(guān)所述多種RNA的所述步驟同時(shí)或相繼地進(jìn)行。
[0091] 46.分離表達(dá)至少一種外源RNA和至少一種內(nèi)源RNA的細(xì)胞的方法，包括步驟：
[0092] a)將編碼所述至少一種外源RNA的DNA引入細(xì)胞，其中所述細(xì)胞潛在地表達(dá)至少 一種內(nèi)源RNA ;
[0093] b)將所述細(xì)胞暴露于至少一種第一信號(hào)探針，其中所述探針在與所述至少一種外 源RNA雜交時(shí)可產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)；
[0094] c)將所述細(xì)胞暴露于至少一種第二信號(hào)探針，其中所述探針在與所述至少一種內(nèi) 源RNA雜交時(shí)可產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)；和
[0095] d)分離在所述信號(hào)探針與它們的相應(yīng)RNA雜交時(shí)產(chǎn)生至少一種所述信號(hào)的細(xì)胞。
[0096] 47.段46的方法，還包括步驟：通過使所述分離的細(xì)胞生長(zhǎng)，產(chǎn)生表達(dá)所述至少一 種外源RNA或所述至少一種內(nèi)源RNA或兩者的細(xì)胞系或多個(gè)細(xì)胞系。
[0097] 48.段46的方法，其中有關(guān)所述外源RNA的所述步驟與有關(guān)所述內(nèi)源RNA的相應(yīng) 步驟同時(shí)地或相繼地進(jìn)行。
[0098] 49.段46的方法，其中所述第二信號(hào)探針與第一信號(hào)探針產(chǎn)生不同的信號(hào)。
[0099] 50.段46的方法，其中內(nèi)源RNA和外源RNA或由所述內(nèi)源和外源RNA編碼的蛋白 質(zhì)選自：相同或相關(guān)生物學(xué)途徑中的RNA或蛋白質(zhì)、在彼此上游或下游起作用的RNA或蛋白 質(zhì)、相互具有調(diào)節(jié)、激活或阻遏功能的RNA或蛋白質(zhì)、對(duì)于功能或活性而言相互依賴的RNA 或蛋白質(zhì)、形成復(fù)合物的RNA或蛋白質(zhì)、來自蛋白質(zhì)家族的蛋白質(zhì)。
[0100] 51.段1、3、5、7、9、13、18、21和39之任一的方法，其中RNA包含編碼蛋白質(zhì)的信使 RNA、編碼肽的RNA、反義RNA、siRNA、tRNA、結(jié)構(gòu)RNA、核糖體RNA、hnRNA和snRNA中的一個(gè) 或多個(gè)。
[0101] 52.段51的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自：細(xì)胞表面定位的蛋白質(zhì)、分泌蛋白和細(xì)胞 內(nèi)蛋白。
[0102] 53.分離過表達(dá)至少一種第一蛋白質(zhì)并且功能性地不表達(dá)至少一種第二蛋白質(zhì)或 減少地表達(dá)至少一種第二蛋白質(zhì)的細(xì)胞的方法，包括步驟：
[0103] a)向所述細(xì)胞中引入至少一種第一 DNA和至少一種第二DNA，其中所述第一 DNA 編碼至少一種編碼所述至少一種第一蛋白質(zhì)的RNA以及至少一種第一標(biāo)簽序列；所述第二 DNA編碼所述至少一種RNA以及至少一種第二標(biāo)簽序列；其中所述第一和第二標(biāo)簽序列不 同；
[0104] b)向細(xì)胞中引入至少一種編碼至少一種反義RNA或siRNA的DNA，其中所述反義 RNA或siRNA結(jié)合或干擾所述至少一種第二蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)錄物；
[0105] c)將所述細(xì)胞暴露于至少一種在與所述至少一種第一標(biāo)簽序列雜交時(shí)產(chǎn)生可檢 測(cè)信號(hào)的第一信號(hào)探針，和至少一種在與所述至少一種第二標(biāo)簽序列雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信 號(hào)的第二信號(hào)探針；
[0106] d)將所述細(xì)胞暴露于至少一種在與所述至少一種反義RNA或siRNA雜交時(shí)產(chǎn)生可 檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)探針；和
[0107] e)分離在所述信號(hào)探針與它們的相應(yīng)RNA雜交時(shí)產(chǎn)生至少一種所述信號(hào)的細(xì)胞。
[0108] 54.段53的方法，還包括步驟：產(chǎn)生過表達(dá)至少一種第一蛋白質(zhì)并且功能性地不 表達(dá)至少一種第二蛋白質(zhì)或減少地表達(dá)至少一種第二蛋白質(zhì)的細(xì)胞系或多個(gè)細(xì)胞系。
[0109] 55.段53的方法，其中有關(guān)所述第一蛋白質(zhì)的所述步驟與有關(guān)所述第二蛋白質(zhì)的 相應(yīng)步驟同時(shí)地或相繼地進(jìn)行。
[0110] 56.段1、3、5、7、9、13、18、21、39和53之任一的方法，其中所述DNA與條件型啟動(dòng) 子可操作地連接。
[0111] 57.段56的方法，其中啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型或阻遏型啟動(dòng)子，并且在步驟（a)之前向細(xì) 胞添加最小量的誘導(dǎo)物或充足量的阻遏物。
[0112] 58.段57的方法，其中RNA是反義RNA或siRNA。
[0113] 59.段57的方法，其中RNA對(duì)細(xì)胞而言是致死性的或破壞性的。
[0114] 60.段1、3、5、7、9、13、18、21、39和53之任一的方法，還包括步驟：在向細(xì)胞中引 入DNA后但在將所述細(xì)胞暴露于所述信號(hào)探針之前，選擇細(xì)胞。
[0115] 61.段1、3、5、7、9、13、18、21、39和53之任一的方法，其中至少一種DNA還編碼至 少一種藥物抗性標(biāo)記，并且所述方法還包括步驟：選擇對(duì)至少一種藥物具有抗性的細(xì)胞，其 中所述藥物是所述標(biāo)記所賦予的抗性所針對(duì)的藥物。
[0116] 62.分離包含DNA構(gòu)建體的細(xì)胞的方法，其中所述DNA構(gòu)建體編碼在組織特異性啟 動(dòng)子控制下的RNA序列，所述方法包括步驟 ：
[0117] a)向細(xì)胞中引入至少一種DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體編碼在組成型啟動(dòng)子控制 下的至少一種第一 RNA序列并編碼在組織特異性啟動(dòng)子控制下的至少一種第二RNA序列；
[0118] b)將所述細(xì)胞暴露于至少一種在與所述第一 RNA序列雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的 信號(hào)探針；和
[0119] c)分離產(chǎn)生所述信號(hào)的所述細(xì)胞。
[0120] 63.段62的方法，還包括步驟：產(chǎn)生包含DNA構(gòu)建體的細(xì)胞系或多個(gè)細(xì)胞系，其中 所述DNA構(gòu)建體編碼在組織特異性啟動(dòng)子控制下的RNA序列。
[0121] 64.段62的方法，其中組織特異性啟動(dòng)子控制選擇標(biāo)記基因的表達(dá)。
[0122] 65.段62的方法，其中選擇標(biāo)記基因是藥物抗性基因或可檢測(cè)的蛋白質(zhì)的基因。
[0123] 66.鑒定可激活組織特異性啟動(dòng)子的化合物的方法，包括步驟：
[0124] a)向分離自段62的細(xì)胞添加化合物；
[0125] b)通過選擇標(biāo)記鑒定細(xì)胞；
[0126] c)將該化合物鑒定為可激活所述組織特異性啟動(dòng)子的化合物。
[0127] 67.分離包含DNA構(gòu)建體的細(xì)胞的方法，其中所述DNA構(gòu)建體編碼至少一種待檢 RNA序列和在組織特異性啟動(dòng)子控制下的RNA序列，所述方法包括步驟：
[0128] a)向細(xì)胞中引入至少一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體編碼在組成型啟動(dòng)子控制下的至 少一種待檢RNA序列、在相同或不同的第二組成型啟動(dòng)子控制下的至少一種第二RNA序列、 和在組織特異性啟動(dòng)子控制下的至少一種第三RNA序列；
[0129] b)將所述細(xì)胞暴露于至少一種在與所述第二RNA序列雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的 信號(hào)探針；和
[0130] c)分離產(chǎn)生所述信號(hào)的所述細(xì)胞。
[0131] 68.段67的方法，還包括步驟：產(chǎn)生包含DNA構(gòu)建體的細(xì)胞系或多個(gè)細(xì)胞系，所述 DNA構(gòu)建體編碼至少一種待檢RNA序列和在組織特異性啟動(dòng)子控制下的RNA序列。
[0132] 69.段67的方法，其中待檢RNA序列來自表達(dá)文庫(kù)。
[0133] 70.段67的方法，其中組織特異性啟動(dòng)子控制選擇標(biāo)記基因的表達(dá)。
[0134] 71.段67的方法，其中選擇標(biāo)記基因是藥物抗性基因或可檢測(cè)的蛋白質(zhì)的基因。
[0135] 72.鑒定可激活組織特異性啟動(dòng)子的待檢RNA序列的方法，包括步驟：
[0136] a)通過選擇標(biāo)記鑒定段67的分離的細(xì)胞；
[0137] b)鑒定可激活所述組織特異性啟動(dòng)子的待檢RNA序列。
[0138] 73.段1、3、5、7、9、13、18、21、39和53之任一的方法，還包括步驟：
[0139] i)將所述分離的細(xì)胞暴露于在與相應(yīng)的RNA雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)探針；
[0140] ii)確定所述分離的細(xì)胞是否表達(dá)該相應(yīng)的RNA ;或者定量信號(hào)水平以確定該相 應(yīng)RNA的表達(dá)水平。
[0141] 74.從段1、3、5、7、9、13、18、21、39和53之任一的方法獲得的分離的細(xì)胞，其中所 述細(xì)胞應(yīng)用于基于細(xì)胞的試驗(yàn)中。
[0142] 75.從段1、3、5、7、9、13、18、21、39和53之任一的方法獲得的分離的細(xì)胞，其中所 述細(xì)胞可植入動(dòng)物中。
[0143] 76.根據(jù)段1、3、5、7、9、13、18、21、39和53之任一產(chǎn)生表達(dá)1?隱的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方 法，包括利用胚胎干細(xì)胞或可以植入動(dòng)物體的細(xì)胞實(shí)施段1、3、5、7、9、13、18、21、39和53之 任一的步驟，確定所述干細(xì)胞或細(xì)胞的生存力，和使用所述活的胚胎干細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)生所 述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
[0144] 77.段1、3、5、7、9、13、18、21和39的方法，其中RNA是反義RNA或siRNA，并且在所 述分離的細(xì)胞中至少一種預(yù)定的蛋白質(zhì)由于其mRNA轉(zhuǎn)錄物被該反義RNA結(jié)合或者被siRNA 干擾而導(dǎo)致在功能上是無效的或者具有降低的表達(dá)水平。
[0145] 78.段77的方法，其中所述預(yù)定的蛋白質(zhì)是基因產(chǎn)物的可變剪接形式。
[0146] 79.制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，其中至少一種預(yù)定的蛋白質(zhì)功能性地不表達(dá)或者其 表達(dá)降低，所述方法包括利用胚胎干細(xì)胞或可植入動(dòng)物的細(xì)胞實(shí)施段77的步驟，確定所述 干細(xì)胞或細(xì)胞的生存力，和使用所述活的胚胎干細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
[0147] 80.定量生物學(xué)樣品中至少一種RNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平的方法，包括步驟：
[0148] a)將所述生物學(xué)樣品暴露于在與所述RNA轉(zhuǎn)錄物雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的第一 信號(hào)探針；
[0149] b)定量所述生物學(xué)樣品中該信號(hào)的水平；和
[0150] c)將所述信號(hào)水平與所述至少一種RNA轉(zhuǎn)錄物的所述水平相關(guān)聯(lián)。
[0151] 81.段80的方法，其中所述生物學(xué)樣品是細(xì)胞樣品、組織樣品或來源于其的制備 物。
[0152] 82.段80的方法，其中所述RNA轉(zhuǎn)錄物是編碼蛋白質(zhì)的信使RNA、編碼肽的RNA、反 義RNA、siRNA、tRNA、結(jié)構(gòu)RNA、核糖體RNA、hnRNA和snRNA中的一種或多種。
[0153] 83.段80的方法，其中所述生物學(xué)樣品被固定。
[0154] 84.段80的方法，其中使用第二信號(hào)探針在所述生物學(xué)樣品中定量至少一種第二 RNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，其中所述第二信號(hào)探針在與所述第二RNA轉(zhuǎn)錄物雜交時(shí)可產(chǎn)生可 檢測(cè)信號(hào)。
[0155] 85.鑒定調(diào)節(jié)至少一種預(yù)定的RNA的轉(zhuǎn)錄的化合物的方法，包括步驟：
[0156] a)向外源性地或內(nèi)源性地表達(dá)所述預(yù)定的RNA的細(xì)胞添加化合物；
[0157] b)將所述細(xì)胞暴露于在與所述至少一種預(yù)定的RNA雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的至 少一種信號(hào)探針；
[0158] c)定量所述細(xì)胞中該信號(hào)的水平；
[0159] d)鑒定與未添加化合物的細(xì)胞中的信號(hào)相比具有增加或降低的信號(hào)的細(xì)胞；和
[0160] e)鑒定調(diào)節(jié)所述至少一種預(yù)定RNA的轉(zhuǎn)錄的化合物。
[0161] 86.段85的方法，其中根據(jù)段1或7的方法分離外源性地表達(dá)所述預(yù)定RNA的細(xì) 胞。
[0162] 87.段85的方法，其中DNA構(gòu)建體包含啟動(dòng)子或操縱基因并編碼阻遏蛋白、增強(qiáng)子 (enhancer)或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的序列。
[0163] 88.鑒定調(diào)節(jié)至少一種預(yù)定RNA的轉(zhuǎn)錄的RNA序列的方法，包括步驟：
[0164] a)向細(xì)胞中引入至少一種待測(cè)RNA序列，其中所述待測(cè)RNA序列潛在地調(diào)節(jié)外源 或內(nèi)源表達(dá)的至少一種預(yù)定RNA的轉(zhuǎn)錄；
[0165] b)將所述細(xì)胞暴露于在與所述至少一種預(yù)定RNA雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的至少 一種信號(hào)探針；
[0166] c)定量所述細(xì)胞中該信號(hào)的水平；
[0167] d)與無待測(cè)RNA序列的細(xì)胞的信號(hào)相比，鑒定具有增加或降低的信號(hào)的細(xì)胞；和
[0168] e)鑒定調(diào)節(jié)所述至少一種預(yù)定RNA的轉(zhuǎn)錄的待測(cè)RNA序列。
[0169] 89.段88的方法，其中外源表達(dá)所述預(yù)定RNA的細(xì)胞是根據(jù)段1或7的方法分離 的。
[0170] 90.段88的方法，其中使用RNA表達(dá)文庫(kù)作為待測(cè)RNA序列。
[0171] 91.鑒定活細(xì)胞中的遺傳重組事件的方法，包括步驟：
[0172] a)將細(xì)胞暴露于在與如下RNA序列雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)探針，所述RNA 序列選自：自重組后的序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列和自未發(fā)生重組的序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列；
[0173] b)鑒定表達(dá)所述RNA序列的所述細(xì)胞。
[0174] 92.段 1、3、5、7、9、13、18、21、39、53、62、67、73、80、85、88和 91 之任一的方法，其中 信號(hào)探針包含兩條分開的核酸或經(jīng)修飾核酸的鏈，所述兩條鏈形成至少一個(gè)相互互補(bǔ)區(qū)。
[0175] 93.段92的方法，其中所述分開的兩條鏈從5'至3'端形成連續(xù)的相互互補(bǔ)區(qū)，并 且這兩條鏈具有相同數(shù)目的核苷酸。
[0176] 94.段92的方法，其中在兩條鏈之間形成相互互補(bǔ)區(qū)后，一條鏈的5'端與另一條 鏈不重合（offset)，或者該鏈的3'端與另一條鏈不重合，或者兩者兼而有之，其中所述不 重合（offset)為不超過10個(gè)的核苷酸或修飾的核苷酸。
[0177] 95.段92的方法，其中兩條鏈在每一端形成5或6個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的相互互補(bǔ)區(qū)。
[0178] 96.段92的方法，其中兩條鏈在序列上是不同的。
[0179] 97.段92的方法，其中所述鏈具有30個(gè)以上的核苷酸或修飾的核苷酸。
[0180] 98.段92的方法，其中核酸是DNA、RNA或兩者。
[0181] 99.段92的方法，其中修飾的核酸包括肽核酸、化學(xué)修飾的DNA或RNA、或其組合。
[0182] 100.段92的方法，其中修飾的核酸在糖基團(tuán)、磷酸二酯鍵和堿基基團(tuán)中的一個(gè)或 多個(gè)上發(fā)生化學(xué)修飾。
[0183] 101.段100的方法，其中磷酸二酯鍵由選自以下的化學(xué)基團(tuán)替代：--0Ρ(0Η) (0) 0-，-0P (0?+) (0) 0-，-OP (SH) (0) 0-，-OP (Sl〇 (0) 0-，一NHP (0) 20-，一0C (0) 20- -,-och2c (o) 2nh-, -och2c (o) 2o-, -OP (ch3) (0) 〇-, -OP (ch2c6h5) (o) 〇-, -P (S) (0) 〇--和--oc(o)2nh--。
[0184] 102.段 101 的方法，其中磷酸二酯鍵由一OP (SH) (0)0-，-OP (S_M+) (0) 0-或一P(S) (0)0-替代。
[0185] 103.段100的方法，其中化學(xué)修飾的RNA的2'位包含選自以下的化學(xué)基團(tuán)：&_(； 烷氧基、0CH2-CH = CH2、0CH2-CH = CH-CH3、0CH2-CH = CH-(CH2)nCH3(n = 0, 1，......30)、鹵 素、Q-C；烷基和0CH3。
[0186] 104.段100的方法，其中化學(xué)修飾的RNA包含2' -0-甲基取代。
[0187] 105.段92的方法，其中信號(hào)探針包含至少一個(gè)含有兩個(gè)化學(xué)基團(tuán)的相互作用對(duì)， 并且一個(gè)化學(xué)基團(tuán)位于一條鏈的一個(gè)末端，而另一化學(xué)基團(tuán)位于另一鏈的相鄰末端。
[0188] 106.段92的方法，其中信號(hào)探針具有兩個(gè)相互作用對(duì)，其中探針的每一端都在兩 條鏈的相鄰末端具有一個(gè)相互作用對(duì)。
[0189] 107.段92的方法，其中相互作用對(duì)選自：熒光團(tuán)和淬滅劑、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物和淬 滅劑或加合物、染料二聚體、和FRET供體和受體、蛋白水解酶和該蛋白水解酶的抑制劑或 能夠可逆地失活該酶的其它分子。
[0190] 108.段92的方法，其中相互作用對(duì)是熒光團(tuán)和淬滅劑，并分離發(fā)熒光的細(xì)胞。
[0191] 109.段92的方法，其中信號(hào)探針包含至少兩個(gè)相同或不同的熒光團(tuán)。
[0192] 110.段109的方法，其中信號(hào)探針包含至少兩個(gè)熒光團(tuán)，所述熒光團(tuán)是FRET供體 和受體對(duì)、或收獲（harvester)和發(fā)射（emitter)突光團(tuán)。
[0193] 111.段108的方法，其中分離所述發(fā)熒光的細(xì)胞的步驟采用熒光激活細(xì)胞分選 儀、熒光顯微鏡或熒光計(jì)實(shí)施。
[0194] 112.段 1、3、5、7、9、13、18、21、39、53、62、67、73、80、85、88 和 91 之任一的方法，其 中信號(hào)探針包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0195] 113.段112的方法，其中莖區(qū)形成4至6個(gè)連續(xù)的堿基對(duì)。
[0196] 114.段112的方法，其中莖環(huán)結(jié)構(gòu)包含至少一個(gè)含有兩個(gè)化學(xué)基團(tuán)的相互作用 對(duì)，且在鏈的每一端有一個(gè)化學(xué)基團(tuán)，其中莖區(qū)包含通過非互補(bǔ)區(qū)連接的兩個(gè)相互互補(bǔ)區(qū)， 與相互作用對(duì)鄰近的相互互補(bǔ)區(qū)形成5至6個(gè)堿基對(duì)，與環(huán)區(qū)鄰近的相互互補(bǔ)區(qū)形成4至 5個(gè)堿基對(duì)。
[0197] 115.段114的方法，其中非互補(bǔ)區(qū)是單鏈環(huán)區(qū)或錯(cuò)配區(qū)。
[0198] 116.段112的方法，其中莖環(huán)結(jié)構(gòu)包含至少一個(gè)含有兩個(gè)化學(xué)基團(tuán)的相互作用 對(duì)，且在鏈的每一端有一個(gè)化學(xué)基團(tuán)，其中莖區(qū)包含通過兩個(gè)非互補(bǔ)區(qū)連接的三個(gè)相互互 補(bǔ)區(qū)，與相互作用對(duì)鄰近的第一相互互補(bǔ)區(qū)形成4至5個(gè)堿基對(duì)，第二相互互補(bǔ)區(qū)形成2至 3個(gè)堿基對(duì)，而與環(huán)區(qū)鄰近的第三相互互補(bǔ)區(qū)形成2至3個(gè)堿基對(duì)。
[0199] 117.段116的方法，其中非互補(bǔ)區(qū)是單鏈環(huán)區(qū)和錯(cuò)配區(qū)中的一種或多種。
[0200] 118.段 1、3、5、7、9、13、18、21、39、53、62、67、73、80、85、88 和 91 之任一的方法，其 中信號(hào)探針包含啞鈴結(jié)構(gòu)。
[0201] 119.段118的方法，其中啞鈴結(jié)構(gòu)包含一個(gè)具有4個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的莖區(qū)和一個(gè)具 有3個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的莖區(qū)。
[0202] 120.段118的方法，其中兩個(gè)莖區(qū)經(jīng)由莖區(qū)的一條臂通過磷酸二酯鍵或修飾的磷 酸二酯鍵連接。
[0203] 121.段118的方法，其中兩個(gè)莖區(qū)經(jīng)由莖區(qū)的一條臂通過1或2個(gè)核苷酸或修飾 的核苷酸連接。
[0204] 122.段 1、3、5、7、9、13、18、21、39、53、62、67、73、80、85、88 和 91 之任一的方法，其 中信號(hào)探針包含三臂聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)。
[0205] 123.段122的方法，其中三臂聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)包含至少一個(gè)含有兩個(gè)化學(xué)基團(tuán)的相互作 用對(duì)，且在鏈的每一個(gè)末端有一個(gè)化學(xué)基團(tuán)，其中與相互作用對(duì)鄰近的莖區(qū)形成3至4個(gè)連 續(xù)堿基對(duì)，第一莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖區(qū)形成4至5個(gè)連續(xù)堿基對(duì)，第二莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖區(qū)形成2至3 個(gè)連續(xù)堿基對(duì)。
[0206] 124.段122的方法，其中三個(gè)區(qū)通過磷酸二酯鍵或修飾的磷酸二酯鍵經(jīng)由莖區(qū)的 臂連接。
[0207] 125.段122的方法，其中三個(gè)區(qū)通過1或2個(gè)核苷酸或修飾的核苷酸經(jīng)由莖區(qū)的 臂連接。
[0208] 126.段112、118和122之任一的方法，其中莖環(huán)結(jié)構(gòu)、啞鈴結(jié)構(gòu)或三臂聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)具 有30個(gè)以上的核苷酸或修飾的核苷酸。
[0209] 127.段112、118和122之任一的方法，其中所述結(jié)構(gòu)是DNA、RNA、肽核酸、化學(xué)修 飾的DNA、RNA或其組合。
[0210] 128.段112、118和122之任一的方法，其中所述結(jié)構(gòu)在糖基團(tuán)、磷酸二酯鍵和堿基 中的一個(gè)或多個(gè)上被化學(xué)修飾。
[0211] 129.段128的方法，其中磷酸二酯鍵被選自以下的化學(xué)基團(tuán)替代：一0Ρ(0Η) (〇)〇--、-OP (Olf)(0)0-、-OP (SH) (〇)〇--、-OP (Slf) (〇)〇--、一nhp(o2)o-、一oc(o)2o--、一0CH2C(0) 2NH-、一0CH2C(0)20-、一OP (CH3) (0)0-、一OP (CH2C6H5) (〇)〇--、一P(S) (0) 〇--和--oc(o)2nh--。
[0212] 130.段 129 的方法，其中磷酸二酯鍵被-OP (SH) (0) 0--、-0P (Sir) (0) o-和一P (S) (0) 0 一替代。
[0213] 131.段128的方法，其中化學(xué)修飾的RNA的2'位包含選自以下的化學(xué)基團(tuán)：&_(； 烷氧基、0CH2-CH = CH2、0CH2-CH = CH-CH3、0CH2-CH = CH-(CH2)nCH3(n = 0, 1，......30)、鹵 素、Q-C；烷基和0CH3。
[0214] 132.段128的方法，其中化學(xué)修飾的RNA具有2' -0-甲基取代。
[0215] 133.段112、118和122之任一的方法，其中相互作用對(duì)選自：突光團(tuán)和淬滅劑、化 學(xué)發(fā)光標(biāo)記物和淬滅劑或加合物（adduct)、染料二聚體（dye dimer)、和FRET供體和受體、 蛋白水解酶和該蛋白水解酶的抑制劑或能夠可逆地失活該酶的其它分子。
[0216] 134.段133的方法，其中相互作用對(duì)是熒光團(tuán)和淬滅劑，且分離發(fā)熒光的細(xì)胞。
[0217] 135.段134的方法，其中分離所述發(fā)熒光的細(xì)胞的步驟使用熒光激活細(xì)胞分選 儀、熒光顯微鏡或熒光計(jì)進(jìn)行。
[0218] 136.段112、118和122之任一的方法，其中信號(hào)探針在鏈的一個(gè)末端包含至少兩 個(gè)熒光團(tuán)，且在鏈的另一個(gè)末端包含淬滅劑，其中所述兩個(gè)熒光團(tuán)是FRET供體和受體對(duì)。
[0219] 137.包含核酸或經(jīng)修飾的核酸及至少一個(gè)蛋白水解酶和至少一個(gè)該蛋白水解酶 的抑制劑的探針，其中所述核酸或經(jīng)修飾的核酸含有與靶序列互補(bǔ)的序列以及相互互補(bǔ)的 序列，其中所述探針在無所述靶序列存在的試驗(yàn)條件下具有特征性的蛋白水解活性，該活 性的水平是所述蛋白水解酶及其抑制劑相互作用程度的函數(shù)；且其中在存在過量的所述靶 序列的條件下，所述靶互補(bǔ)序列與靶序列的雜交增加所述特征性蛋白水解活性的水平。
[0220] 138.段137的探針，其中蛋白水解酶是位點(diǎn)特異的或靶特異的蛋白酶。
[0221] 139.段137的探針，其中所述蛋白水解酶抑制劑是肽或化合物。
[0222] 140.段137的探針，其中所述蛋白水解酶和所述蛋白水解酶的抑制劑選自：氨肽 酶和抑氨肽酶肽、胰蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶和抗蛋白酶、氨肽酶和苯丁抑制素、胰凝乳 蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制劑、氨肽酶和diprotin A或B、羧肽酶A和 EDTA、彈性蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶和elastinal、及嗜熱菌蛋白酶或氨肽酶Μ和1，10-二氮 雜菲。
[0223] 141.段137的探針，其包含兩條分開的核酸或經(jīng)修飾核酸的鏈，這兩條鏈形成至 少一個(gè)相互互補(bǔ)的區(qū)。
[0224] 142.段141的探針，其中蛋白水解酶位于一條鏈的一個(gè)末端，而蛋白水解酶抑制 劑位于另一條鏈的相鄰末端。
[0225] 143.段141的探針，其中所述兩條分開的鏈從5'至3'端形成連續(xù)的相互互補(bǔ)區(qū)， 且兩條鏈具有相同數(shù)目的核苷酸。
[0226] 144.段141的探針，其中在兩條鏈之間形成相互互補(bǔ)區(qū)后，一條鏈的5'端與另一 條鏈不重合，或者該鏈的3'端與所述另一條鏈不重合，或者兩者兼而有之，其中所述不重合 為不超過10個(gè)的核苷酸或修飾的核苷酸。
[0227] 145.段141的探針，其中兩條鏈在每一端形成5或6個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的相互互補(bǔ)區(qū)。
[0228] 146.段145的探針，其中兩條鏈在序列上是不同的。
[0229] 147.段141的探針，其中所述鏈具有30個(gè)以上的核苷酸或修飾的核苷酸。
[0230] 148.段141的探針，其中核酸是DNA、RNA或兩者。
[0231] 149.段141的探針，其中經(jīng)修飾的核酸包括肽核酸、化學(xué)修飾的DNA或RNA或者其 組合。
[0232] 150.段141的探針，其中經(jīng)修飾的核酸在糖基團(tuán)、磷酸二酯鍵和堿基基團(tuán)中的一 個(gè)或多個(gè)上被化學(xué)修飾。
[0233] 151.段150的探針，其中磷酸二酯鍵被選自以下的化學(xué)基團(tuán)替代：--0Ρ(0Η) (〇)〇--、-OP (Olf)(0)0-、-OP (SH) (〇)〇--、-OP (Slf) (〇)〇--、一nhp(o)2o-、一oc(o)2o--、一0CH2C(0) 2NH-、一0CH2C(0)20-、一OP (CH3) (0)0-、一OP (CH2C6H5) (〇)〇--、一P(S) (0) 〇--和--oc(o)2nh--。
[0234] 152.段 150 的探針，其中磷酸二酯鍵被-OP (SH) (0) 0--、-0P (SIT) (0) o-或一P (S) (0)0-替代。
[0235] 153.段150的探針，其中化學(xué)修飾的RNA的2'位包含選自以下的化學(xué)基團(tuán)：&_(； 烷氧基、0CH2-CH = CH2、0CH2-CH = CH-CH3、0CH2-CH = CH-(CH2)nCH3(n = 0, 1，......30)、鹵 素、Q-C；烷基和0CH3。
[0236] 154.段150的探針，其中化學(xué)修飾的RNA包含2' -0-甲基取代。
[0237] 155.段137的探針，其包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0238] 156.段155的探針，其中莖區(qū)形成5至6個(gè)連續(xù)的堿基對(duì)。
[0239] 157.段155的探針，其中莖環(huán)結(jié)構(gòu)在該鏈的兩個(gè)末端分別包含至少一個(gè)蛋白水解 酶和所述蛋白水解酶的抑制劑，其中莖區(qū)包含經(jīng)由非互補(bǔ)區(qū)連接的兩個(gè)相互互補(bǔ)區(qū)，鄰近 鏈末端的相互互補(bǔ)區(qū)形成5至6個(gè)堿基對(duì)，鄰近環(huán)區(qū)的相互互補(bǔ)區(qū)形成4至5個(gè)堿基對(duì)。
[0240] 158.段157的探針，其中非互補(bǔ)區(qū)是單鏈環(huán)區(qū)或錯(cuò)配區(qū)。
[0241] 159.段155的探針，其中莖環(huán)結(jié)構(gòu)在該鏈的兩個(gè)末端分別包含至少一個(gè)蛋白水解 酶和所述蛋白水解酶的抑制劑，其中莖區(qū)包含經(jīng)由兩個(gè)非互補(bǔ)區(qū)連接的三個(gè)相互互補(bǔ)區(qū)， 鄰近鏈末端的第一相互互補(bǔ)區(qū)形成4至6個(gè)堿基對(duì)，第二相互互補(bǔ)區(qū)形成2至3個(gè)堿基對(duì)， 鄰近環(huán)區(qū)的第三相互互補(bǔ)區(qū)形成2至3個(gè)堿基對(duì)。
[0242] 160.段159的探針，其中非互補(bǔ)區(qū)是單鏈環(huán)區(qū)和錯(cuò)配區(qū)中的一種或多種。
[0243] 161.段137的探針，其包含啞鈴結(jié)構(gòu)。
[0244] 162.段161的探針，其中啞鈴結(jié)構(gòu)包含一個(gè)具有4個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的莖區(qū)和一個(gè)具 有3個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的莖區(qū)。
[0245] 163.段161的探針，其中兩個(gè)莖區(qū)經(jīng)由莖區(qū)的一條臂通過磷酸二酯鍵或修飾的磷 酸二酯鍵連接。
[0246] 164.段161的探針，其中兩個(gè)莖區(qū)經(jīng)由莖區(qū)的一條臂通過1或2個(gè)核苷酸或修飾 的核苷酸連接。
[0247] 165.段137的探針，其包含三臂聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)。
[0248] 166.段165的探針，其中三臂聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)在該鏈的兩個(gè)末端分別包含至少一個(gè)蛋白 水解酶和所述蛋白水解酶的抑制劑，其中鄰近鏈末端的莖區(qū)形成3至4個(gè)連續(xù)堿基對(duì)，第一 莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖區(qū)形成4至5個(gè)連續(xù)堿基對(duì)，和第二莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖區(qū)形成2至3個(gè)連續(xù)堿基 對(duì)。
[0249] 167.段165的探針，其中三個(gè)區(qū)通過磷酸二酯鍵或修飾的磷酸二酯鍵經(jīng)由莖區(qū)的 臂連接。
[0250] 168.段165的探針，其中三個(gè)區(qū)通過1或2個(gè)核苷酸或修飾的核苷酸經(jīng)由莖區(qū)的 臂連接。
[0251] 169.段155、161或165的探針，其中莖環(huán)結(jié)構(gòu)、啞鈴結(jié)構(gòu)或三臂聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)具有30 個(gè)以上的核苷酸或修飾的核苷酸。
[0252] 170.段155、161或165的探針，其中該結(jié)構(gòu)是DNA、RNA、肽核酸、化學(xué)修飾的DNA、 RNA，或其組合。
[0253] 171.段155、161或165的探針，其中該結(jié)構(gòu)在糖基團(tuán)、磷酸二酯鍵和堿基中的一個(gè) 或多個(gè)上被化學(xué)修飾。
[0254] 172.段177的探針，其中磷酸二酯鍵被選自以下的化學(xué)基團(tuán)替代：一0Ρ(0Η) (0)0-、-OP (Olf )(0)0-、-OP (SH) (0)0-、-OP (Slf) (0)0-、一NHP(0)20-、一oc(o)2o--、-och2c(o) 2nh--、一0CH2C(0)20-、一OP (CH3) (0)0-、一OP (CH2C6H5) (〇)〇--、一P(S) (0) 〇--和--oc(o)2nh--。
[0255] 173.段 171 的探針，其中磷酸二酯鍵被-OP (SH) (0)0-、-OP (S_M+) (0) 0-或一P(S) (0)0-替代。
[0256] 174.段171的探針，其中化學(xué)修飾的RNA的2'位包含選自以下的化學(xué)基團(tuán)：(：「(； 烷氧基、0CH2-CH = CH2、0CH2-CH = CH-CH3、0CH2-CH = CH-(CH2)nCH3(n = 0, 1，......30)、鹵 素、Q-C；烷基和0CH3。
[0257] 175.段171的探針，其中化學(xué)修飾的RNA具有2' -0-甲基取代。
[0258] 176.包含至少一種編碼至少一種目的RNA和標(biāo)簽序列的DNA的DNA構(gòu)建體，其中 標(biāo)簽序列形成三臂聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)，且莖區(qū)包含8-9個(gè)堿基對(duì)，第一莖環(huán)區(qū)包含4-6個(gè)堿基對(duì)、第 二莖環(huán)區(qū)包含13-17個(gè)堿基對(duì)。
[0259] 177.段176的DNA構(gòu)建體，其中三臂的莖區(qū)還包含非互補(bǔ)區(qū)。
[0260] 178.段176的DNA構(gòu)建體，其中莖區(qū)和第一莖環(huán)區(qū)均還包含一個(gè)錯(cuò)配區(qū)，第二莖環(huán) 區(qū)還包含2-7個(gè)錯(cuò)配或凸出區(qū)域。
[0261] 179.段176的DNA構(gòu)建體，其中莖區(qū)之間的連接具有總共8-12個(gè)核苷酸。
[0262] 180.包含至少一種編碼至少一種目的RNA和標(biāo)簽序列的DNA的DNA構(gòu)建體，其中 標(biāo)簽序列選自圖42A、B和C中所述的序列。
[0263] 181.包含至少一種編碼至少一種目的RNA和標(biāo)簽序列的DNA的DNA構(gòu)建體，其中 標(biāo)簽序列形成通過圖42A、B或C中所述的序列預(yù)測(cè)的在能量上更為有利的結(jié)構(gòu)。
[0264] 182.包含段176至181之任一的DNA構(gòu)建體的載體。
[0265] 183.包含段182的載體或段176至181之任一的DNA構(gòu)建體的細(xì)胞。
[0266] 184.段183的細(xì)胞，其選自永生化細(xì)胞、原代細(xì)胞、干細(xì)胞和生殖細(xì)胞。
[0267] 185.段183的細(xì)胞，其選自HeLa細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞、HEK293細(xì)胞和CH0細(xì)胞。
[0268] 186.穩(wěn)定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的文庫(kù)，其包含至少10, 000個(gè)細(xì)胞系，每個(gè)細(xì)胞系包 含至少一個(gè)穩(wěn)定整合的表達(dá)的序列。
[0269] 187.穩(wěn)定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的文庫(kù)，其包含至少500個(gè)細(xì)胞系，每個(gè)細(xì)胞系包含 至少兩個(gè)穩(wěn)定整合的序列。
[0270] 188.穩(wěn)定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的文庫(kù)，其包含至少50個(gè)細(xì)胞系，每個(gè)細(xì)胞系包含至 少三個(gè)穩(wěn)定整合的序列。
[0271] 189.穩(wěn)定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的文庫(kù)，其包含至少20個(gè)細(xì)胞系，每個(gè)細(xì)胞系包含至 少4個(gè)穩(wěn)定整合的序列。
[0272] 190.段186-189之任一的文庫(kù)，其中細(xì)胞系還包含藥物抗性基因。
[0273] 191.穩(wěn)定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的文庫(kù)，其包含至少50個(gè)細(xì)胞系，每個(gè)細(xì)胞系包含至 少一個(gè)穩(wěn)定整合的序列，其中所述細(xì)胞系缺少藥物抗性基因。
[0274] 192.穩(wěn)定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的文庫(kù)，其包含至少20個(gè)細(xì)胞系，每個(gè)細(xì)胞系包含至 少兩個(gè)穩(wěn)定整合的序列，其中細(xì)胞系缺少藥物抗性基因。
[0275] 193.段186-192之任一的文庫(kù)，其中每個(gè)細(xì)胞系都包含可變的文庫(kù)序列。
[0276] 194.段193的文庫(kù)，其中所述表達(dá)文庫(kù)的可變序列選自：基因組序列、基因組的非 翻譯序列、基因組的翻譯序列、基因序列、cDNA序列、EST序列、寡聚物（ο 1 igo)序列、隨機(jī)序 列、RNA序列、蛋白質(zhì)序列、蛋白質(zhì)域序列、肽序列、內(nèi)含子序列、外顯子序列、標(biāo)簽序列、或接 頭序列，或其組合或其重組物，或者這些未修飾的、經(jīng)誘變的、隨機(jī)化的、改組的或重組的序 列中的一種或多種。
[0277] 195.段186-192之任一的文庫(kù)，其中使用至少一個(gè)由具有未知序列身份的遺傳序 列組成的匯合物或混合物產(chǎn)生文庫(kù)。
[0278] 196.段195的文庫(kù)，其中所述具有未知身份的序列共有序列同源性、功能意義 (functional significance)或相關(guān)來源。
[0279] 197.段186-192之任一的文庫(kù)，其中文庫(kù)是單獨(dú)合成的構(gòu)建體的集合，所述構(gòu)建 體包含具有已知身份的特定序列。
[0280] 198.段197的文庫(kù)，其中所述特定序列共有序列同源性、功能意義或相關(guān)來源。
[0281] 199.段186-192之任一的文庫(kù)，其中所述表達(dá)序列處于組成型啟動(dòng)子的控制之 下。
[0282] 200.段186-192之任一的文庫(kù)，其中所述表達(dá)序列處于選自以下的條件型啟動(dòng)子 的控制之下：誘導(dǎo)型、阻遏型、組織特異性、時(shí)限型（temporal)或熱休克型啟動(dòng)子。
[0283] 201.段186-192之任一的文庫(kù)，其中文庫(kù)用于基于細(xì)胞的篩選試驗(yàn)。
[0284] 202.段201的文庫(kù)，其中基于細(xì)胞的篩選試驗(yàn)針對(duì)所述文庫(kù)中的所有細(xì)胞系平行 地進(jìn)行。
[0285] 203.段201的文庫(kù)，其中基于細(xì)胞的篩選試驗(yàn)針對(duì)所述文庫(kù)中的部分細(xì)胞系進(jìn) 行。
[0286] 204.核酸或修飾的核酸分子，其包含根據(jù)圖8至24和41的FP1至FP18之任一的 序列。
[0287] 205.段204的核酸或修飾的核酸分子，其還包含相互作用對(duì)。
[0288] 206.段205的核酸或修飾的核酸分子，其中相互作用對(duì)選自：熒光團(tuán)和淬滅劑、化 學(xué)發(fā)光標(biāo)記物和淬滅劑或加合物、染料二聚體、和FRET供體和受體、蛋白水解酶和該蛋白 水解酶的抑制劑或能夠可逆地失活該酶的其它分子。
[0289] 207.核酸或修飾的核酸分子，其可以與根據(jù)圖42D1、2或3的序列雜交。
[0290] 208.段207的核酸或修飾的核酸分子，其還包含相互作用對(duì)。
[0291] 209.段208的核酸或修飾的核酸分子，其中相互作用對(duì)選自：熒光團(tuán)和淬滅劑、化 學(xué)發(fā)光標(biāo)記物和淬滅劑或加合物、染料二聚體、和FRET供體和受體、蛋白水解酶和該蛋白 水解酶的抑制劑或能夠可逆地失活該酶的其它分子。
[0292] 210.包含圖42A、B或C中的序列的核酸或修飾的核酸分子。
[0293] 211.包含圖42D1或D2中的序列的核酸或修飾的核酸分子。
[0294] 本發(fā)明提供分離表達(dá)RNA的細(xì)胞的方法，包括步驟：提供表達(dá)該RNA的細(xì)胞，將細(xì) 胞暴露于在與該RNA雜交時(shí)可以產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)探針，和分離產(chǎn)生該信號(hào)的細(xì)胞。 一個(gè)實(shí)施方案中，所述RNA是內(nèi)源性RNA。另一實(shí)施方案中，由引入細(xì)胞中的DNA導(dǎo)致該內(nèi) 源性RNA的表達(dá)，例如，該DNA包含增強(qiáng)子或啟動(dòng)子或可以誘導(dǎo)內(nèi)源性RNA表達(dá)的其它序 列。例如，該DNA可以編碼誘導(dǎo)RNA表達(dá)的蛋白質(zhì)，例如轉(zhuǎn)錄因子。在再一實(shí)施方案中，所 述RNA由引入細(xì)胞中的核酸編碼。引入細(xì)胞中的該DNA還可以編碼標(biāo)簽序列，其中信號(hào)探 針可以任選地靶向該標(biāo)簽和/或RNA序列。標(biāo)簽序列可以與RNA的開放閱讀框相符或不相 符。一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括檢測(cè)外源或異源RNA及內(nèi)源RNA的表達(dá)。可以實(shí)施這些 方法以同時(shí)檢測(cè)多種RNA和/或標(biāo)簽。這些RNA可以是相同的或不同的RNA。在利用該方 法通過使用一種以上的信號(hào)探針檢測(cè)一種以上的RNA的那些實(shí)施方案中，由不同信號(hào)探針 產(chǎn)生的信號(hào)可以彼此相同或者可以彼此不同。
[0295] 本發(fā)明還提供分離包含一個(gè)以上拷貝的外源或異源DNA的細(xì)胞的方法。該方法包 括步驟：引入編碼RNA和標(biāo)簽序列的DNA并引入編碼相同RNA和不同標(biāo)簽序列的DNA ;將細(xì) 胞暴露于可以針對(duì)兩個(gè)標(biāo)簽產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)探針；和分離產(chǎn)生兩個(gè)信號(hào)的細(xì)胞。
[0296] 在具有一個(gè)以上的暴露步驟的本發(fā)明任一種方法中，一個(gè)或多個(gè)暴露步驟（例 如，將細(xì)胞暴露于信號(hào)探針的步驟）可以同時(shí)或相繼地實(shí)施。
[0297] 在本發(fā)明任一方法中，所述RNA或蛋白質(zhì)可以是處在相同或相關(guān)的生物學(xué)途徑中 的RNA或蛋白質(zhì)，在彼此上游或下游起作用，相對(duì)于彼此具有調(diào)節(jié)、激活或阻遏功能、對(duì)于 功能或活性而言相互依賴、是同一復(fù)合物的成分、是相同蛋白質(zhì)家族的成員，等等。
[0298] 本發(fā)明提供分離包含DNA構(gòu)建體的細(xì)胞的方法，所述DNA構(gòu)建體編碼處于條件型 啟動(dòng)子控制下的第一 RNA，所述方法包括步驟：將編碼處于組成型啟動(dòng)子控制下的RNA的 DNA構(gòu)建體引入細(xì)胞，其中該DNA構(gòu)建體還編碼處于條件型啟動(dòng)子控制下的第二RNA，其中 該引入在第二RNA不表達(dá)或低水平表達(dá)的條件下進(jìn)行；將細(xì)胞暴露于在與第一 RNA雜交時(shí) 可以產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)探針；和分離產(chǎn)生該信號(hào)的細(xì)胞。該DNA構(gòu)建體還可以編碼待 測(cè)RNA，其中例如該待測(cè)RNA是可變的，例如來源于表達(dá)文庫(kù)?？梢允褂眠@些細(xì)胞獲得或鑒 定能夠激活驅(qū)動(dòng)所述第二RNA表達(dá)的條件型啟動(dòng)子的RNA或化合物。
[0299] 本發(fā)明還提供分離多個(gè)細(xì)胞的方法，其中一個(gè)細(xì)胞子集表達(dá)另一細(xì)胞子集不表達(dá) 的RNA，所述方法包括步驟：將編碼多種RNA的多種DNA引入細(xì)胞，其中所述多種RNA的至少 一個(gè)子集彼此不同，將細(xì)胞暴露于多種不同的信號(hào)探針，其中所述信號(hào)探針在與該多種DNA 所編碼的一種或多種RNA雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，和分離產(chǎn)生該信號(hào)的細(xì)胞。所述細(xì)胞子 集可以是一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)以上的細(xì)胞。一個(gè)實(shí)施方案中，所述DNA不編碼RNA，但是導(dǎo)致內(nèi) 源性RNA的表達(dá)，例如，該DNA包含增強(qiáng)子或啟動(dòng)子序列，例如，該DNA包含誘導(dǎo)內(nèi)源RNA表 達(dá)的序列。例如，該DNA可以編碼蛋白質(zhì)，例如誘導(dǎo)RNA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。該DNA還可以編 碼標(biāo)簽序列，并且信號(hào)探針可以靶向該標(biāo)簽序列和/或RNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多 種RNA形成表達(dá)文庫(kù)。另一實(shí)施方案中，所述DNA的至少一個(gè)子集編碼相同標(biāo)簽序列。
[0300] 本發(fā)明還提供分離兩個(gè)或兩個(gè)以上RNA文庫(kù)細(xì)胞的方法，包括步驟：將編碼第一 RNA表達(dá)文庫(kù)的DNA引入細(xì)胞，其中每一個(gè)DNA還編碼第一標(biāo)簽序列，將編碼第二RNA表達(dá) 文庫(kù)的DNA引入細(xì)胞，其中每一個(gè)DNA還編碼第二標(biāo)簽序列，將細(xì)胞暴露于可以在與第一標(biāo) 簽雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的第一信號(hào)探針和可以在與第二標(biāo)簽序列雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信 號(hào)的第二信號(hào)探針，和分離產(chǎn)生兩個(gè)信號(hào)的細(xì)胞。該方法還可以對(duì)編碼其它RNA表達(dá)文庫(kù) 的DNA實(shí)施，其中一個(gè)使用第三標(biāo)簽，等。
[0301] 本發(fā)明任一方法都可以通過將化合物加入細(xì)胞并分析由信號(hào)探針?biāo)a(chǎn)生的信號(hào) 的改變（增加或降低）而用于鑒定調(diào)節(jié)RNA或多種RNA的表達(dá)的化合物。
[0302] 本發(fā)明提供降低蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，包括步驟：將編碼可以降低該蛋白質(zhì)表達(dá)的 反義RNA或shRNA的DNA引入細(xì)胞，使細(xì)胞暴露于可以在與該反義RNA或shRNA雜交時(shí)產(chǎn) 生可檢測(cè)信號(hào)的第一信號(hào)探針，和分離產(chǎn)生該信號(hào)的細(xì)胞。該方法還可以包括步驟：使細(xì)胞 暴露于可以在與編碼該蛋白質(zhì)的RNA雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的第二信號(hào)探針，其中缺乏來 自該第二信號(hào)探針的信號(hào)將指示該蛋白質(zhì)的表達(dá)被降低。還可以使用其它方法，例如使用 特異結(jié)合該蛋白質(zhì)的抗體，使用功能試驗(yàn)，例如分析該蛋白質(zhì)的已知生物學(xué)活性，等等，來 檢查蛋白質(zhì)表達(dá)的降低。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，省去使細(xì)胞暴露于第一信號(hào)探針的 步驟。任何使用siRNA的方法也都可以使用shRNA進(jìn)行。
[0303] 在本發(fā)明任何方法中，向細(xì)胞中引入的DNA可以可操作地與條件型啟動(dòng)子連接。 一個(gè)實(shí)施方案中，DNA所編碼的RNA對(duì)細(xì)胞是致死性的或損傷性的。DNA還可以包含可以用 于選擇包含該DNA的細(xì)胞的選擇標(biāo)記。
[0304] 本發(fā)明還提供定量生物學(xué)樣品中RNA的表達(dá)水平的方法，包括步驟：將生物學(xué)樣 品暴露于在與該RNA雜交時(shí)可以產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的第一信號(hào)探針，定量生物學(xué)樣品中該信 號(hào)的水平，和將此信號(hào)水平與該RNA的表達(dá)水平關(guān)聯(lián)起來。
[0305] 本發(fā)明還提供鑒定調(diào)節(jié)RNA表達(dá)的化合物的方法，包括：將待測(cè)化合物加入表達(dá) 該RNA的細(xì)胞，使細(xì)胞暴露于可以在與該RNA雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)探針，和將暴露 于待測(cè)化合物的細(xì)胞所產(chǎn)生的信號(hào)與未暴露于該待測(cè)化合物的細(xì)胞所產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行比 較，其中與后一細(xì)胞所產(chǎn)生的信號(hào)相比，前一細(xì)胞所產(chǎn)生的信號(hào)的增加或降低指示該化合 物調(diào)節(jié)該RNA的表達(dá)。一個(gè)實(shí)施方案中，該RNA由引入細(xì)胞中的DNA編碼。一個(gè)實(shí)施方案 中，化合物是RNA或蛋白質(zhì)。
[0306] 本發(fā)明提供鑒定活細(xì)胞中的遺傳重組事件的方法，包括步驟：將細(xì)胞暴露于可以 在與自重組序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)探針，其中檢測(cè)到產(chǎn)生該信 號(hào)的細(xì)胞將指示該細(xì)胞包含所述遺傳重組事件。
[0307] 本發(fā)明還提供通過這些方法中的任何方法產(chǎn)生的細(xì)胞?？梢耘囵B(yǎng)這些細(xì)胞，并且 可以將其用于產(chǎn)生細(xì)胞系或多個(gè)細(xì)胞系。這些細(xì)胞可以用于多種目的，例如，用于基于細(xì)胞 的試驗(yàn)中或?qū)⒓?xì)胞植入動(dòng)物、非人動(dòng)物或哺乳動(dòng)物。該細(xì)胞可以是胚胎干細(xì)胞、原代細(xì)胞、 生殖細(xì)胞或干細(xì)胞。該細(xì)胞還可以是永生化的細(xì)胞。該細(xì)胞可以是內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、間 充質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腎細(xì)胞、肝細(xì)胞、造血細(xì)胞或免疫細(xì)胞。該細(xì)胞可以是真核細(xì)胞、原核 細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、人細(xì)胞、靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞、牛細(xì)胞、豬細(xì)胞、貓細(xì) 胞、嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞、有袋類動(dòng)物的細(xì)胞、鼠細(xì)胞或其它細(xì)胞。
[0308] 標(biāo)簽序列可以包含多個(gè)靶序列，其中每一個(gè)靶序列與一個(gè)信號(hào)探針雜交。標(biāo)簽序 列可以是具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA。該結(jié)構(gòu)可以是三臂聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)。DNA可以包含多個(gè)標(biāo)簽序列。 標(biāo)簽序列可以轉(zhuǎn)錄成與該DNA所編碼的RNA相同的RNA，或者標(biāo)簽序列可以轉(zhuǎn)錄成分開的 RNA。本發(fā)明還提供包含編碼RNA和標(biāo)簽序列的DNA序列的DNA構(gòu)建體。該標(biāo)簽序列可以 是此處所述的任一標(biāo)簽序列。本發(fā)明還提供包含該DNA構(gòu)建體的細(xì)胞和載體。
[0309] 本發(fā)明還提供包含至少1，000個(gè)、至少800個(gè)、至少600個(gè)、至少500個(gè)、至少400 個(gè)、至少200個(gè)、至少100個(gè)或至少50個(gè)細(xì)胞系的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系文庫(kù)，其中每個(gè)細(xì)胞系包 含穩(wěn)定整合的表達(dá)的序列。還提供包含至少500個(gè)、至少400個(gè)、至少300個(gè)、至少200個(gè)、 至少200個(gè)、至少100個(gè)、至少50個(gè)細(xì)胞系的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系文庫(kù)，其中每個(gè)細(xì)胞系包含至 少兩個(gè)穩(wěn)定整合的序列。還提供包含至少100個(gè)、至少50個(gè)、至少25個(gè)、至少10個(gè)細(xì)胞系 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系文庫(kù)，其中每個(gè)細(xì)胞系包含至少三個(gè)穩(wěn)定整合的序列。還提供包含至少 50個(gè)、至少25個(gè)、至少20個(gè)、至少10個(gè)細(xì)胞系的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系文庫(kù)，其中每個(gè)細(xì)胞系包 含至少4個(gè)穩(wěn)定整合的序列。在這些細(xì)胞系中的穩(wěn)定整合的序列還可以缺乏選擇標(biāo)記，例 如藥物抗性基因。該穩(wěn)定整合的序列可以具有已知的或未知的序列身份。這些序列可以共 有序列同源性、功能意義或相關(guān)來源。這些文庫(kù)可以用于多種目的，例如基于細(xì)胞的篩選試 驗(yàn)。
[0310] 本發(fā)明還提供鑒定化合物的方法，其中所述化合物可以增強(qiáng)使用信號(hào)探針對(duì)細(xì)胞 中的靶進(jìn)行的檢測(cè)，所述方法包括步驟：將信號(hào)探針引入包含靶序列的細(xì)胞中，其中信號(hào)探 針在與靶序列雜交時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，將細(xì)胞暴露于待測(cè)化合物，和檢測(cè)細(xì)胞所產(chǎn)生的信 號(hào)，其中與未暴露于待測(cè)化合物的細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)相比，暴露于待測(cè)化合物的細(xì)胞產(chǎn)生的 信號(hào)的增加指示該待測(cè)化合物是可以增強(qiáng)使用信號(hào)探針對(duì)細(xì)胞中的靶進(jìn)行的檢測(cè)的化合 物。
[0311] 本發(fā)明還提供鑒定化合物的方法，其中所述化合物可以介導(dǎo)或提高信號(hào)探針向細(xì) 胞中的引入，所述方法包括步驟：在待測(cè)化合物存在下將細(xì)胞暴露于信號(hào)探針，其中所述細(xì) 胞包含靶序列并且其中信號(hào)探針在與該靶序列雜交時(shí)可以產(chǎn)生信號(hào)；和檢測(cè)所述細(xì)胞產(chǎn)生 的信號(hào)，其中與未暴露于該待測(cè)化合物的細(xì)胞相比，暴露于該待測(cè)化合物的細(xì)胞所產(chǎn)生的 信號(hào)的增加指示，該待測(cè)化合物是可以介導(dǎo)或提高信號(hào)探針向細(xì)胞中的引入的化合物。
[0312] 本發(fā)明的這些和其它方面將從以下詳述中彰顯。
[0313]
【權(quán)利要求】
1. 含有第一核酸鏈和第二核酸鏈的信號(hào)探針，所述第一和第二鏈各包含能夠雜交的相 互互補(bǔ)區(qū)域，其中所述第一鏈在一末端具有淬滅劑部分和所述第二鏈在所述鏈雜交時(shí)與淬 滅劑部分相鄰的末端具有熒光團(tuán)，其中一條鏈與目的RNA中的靶序列或與目的RNA相關(guān)的 靶序列雜交，其中所述靶序列與所述鏈的結(jié)合產(chǎn)生可檢測(cè)熒光信號(hào)。
2. 權(quán)利要求1的探針，其中所述淬滅劑部分是鉈或金納米顆粒。
3. 權(quán)利要求2的探針，其中所述淬滅劑部分是金納米顆粒。
4. 權(quán)利要求1 一 3中任一項(xiàng)的探針，其中所述探針含有超過一個(gè)的淬滅劑部分和熒光 團(tuán)對(duì)。
5. 權(quán)利要求1 一 3中任一項(xiàng)的探針，其中所述探針包含多個(gè)熒光團(tuán)。
6. 檢測(cè)細(xì)胞中目的RNA表達(dá)的方法，包括如下步驟： a) 提供潛在表達(dá)目的RNA的細(xì)胞； b) 將所述細(xì)胞暴露于權(quán)利要求1 一 5中任一項(xiàng)的探針；和 c) 檢測(cè)在所述探針與目的RNA中的靶序列或與目的RNA相關(guān)的靶序列結(jié)合時(shí)所產(chǎn)生的 突光信號(hào)。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述檢測(cè)采用熒光激活細(xì)胞分選儀技術(shù)、熒光顯微鏡或熒 光計(jì)技術(shù)實(shí)施。
8. 權(quán)利要求6或7的方法，其進(jìn)一步包括分離展示所述可檢測(cè)信號(hào)的細(xì)胞的步驟。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述分離步驟采用熒光激活細(xì)胞分選儀技術(shù)實(shí)施。
10. 產(chǎn)生細(xì)胞系的方法，其包括培養(yǎng)在權(quán)利要求8的方法中分離的細(xì)胞的步驟。
11. 權(quán)利要求6 - 10中任一項(xiàng)的方法，其中所述目的RNA包含如下中的一個(gè)或多個(gè)： 信使 RNA、反義 RNA、siRNA、tRNA、結(jié)構(gòu) RNA、核糖體 RNA、hnRNA 和 snRNA。
12. 權(quán)利要求6 - 9和11中的任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是活細(xì)胞。
13. 定量細(xì)胞中目的RNA的表達(dá)水平的方法，其包括： a) 將所述細(xì)胞暴露于權(quán)利要求1 一 5中任一項(xiàng)的信號(hào)探針中； b) 定量在所述探針與細(xì)胞中目的RNA中的靶序列或與細(xì)胞中目的RNA相關(guān)的靶序列結(jié) 合時(shí)所產(chǎn)生的信號(hào)水平；和 c) 將所述信號(hào)的水平與目的RNA的表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述定量采用熒光激活細(xì)胞分選儀技術(shù)或熒光顯微鏡實(shí) 施。
15. 權(quán)利要求13或14的方法，其進(jìn)一步包括分離展示所述可檢測(cè)信號(hào)的細(xì)胞的步驟。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述分離步驟采用熒光激活細(xì)胞分選儀技術(shù)實(shí)施。
17. 產(chǎn)生細(xì)胞系的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求15的方法中分離的細(xì)胞的步驟。
18. 權(quán)利要求13 - 17中任一項(xiàng)的方法，其中所述目的RNA包含如下中的一個(gè)或多個(gè)： 信使 RNA、反義 RNA、siRNA、tRNA、結(jié)構(gòu) RNA、核糖體 RNA、hnRNA 和 snRNA。
19. 權(quán)利要求13 - 16和181中的任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是活細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104109712SQ201410228878
【公開日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2005年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2004年2月18日
【發(fā)明者】K·謝克達(dá), D·J·索查克, J·M·蒙特茲 申請(qǐng)人:克羅莫塞爾公司