人泡沫病毒載體介導(dǎo)的抑制HIV-1復(fù)制的shRNA的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了人泡沫病毒載體介導(dǎo)的抑制HIV-1復(fù)制的shRNA的構(gòu)建和應(yīng)用。抑制HIV-1復(fù)制的shRNA為shRNA1、2或3，它們都包含19nt的siRNA正義鏈（SEQIDNO.1、3、5），9nt的loop環(huán)，19nt的siRNA反義鏈和終止信號(hào)。這些shRNA能夠特異性地抑制HIV-1NL4-3基因的表達(dá)。通過構(gòu)建表達(dá)上述shRNA的人泡沫病毒載體和Luciferase、qPCR、ELISA和LDH分析表明本發(fā)明的shRNA可有效穩(wěn)定地抑制HIV-1NL4-3基因的表達(dá)，展示了人泡沫病毒作為表達(dá)載體介導(dǎo)的siRNA在艾滋病治療中的應(yīng)用前景，為艾滋病治療研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【專利說明】人泡沬病毒載體介導(dǎo)的抑制HIV-1復(fù)制的shRNA的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及人泡沫病毒載體介導(dǎo)的抑制Hiv-1復(fù)制的shRNA的構(gòu)建和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人類免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency virus,HIV)俗稱艾滋病(Acquiredimmune deficiency syndrome,AIDS)病毒,誘發(fā)人類獲得性免疫缺陷綜合征。該病毒在分類上屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬中的靈長(zhǎng)類免疫缺陷病毒亞屬。HIV感染一直是公眾健康的重大威脅。目前的抗HIV治療藥物不能對(duì)疾病進(jìn)行徹底的治療，而且患者還需要終身服藥。因此，更多的研究開始轉(zhuǎn)變以往的治療思路，探尋更加有效更加經(jīng)濟(jì)的治療辦法。
[0003]RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的可用于各種病毒治療的新方法。目前已有很多研究報(bào)道了通過對(duì)HIV保守基因進(jìn)行RNA干擾，進(jìn)而達(dá)到抑制HIV病毒復(fù)制的目的。RNAi也稱為依賴于RNA的基因沉默機(jī)制，是指通過雙鏈RNA特異性地抑制與其序列同源的靶基因mRNA表達(dá)的現(xiàn)象。
[0004]由于HIV-1的高突變率，其在RNAi靶點(diǎn)序列的堿基突變可顯著降低或解除RNAi的抑制效果。因此尋找保守的靶基因至關(guān)重要。HIV-1的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long terminalrepeat, LTR)含有病毒復(fù)制所必需的重要調(diào)控因子，在病毒表達(dá)調(diào)控中起到了重要作用。因此選擇HIV-1LTR區(qū)作為RNAi的靶序列。RNAi可以用化學(xué)合成的成熟的siRNA (smallinterfering RNA,小干擾RNA)去瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,但在體內(nèi)半衰期很短,短時(shí)間內(nèi)降解，而且在動(dòng)物中不適用。通過表達(dá)shRNA (short hairpin RNA,短發(fā)夾RNA)的病毒載體整合進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)是RNAi的首選。
[0005]泡沫病毒(Foamy virus, FV),也稱合胞體病毒,是逆轉(zhuǎn)錄病毒的重要成員。因其感染細(xì)胞后可誘導(dǎo)產(chǎn)生類似泡沫的大量空泡、多核細(xì)胞而得名，至今仍未能發(fā)現(xiàn)其與人類的某種疾病存在著相互關(guān)聯(lián)。病毒載體有許多優(yōu)點(diǎn)，如轉(zhuǎn)染效率高、整合準(zhǔn)確，可將外源基因轉(zhuǎn)移入人體的許多不同類型的細(xì)胞等，但也存在著令人不安的難題，其中最主要為潛在的致癌可能性。而泡沫病毒載體的安全性則更高，同時(shí)它有著廣泛的宿主范圍，且可攜帶大片段外源基因。
[0006]人泡沫病毒(Human foamy virus, HFV,也稱為原型泡沫病毒(Prototype foamyvirus, PFV))缺失載體(ΔΦ)缺失了原病毒基因組gag、pol、env、bell-3附屬基因和LTR U3區(qū)，但是保留了一個(gè)必須的2.5kb長(zhǎng)的順式作用區(qū)。另外，終止密碼子被引入到保留的gag序列 去阻止病毒多肽的表達(dá)，進(jìn)一步消除Gag-Pol融合蛋白的反面影響。同時(shí)，還有三種單獨(dú)的輔助載體質(zhì)粒(pCiGS、pCiPS、pCiES)來分別表達(dá)Gag，Pol, Env蛋白，四種質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染可以產(chǎn)生正常的人泡沫病毒載體原液(Trobridge G, JosephsonN, Vassilopoulos Gj Mac J，Russell DW.1mproved foamy virus vectors with minimalviral sequences.Mol Therj 2002, 6(3):321-8)0
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的首要目的在于提供一種抑制HIV-1復(fù)制的siRNA。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供含有上述siRNA抑制HIV-1復(fù)制的shRNA。
[0009]本發(fā)明的再一目的在于提供含有上述shRNA抑制HIV-1復(fù)制的人泡沫病毒表達(dá)載體及構(gòu)建方法。
[0010]本發(fā)明的目的還在于提供上述siRNA、shRNA或人泡沫病毒表達(dá)載體的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0012]一種抑制 HIV-1 復(fù)制的 siRNA，為 siRNAl、siRNA2 或 siRNA3 ;其中，
[0013]siRNAl 的正義鏈為:5’ -GCATCCGGAGTACTACAAA-3’，
[0014]siRNAl 的反義鏈為:5’-TTTGTAGTACTCCGGATGC-3’ ；
[0015]siRNA2 的正義鏈為:5’ -GCCCTCAGATGCTACATAT-3’，
[0016]siRNA2 的反義鏈為:5’-ATATGTAGCATCTGAGGGC-3’ ；
[0017]siRNA3 的正義鏈為:5’ -GCTTGCCTTGAGTGCTCAA-3’，
[0018]siRNA3 的反 義鏈為:5’ -TTGAGCACTCAAGGCAAGC-3’。
[0019]一種抑制HIV-1復(fù)制的shRNA，為shRNAl、shRNA2或shRNA3，它們都包含19nt的siRNA 正義鏈，9nt 的 loop 環(huán)，19nt 的 siRNA 反義鏈和終止信號(hào)；shRNAl、shRNA2、shRNA3的siRNA正義鏈和siRNA反義鏈分別為siRNAl、siRNA2、siRNA3的正義鏈和反義鏈；所述的loop環(huán)的堿基序列為TTCAAGAGA ;所述的終止信號(hào)的堿基序列為TTTTT。
[0020]一種抑制HIV-1復(fù)制的人泡沫病毒表達(dá)載體，為能表達(dá)shRNAl、shRNA2或shRNA3的 ρ Λ Φ-Hl-shRNAl、ρ Δ Φ-Η1_8?ιΚΝΑ2 或 ρ Λ Φ-Hl-shRNASo
[0021]所述的抑制HIV-1復(fù)制的人泡沫病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括如下步驟:
[0022](I)將 shRNAl、shRNA2、shRNA3 分別克隆到 shRNA 表達(dá)載體 pSUPER 上得至IjpSUPER-shRNAl、pSUPER-shRNA2、pSUPER_shRNA3。
[0023](2)分別以 pSUPER-shRNAl、pSUPER_shRNA2、pSUPER_shRNA3 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，引物為:
[0024]上游引物P1: 5 ’ -AGAGGTACCCGAACGCTGACGTCATCA-3，，
[0025]下游引物P2:5 ’ -GAGGATCCCTCGAGGTCGACGGTATC-3 ’。
[0026](3)通過KpnI和BamHI將⑵擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆到人泡沫病毒載體ρ Λ Φ上得到ρ Λ Φ-Hl-shRNAl、ρΔ Φ-Η1_8?ιΚΝΑ2 或 ρΛ Φ-Hl-shRNASo 其中，人泡沫病毒載體 ρΔ Φ通過下列文獻(xiàn)中闡述的材料方法制備得到(Trobridge G, Josephson N, VassilopoulosG, Mac J, Russell Dff.1mproved foamy virus vectors with minimal viral sequences.Mol Ther, 2002，6(3):321-8 ；
[0027]Trobridge GD,RusselI Dff.Helper-Free Foamy Virus Vectors.Hum GeneTher, 1998，9(17):2517-25)。
[0028]通過Luciferase、qPCR、ELISA和LDH分析表明本發(fā)明人泡沫病毒介導(dǎo)的siRNA對(duì)HIV-1NL4_3有明顯的抑制作用，能明顯抑制Hiv-lgag、pol、env基因的mRNA表達(dá)水平，能夠顯著降低HIV-lp24蛋白的表達(dá)水平，且無細(xì)胞毒性。
[0029]基于本發(fā)明研究，上述抑制HIV-1復(fù)制的siRNA、shRNA或人泡沫病毒表達(dá)載體可用于制備治療艾滋病的藥物。
[0030]一種治療艾滋病的藥物，包含上述抑制HIV-1復(fù)制的siRNA、shRNA或人泡沫病毒表達(dá)載體。
[0031]本發(fā)明提供了能夠抑制HIV-1復(fù)制siRNA、shRNA，成功構(gòu)建了無細(xì)胞毒性、能抑制HIV-1復(fù)制的人泡沫病毒表達(dá)載體，為艾滋病治療及預(yù)防研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1是shRNA轉(zhuǎn)錄生成siRNA的示意圖；該shRNA包含19nt的siRNA正義鏈,9nt的loop環(huán)，19nt的siRNA反義鏈和TTTTT終止信號(hào)，將其插入pSUPER載體Hl啟動(dòng)子下，就能有效表達(dá)出所需的siRNA。
[0033]圖2是將shRNA表達(dá)載體質(zhì)?；騪SUPER空載體分別與pNL4_3.Luc.R-E-、pRL_TK共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時(shí)后Luciferase (熒光素酶實(shí)驗(yàn))檢測(cè)shRNA對(duì)HIV_1NM_3基因抑制水平的分析圖；與空載體對(duì)照組比較，*#P〈0.005。
[0034]圖3是抑制HIV-1復(fù)制的shRNA的人泡沫病毒表達(dá)載體ρ Δ Φ-Hl-shRNA的構(gòu)建示意圖；將含有Hl啟動(dòng)子的shRNA基因片段克隆入人泡沫病毒載體ρΛ Φ中得到人泡沫病毒表達(dá)載體；圖中，CMV(cytomegalovirus,巨細(xì)胞病毒)是一種組成型啟動(dòng)子，能夠控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)程度。
[0035]圖4是輔助載體質(zhì)粒pCiGS、pCiPS、pCiES的示意圖;圖中，Gag、Pol、Env分別是泡沫病毒的衣殼蛋白，逆轉(zhuǎn)錄酶和病毒糖蛋白；CMV(cytomegalovirus,巨細(xì)胞病毒)是一種組成型啟動(dòng)子，能夠控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)程度；SpA(Simianvirus40poly adenylation signal, SV40poly (A))猿猴空泡病毒40多聚腺苷酸序列，對(duì)上游基因的轉(zhuǎn)錄水平起調(diào)控作用。
[0036]圖5是將人泡沫病毒表達(dá)載體和輔助載體質(zhì)粒及pNL4-3.Luc.R-E-, pRL-TK共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h后，Luciferase (熒光素酶實(shí)驗(yàn))檢測(cè)人泡沫病毒載體介導(dǎo)的shRNA對(duì)HIV-1NL4_3基因抑制水平的分析圖；與空載體對(duì)照組比較，*#P〈0.005。
[0037] 圖6是將人泡沫病毒載體介導(dǎo)的shRNA和輔助載體質(zhì)粒及pNL4_3.Luc.R-E-共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h后，qPCR檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中HIV-1gag(A)、pol (B)、env (C)基因mRNA水平的分析圖；與未轉(zhuǎn)染shRNA的對(duì)照組比較，*P〈0.05，#P〈0.01。
[0038]圖7是將人泡沫病毒載體介導(dǎo)的shRNA和輔助載體質(zhì)粒及pNL4_3-Luc共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h后，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))檢測(cè)胞內(nèi)HIV_lp24蛋白表達(dá)水平的分析圖；與空載體對(duì)照組比較，**P<0.01，*#P〈0.005。
[0039]圖8是將人泡沫病毒載體介導(dǎo)的shRNA和輔助載體質(zhì)粒及pNL4_3.Luc.R-E-共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h后，LDH(乳酸脫氫酶實(shí)驗(yàn))分析圖，表明人泡沫病毒載體介導(dǎo)的shRNA不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性；與空載體對(duì)照組比較，p>0.05,無顯著性差異(non significant, ns)。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0041]實(shí)施例1由shRNA轉(zhuǎn)錄生成siRNA的策略[0042]shRNA轉(zhuǎn)錄生成siRNA的示意圖如圖1所示。設(shè)計(jì)的寡核苷酸鏈每條均為60nt, 5’端和3’端分別包含BglII和HindIII酶切位點(diǎn)，便于與pSUPER載體連接。5’端19nt的序列(siRNA正義鏈)與靶基因同源，另一端19nt的序列(siRNA反義鏈)與其反向互補(bǔ)，其間由9nt的TTCAAGAGA間隔序列形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，末端加有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)TTTTT。具有上述結(jié)構(gòu)特征的寡核苷酸鏈經(jīng)退火、磷酸化后形成雙鏈DNA，然后定向插入經(jīng)相同酶切的pSUPER載體Hl啟動(dòng)子下。具有上述結(jié)構(gòu)的pSUPER載體能轉(zhuǎn)錄生成shRNA，后者經(jīng)Dicer酶切后成為siRNA而發(fā)揮抑制基因表達(dá)的功能。
[0043]實(shí)施例2針對(duì)HIV-1基因干涉位點(diǎn)的選擇與寡核苷酸的設(shè)計(jì)
[0044]根據(jù)shRNA的設(shè)計(jì)原則，以HIV-1 (GenBank編號(hào):AF324493) LTR基因序列作為siRNA的祀序列，設(shè)計(jì)了 3條shRNA oligo,設(shè)計(jì)的shRNA序列進(jìn)行BLAST (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/blast/)同源分析證實(shí)為HIV-1特異序列。設(shè)計(jì)得到的shRNA及其革巴向HIV-1nl4_3的位點(diǎn)如表1所示。
[0045]表1.shRNA序列及其靶向HIV_1NM_3的位點(diǎn)
【權(quán)利要求】
1.一種抑制HIV-1復(fù)制的siRNA，其特征在于:所述的抑制HIV-1復(fù)制的siRNA為siRNAl、siRNA2 或 siRNA3 ;其中， siRNAl 的正義鏈為:5’ -GCATCCGGAGTACTACAAA-3’， siRNAl 的反義鏈為:5’ -TTTGTAGTACTCCGGATGC-3’ ； siRNA2 的正義鏈為:5’ -GCCCTCAGATGCTACATAT-3’， siRNA2 的反義鏈為:5’ -ATATGTAGCATCTGAGGGC-3’ ； siRNA3 的正義鏈為:5’ -GCTTGCCTTGAGTGCTCAA-3’， siRNA3 的反義鏈為:5’ -TTGAGCACTCAAGGCAAGC-3’。
2.一種抑制HIV-1復(fù)制的shRNA，其特征在于:所述的抑制HIV-1復(fù)制的shRNA為shRNAl、shRNA2 或 shRNA3，它們都包含 19nt 的 siRNA 正義鏈，9nt 的 loop 環(huán)，19nt 的siRNA反義鏈和終止信號(hào)；shRNAl、shRNA2、shRNA3的siRNA正義鏈和siRNA反義鏈分別為權(quán)利要求1中siRNAl、siRNA2、siRNA3的正義鏈和反義鏈；所述的loop環(huán)的堿基序列為TTCAAGAGA ;所述的終止信號(hào)的堿基序列為TTTTT。
3.一種抑制HIV-1復(fù)制的人泡沫病毒表達(dá)載體，其特征在于:所述的抑制HIV-1復(fù)制的人泡沫病毒表達(dá)載體為能表達(dá)權(quán)利要求2中shRNAl、shRNA2或shRNA3的人泡沫病毒表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求3種所述的抑制HIV-1復(fù)制的人泡沫病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將權(quán)利要求2中的shRNAl、shRNA2、shRNA3分別克隆到shRNA表達(dá)載體pSUPER上得到 pSUPER-shRNAl、pSUPER-shRNA2、pSUPER-shRNA3 ； (2)分別以pSUPER-shRNAl、pSUPER-shRNA2、pSUPER-shRNA3 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，引物為: 上游引物 Pl:5’ -AGAGGTACCCGAACGCTGACGTCATCA-3’，
下游引物 P2:5’ -GAGGATCCCTCGAGGTCGACGGTATC-3’ ； (3)通過KpnI和BamHI將(2)擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆到人泡沫病毒載體ρΛ Φ上得到抑制HIV-1復(fù)制的人泡沫病毒表達(dá)載體ρ Λ Φ-Hl-shRNAl、ρ Δ (D-Hl-shRNA2或ρΔ Φ-Hl-shRNASo
5.權(quán)利要求1所述的siRNA、權(quán)利要求2所述的shRNA或權(quán)利要求3所述的人泡沫病毒表達(dá)載體在制備治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用。
6.一種治療艾滋病的藥物，其特征在于:包含權(quán)利要求1所述的siRNA、權(quán)利要求2所述的shRNA或權(quán)利要求3所述的人泡沫病毒表達(dá)載體。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103966219SQ201410225029
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】劉萬紅, 何小華, 彭碧文, 程青青, 董蘭蘭, 李治, 孫燕 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)