用于生物酶固定化的高性能的聚合物微球及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于生物酶固定化的高性能的聚合物微球及其制備方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地說，用帶有長支鏈結(jié)構(gòu)的多官能度聚合物預(yù)聚體作為活性中心，部分取代N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)劑，采用反相懸浮聚合技術(shù)制備了高機(jī)械強(qiáng)度和大孔結(jié)構(gòu)的表面含環(huán)氧基團(tuán)的多孔聚合物微球，將固定化時間從72小時縮短到12小時，提高了固定化酶的活性和操作穩(wěn)定性，具有較好的應(yīng)用前景。
【專利說明】用于生物酶固定化的高性能的聚合物微球及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于生物酶固定化的高性能的聚合物微球及其制備方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地說，采用反相懸浮聚合技術(shù)制備了機(jī)械強(qiáng)度高和酶固定化時間短的表面含環(huán)氧基團(tuán)的多孔聚合物微球。
【背景技術(shù)】
[0002]青霉素酸化酶(E.C.3.5.1.11,Penicillin G acylase,簡稱 PGA)是半合成 β-內(nèi)酰胺類抗生素生產(chǎn)中最關(guān)鍵的酶，它既能催化青霉素及其擴(kuò)環(huán)酸水解去側(cè)鏈，生產(chǎn)半合成β -內(nèi)酰胺類抗生素的重要中間體6-氨基青霉烷酸(6-ΑΡΑ )和7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)，又能催化6-ΑΡΑ和7-ADCA與側(cè)鏈縮合，生產(chǎn)多種半合成β -內(nèi)酰胺類抗生素(如 Ampicillin, Amoxicillin, Cephalexin 和 Cefadroxil 等)。但是直接將游離酶用于催化反應(yīng)中存在許多不足，如在高溫、強(qiáng)酸強(qiáng)堿和有機(jī)溶劑中不穩(wěn)定，容易喪失催化活性；游離酶回收困難，經(jīng)濟(jì)上不合理，還造成產(chǎn)物難以分離提純，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量；生產(chǎn)過程難以實現(xiàn)連續(xù)操作，只能一次性間歇操作等。固定化酶克服了游離酶的上述不足，不僅保持了游離酶特有的催化特性 ，還提高了操作穩(wěn)定性，生產(chǎn)過程易于實現(xiàn)連續(xù)操作，反應(yīng)完成后易于與產(chǎn)物分離且可以重復(fù)使用，所得的產(chǎn)品純度高，生產(chǎn)成本低。因此，酶的固定化一直是催化化學(xué)、生物化學(xué)和材料化學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其中高性能的固定化載體的合成技術(shù)是關(guān)鍵。
[0003]含環(huán)氧基團(tuán)的聚合物載體，載體表面的環(huán)氧基團(tuán)能夠在室溫條件下開環(huán)與生物酶分子中的胺基反應(yīng)形成共價鍵，從而在溫和條件下實現(xiàn)生物酶的固定化。這種借助于環(huán)氧基團(tuán)使生物酶固定于載體表面，不僅操作條件溫和簡便，而且固定化過程對酶活損失也很小，因而，非常適合于固定化酶的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0004]我們(中國發(fā)明專利CN1408859A)用反相懸浮聚合技術(shù)合成了一系列用于青霉素?；腹潭ɑ暮h(huán)氧基團(tuán)的聚合物載體，但聚合過程中以甲基丙烯酸縮水甘油酯為功能性單體，以Span-60和硬脂酸鈣為復(fù)合分散劑，存在著聚合物載體在后處理過程中硬脂酸鈣不易被洗滌除去和在重復(fù)使用過程中載體易破碎等缺點(diǎn)。然后我們(催化學(xué)報，2010，31(5): 586-590)以Span-60和Tween-20為復(fù)合分散劑，替代原有的硬脂酸鈣復(fù)合分散劑，減少后處理過程中所需的時間和溶劑用量；同時用分子鏈柔性較好的烯丙基縮水甘油醚部分替代剛性的甲基丙烯酸縮水甘油酯，提高聚合物載體的機(jī)械強(qiáng)度。但是聚合物載體的合成條件有待繼續(xù)優(yōu)化，進(jìn)一步改善聚合物載體的孔結(jié)構(gòu)和機(jī)械強(qiáng)度，縮短酶固定化時間，提高固定化酶的綜合性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種機(jī)械強(qiáng)度高和酶固定化時間短的表面含環(huán)氧基團(tuán)的多孔聚合物微球的制備方法，使以該聚合物微球為載體制備的固定化青霉素?；妇哂休^高的活性、操作穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性。[0006]所述的含環(huán)氧基團(tuán)的多孔聚合物微球，采用改進(jìn)的反相懸浮聚合技術(shù)進(jìn)行制備，具體包括如下步驟:
將帶有長支鏈結(jié)構(gòu)的多官能度聚合物預(yù)聚體、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸縮水甘油酯和烯丙基縮水甘油醚等聚合物單體以及偶氮二異丁腈引發(fā)劑加入到甲酰胺溶液中，然后加入到溶解有Span60和TWeen20復(fù)合分散劑的由正庚烷和四氯乙烯組成的混合溶劑中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于45飛5°C進(jìn)行反相懸浮聚合反應(yīng)3飛小時，反應(yīng)結(jié)束后用乙醇洗滌，正庚烷浸泡，5(T70°C真空干燥8~16小時，得到聚合物微球。
[0007]所述的帶有長支鏈結(jié)構(gòu)的多官能度聚合物預(yù)聚體為聚醚丙烯酸酯預(yù)聚體(三羥甲基丙烷-環(huán)氧乙烷-丙烯酸共聚物預(yù)聚體)和聚氨酯丙烯酸酯預(yù)聚體(雙季戊四醇-異佛爾酮二異氰酸酯-丙烯酸羥乙酯共聚物預(yù)聚體)的一種或二種，多官能度聚合物預(yù)聚體與N, N、亞甲基雙丙烯酰胺的重量比為0.05、.3。
[0008]所述的含環(huán)氧基團(tuán)的多孔聚合物微球，可用于青霉素?；?、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶、胰蛋白酶或淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特別適用于青霉素酰化酶的固定化。
[0009]青霉素?；傅墓潭ɑ?稱取0.30克聚合物微球置于25毫升錐形瓶中，加入0.93毫升青霉素?；溉芤翰⒂胮H=7.5的lmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋至5毫升，在28°C的水浴搖床中固定12小時后，用pH=7.5的0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌抽濾。
[0010]固定化青霉素?；傅幕钚院筒僮鞣€(wěn)定性測定方法采用文獻(xiàn)(催化學(xué)報，2010，31(5): 586-590)報道的測定方法。 [0011]本發(fā)明的關(guān)鍵在于使用帶有長支鏈結(jié)構(gòu)的多官能度聚合物預(yù)聚體作為活性中心，部分取代原有的N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)劑，獲得了高機(jī)械強(qiáng)度和大孔結(jié)構(gòu)的含環(huán)氧基團(tuán)的多孔聚合物微球，將固定化時間從72小時縮短到12小時，提高了固定化酶的活性和操作穩(wěn)定性。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但絕不是限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013]對比例
將90毫升正庚烷與30毫升四氯乙烯混合后加入裝有溫度計、冷凝管、導(dǎo)氣管和攪拌槳的反應(yīng)釜中，向其中加入0.29克Span-60和0.78克Tween-20后，加熱至55°C。在氮?dú)獗Ｗo(hù)和強(qiáng)烈攪拌下，再加入17.5毫升溶有3.9克N，K -亞甲基雙丙烯酰胺、0.54克甲基丙烯酰胺、1.35毫升甲基丙烯酸縮水甘油酯、1.35毫升烯丙基縮水甘油醚和0.55克偶氮二異丁腈引發(fā)劑的甲酰胺溶液。在55°C聚合反應(yīng)4小時后，停止攪拌，冷卻至室溫，通過200目分樣篩過篩，得到聚合物微球，所制得的聚合物微球依次經(jīng)100毫升乙醇浸泡洗滌48小時、100毫升正庚烷浸泡洗滌48小時、60°C真空干燥12小時后即可使用。將上述聚合物微球用于青霉素?；傅墓潭ɑ?，固定化時間為72小時，得到的固定化酶初始活性為320U/g(濕)，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 90%的初始活性，但在pH=8.0的磷酸鹽緩沖溶液中以280rpm的轉(zhuǎn)速攪拌6小時聚合物微球就已大部分破碎。
[0014]實施例1
將90毫升正庚烷與30毫升四氯乙烯混合后加入裝有溫度計、冷凝管、導(dǎo)氣管和攪拌槳的反應(yīng)釜中，向其中加入0.29克Span-60和0.78克Tween-20后，加熱至55°C。在氮?dú)獗Ｗo(hù)和強(qiáng)烈攪拌下，再加入17.5毫升溶有0.3克聚醚丙烯酸酯預(yù)聚體(三羥甲基丙烷-環(huán)氧乙烷-丙烯酸共聚物預(yù)聚體)、3.6克N，K-亞甲基雙丙烯酰胺、0.54克甲基丙烯酰胺、1.35毫升甲基丙烯酸縮水甘油酯、1.35毫升烯丙基縮水甘油醚和0.55克偶氮二異丁腈引發(fā)劑的甲酰胺溶液。在55°C聚合反應(yīng)4小時后，停止攪拌，冷卻至室溫，通過200目分樣篩過篩，得到聚合物微球，所制得的聚合物微球依次經(jīng)100毫升乙醇攪拌洗滌I小時、100毫升正庚烷攪拌洗滌I小時、60°C真空干燥12小時后即可使用。將上述聚合物微球用于青霉素?；傅墓潭ɑ?，固定化時間為12小時，得到的固定化酶初始活性為346U/g(濕)，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 100%的初始活性，但在pH=8.0的磷酸鹽緩沖溶液中以280rpm的轉(zhuǎn)速攪拌12小時聚合物微球才開始破碎。
[0015]實施例2
將聚醚丙烯酸酯預(yù)聚體0.3克改為0.2克，N，N' -亞甲基雙丙烯酰胺3.6克改為3.7克，其他聚合物微球的合成條件與實施例1相同。將合成的聚合物微球用于青霉素?；傅墓潭ɑ潭ɑ瘯r間為12小時，得到的固定化酶初始活性為337U/g(濕)，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 100%的初始活性，但在pH=8.0的磷酸鹽緩沖溶液中以280rpm的轉(zhuǎn)速攪拌10小時聚合物微球才開始破碎。
[0016]實施例3
將聚醚丙烯酸酯預(yù)聚體0.3克改為0.8克，N，N' -亞甲基雙丙烯酰胺3.6克改為3.1克，其他聚合物微球的合成條件與實施例1相同。將合成的聚合物微球用于青霉素酰化酶的固定化，固定化時間為12小時，得到的固定化酶初始活性為378U/g(濕)，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 89%的初始活性，但在pH=8.0的磷酸鹽緩沖溶液中以280rpm的轉(zhuǎn)速攪拌7小時聚合物微球才開始破碎。
[0017]實施例4
將0.3克聚醚丙烯酸酯預(yù)聚體改為0.5克聚氨酯丙烯酸酯預(yù)聚體(雙季戊四醇-異佛爾酮二異氰酸酯-丙烯酸羥乙酯共聚物預(yù)聚體)，N，f-亞甲基雙丙烯酰胺3.6克改為3.4克，其他聚合物微球的合成條件與實施例1相同。將合成的聚合物微球用于青霉素酰化酶的固定化，固定化時間為12小時，得到的固定化酶初始活性為268U/g(濕)，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 92%的初始活性，但在pH=8.0的磷酸鹽緩沖溶液中以280rpm的轉(zhuǎn)速攪拌16小時聚合物微球才開始破碎。
[0018]實施例5
將0.3克聚醚丙烯酸酯預(yù)聚體改為0.2克聚氨酯丙烯酸酯預(yù)聚體，N, N、亞甲基雙丙烯酰胺3.6克改為3.7克，其他聚合物微球的合成條件與實施例1相同。將合成的聚合物微球用于青霉素?；傅墓潭ɑ?，固定化時間為12小時，得到的固定化酶初始活性為295U/g (濕)，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 95%的初始活性，但在pH=8.0的磷酸鹽緩沖溶液中以280rpm的轉(zhuǎn)速攪拌11小時聚合物微球才開始破碎。
[0019]實施例6
將0.3克聚醚丙烯酸酯預(yù)聚體改為0.8克聚氨酯丙烯酸酯預(yù)聚體，N, -亞甲基雙丙烯酰胺3.6克改為3.1克，其他聚合物微球的合成條件與實施例1相同。將合成的聚合物微球用于青霉素?；傅墓潭ɑ?，固定化時間為12小時，得到的固定化酶初始活性為198U/g (濕)，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 84%的初始活性，但在pH=8.0的磷酸鹽緩沖溶液中以280rpm的轉(zhuǎn)速 攪拌25小時聚合物微球才開始破碎。
【權(quán)利要求】
1.一種用于生物酶固定化的聚合物微球的制備方法，其特征在于，用帶有長支鏈結(jié)構(gòu)的多官能度聚合物預(yù)聚體作為活性中心，部分取代N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)劑，采用反相懸浮聚合技術(shù)制備了機(jī)械強(qiáng)度高和酶固定化時間短的表面含環(huán)氧基團(tuán)的多孔聚合物微球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生物酶固定化的聚合物微球的制備方法，其特征在于，為改進(jìn)的反相懸浮聚合技術(shù)，具體包括如下步驟: 將帶有長支鏈結(jié)構(gòu)的多官能度聚合物預(yù)聚體、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸縮水甘油酯和烯丙基縮水甘油醚等聚合物單體以及偶氮二異丁腈引發(fā)劑加入到甲酰胺溶液中，然后加入到溶解有Span60和TWeen20復(fù)合分散劑的由正庚烷和四氯乙烯組成的混合溶劑中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于45飛5°C進(jìn)行反相懸浮聚合反應(yīng)3飛小時，反應(yīng)結(jié)束后用乙醇洗滌，正庚烷浸泡，5(T70°C真空干燥8~16小時，得到聚合物微球。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的用于生物酶固定化的聚合物微球的制備方法，其特征在于，所述的帶有長支鏈結(jié)構(gòu)的多官能度聚合物預(yù)聚體為聚醚丙烯酸酯預(yù)聚體(三羥甲基丙烷-環(huán)氧乙烷-丙烯酸共聚物預(yù)聚體)和聚氨酯丙烯酸酯預(yù)聚體(雙季戊四醇-異佛爾酮二異氰酸酯-丙烯酸羥乙酯共聚物預(yù)聚體)的一種或二種，多官能度聚合物預(yù)聚體與N，N、亞甲基雙丙烯酰胺的重量比為0.05、.3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的用于生物酶固定化的聚合物微球的制備方法，其特征在于，所述的含環(huán)氧基團(tuán)的多孔聚 合物微球，可用于青霉素酰化酶、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶、胰蛋白酶或淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特別適用于青霉素酰化酶的固定化。
【文檔編號】C12N11/08GK103952392SQ201410210936
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月20日
【發(fā)明者】郭楊龍, 朱小麗, 盧冠忠, 陳喬健, 詹望成, 王筠松, 郭耘, 王麗 申請人:華東理工大學(xué)