一種熱穩(wěn)定性提高的堿性果膠酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熱穩(wěn)定性提高的堿性果膠酶突變體，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明將堿性果膠酶第229位的絲氨酸S點(diǎn)突變?yōu)橘嚢彼酜。相比突變前，突變體在30℃、50℃和55℃下的熱穩(wěn)定性明顯提高。此外，突變體的最適反應(yīng)溫度提高了5℃，在55℃下的半衰期是突變前的2.10倍，其Km、Vmax、kcat和kcat/Km等都有改善。本發(fā)明提供的堿性果膠酶更加適合工業(yè)化生產(chǎn)需求，滿足社會(huì)生產(chǎn)的要求。
【專利說明】一種熱穩(wěn)定性提高的堿性果膠酶突變體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種熱穩(wěn)定性提高的堿性果膠酶突變體，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]堿性果膠酶(E.C.4.2.2.2,簡稱PGL)，全稱聚半乳糖醛酸裂解酶，在堿性條件下具有高活性，可以利用反式消去作用切斷聚乳糖醛酸的α-1，4-糖苷鍵，將果膠質(zhì)分解為不飽和的寡聚半乳糖醛酸。該酶廣泛存在于細(xì)菌、酵母菌、真菌、植物以及和某些寄生線蟲。不同來源的堿性果膠酶同源性差異較大。堿性果膠酶廣泛應(yīng)用于食品、紡織、造紙、環(huán)境、生物技術(shù)等各個(gè)領(lǐng)域，在茶和咖啡發(fā)酵、紡織和植物纖維加工、油提取、含果膠工業(yè)廢水處理等發(fā)揮巨大作用。
[0003]在棉纖維初生細(xì)胞壁的最表面含有很多伴生雜質(zhì)，如:果膠質(zhì)、蠟質(zhì)、含氮物質(zhì)以及蛋白質(zhì)等非纖維素類物質(zhì)，互相包結(jié)成為復(fù)雜龐大的疏水網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。紡織工業(yè)中包含精煉步驟，其目的就是去除棉纖維上的雜質(zhì)，提高棉織物的吸濕功能性，再進(jìn)行后續(xù)加工。傳統(tǒng)的化學(xué)紡織精煉方法即熱堿法，其需要消耗大量的化學(xué)品與水資源，環(huán)境污染嚴(yán)重，據(jù)統(tǒng)計(jì)，印染過程中約70%的廢水是在這個(gè)步驟中產(chǎn)生的。除此之外，熱堿處理將對(duì)纖維造成嚴(yán)重?fù)p傷，機(jī)械強(qiáng)度將大幅下降。
[0004]近十幾年來，隨著分子生物學(xué)與工業(yè)微生物研究的迅猛快速發(fā)展，研究者開始采用基因工程手段構(gòu)建重組菌，以期實(shí)現(xiàn)堿性果膠酶的過量重組表達(dá)。目前，已相繼出現(xiàn)了利用 Escherichia col1、Bacillus subtilis 和 Pichia pastoris 等作為宿主表達(dá)不同來源果膠酶基因的報(bào)道?，F(xiàn)在對(duì)堿性果膠酶的研究主要集中于合成堿性果膠酶工程菌與發(fā)酵過程控制。盡管PGL的表達(dá)量很高，但是酶的催化效率耐熱性等酶學(xué)特性還有待進(jìn)一步改進(jìn)。我國對(duì)堿性果膠酶的研究主要集中在菌種選育、發(fā)酵工藝和應(yīng)用工藝的改良方面，尚缺效價(jià)很高的商品堿性果膠酶，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)工業(yè)化鋪墊，這方面的研究不容忽視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種熱穩(wěn)定性提高的堿性果膠酶突變體。所述突變體是以氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的堿性果膠酶(野生型)為基礎(chǔ)，將第229位的絲氨酸S點(diǎn)突變?yōu)橘嚢彼酜。
[0006]本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供構(gòu)建所述堿性果膠酶突變體的方法，是通過設(shè)計(jì)引物對(duì)編碼堿性果膠酶的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變后表達(dá)。
[0007]所述構(gòu)建方法，優(yōu)選以質(zhì)粒pET-20b(+)_pgl為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行突變并將突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli JM109進(jìn)行擴(kuò)增，然后以E.coli BL21 (DE3)表達(dá)含突變基因的重組質(zhì)粒，得到熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的堿性果膠酶突變體。
[0008]所述pET_20b (+)-pgl 的構(gòu)建方法參見文獻(xiàn)！Overproduction of alkalinepolygalacturonate lyase in recombinant Escherichia coli by a two-stage glycerolfeeding approach.2011, Shuying Fang et al.Volumel02，Issue22，pl0671 - 10678。[0009]所述用于定點(diǎn)突變的引物是:
[0010]pglS229K primerl:5’-GACGGCCAAACGGATGCGAAAAACGGCGCTAACTATATC-3’
[0011]pglS229K primer2:5’-GATATAGTTAGCGCCGTTTTTCGCATCCGTTTGGCCGTC-3’ 。
[0012]本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供應(yīng)用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)所述堿性果膠酶突變體的方法，是將含有編碼突變堿性果膠酶的基因的重組菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)-pglS229K)活化培養(yǎng)后接種到含有IOOyg mL—1氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為50mL/500mL，于37°C，200r mirT1培養(yǎng)；菌體生長到OD6tltl = 0.6，加入終濃度0.4mMIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)將溫度調(diào)整為30°C，誘導(dǎo)發(fā)酵48h。
[0013]所述活化培養(yǎng)是將重組菌Ε.coli BL21(DE3) (pET-20b(+)-pglS229K)接種于含有100μ gmL—1氨芐青霉素的種子培養(yǎng)基中，裝液量為20mL/250mL，培養(yǎng)溫度37°C，200rpmmirT1搖床上振蕩培養(yǎng)IOh。
[0014]所述種子培養(yǎng)基組成(g/L):酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCllO，葡萄糖20，pH7.0。
[0015]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成:酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，K2HP0472mmolΙΛ KH2P0417mmol L'
[0016]本發(fā)明通過定點(diǎn)突變改造堿性果膠酶基因，使所編碼的PGL熱穩(wěn)定性增強(qiáng)；相比突變前，30V保溫24h后，突變體的殘留酶活提高了 42.29%, 50V保溫2h后，突變體的殘留酶活是突變前的2.44倍，55°C下保溫lh，突變體的仍有51.73%的殘留酶活，是突變前的2.40倍。此外，突變體的最適反應(yīng)溫度提高了 5°C，在55°C下的半衰期是突變前的2.10倍，其Km和kMt/Km等都有改善。本發(fā)明提供的堿性果膠酶更加適合工業(yè)化生產(chǎn)需求，滿足社會(huì)生產(chǎn)的要求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明構(gòu)建的突變株以及原始菌株不同溫度下的穩(wěn)定性，WT:突變前堿性果膠酶；S229K:突變后堿性果膠酶。
【具體實(shí)施方式】
[0018]堿性果膠酶酶活力檢測(cè):取一定量發(fā)酵液，8000rpm離心10min，胞外堿性果膠酶位于發(fā)酵上清液之中。堿性果膠酶反應(yīng)體系為:酶稀釋液20 μ L，含0.2 % PGA的甘氨酸-NaOH緩沖液(0.2mol ?Λθ.44mmol L—1的CaCl2, pH9.4) 2mL，無活性的酶液為空白對(duì)照。堿性果膠酶反應(yīng)條件為:45°C水浴15min，使用3mL磷酸溶液(0.03mol L-1)終止反應(yīng)，235nm處測(cè)定反應(yīng)物吸光度值。
[0019]堿性果膠酶酶活單位定義為:I分鐘裂解聚半乳糖醛酸產(chǎn)生I μ mol不飽和聚半乳糖醛酸所對(duì)應(yīng)酶量。堿性果膠酶酶活計(jì)算方法:
[0020](OD235 XlO6X體系體積X酶液稀釋倍數(shù))/(103 X比色杯厚度X 4600 X酶反應(yīng)線性范圍內(nèi)的酶促反應(yīng)時(shí)間X酶液體積) [0021 ] 堿性果膠酶純化條件:A液:甘氨酸-NaOH，pH7.5 ；B液:甘氨酸_Na0H，2M硫酸銨，pH7.5 ；5mL 疏水柱[HiTrap Phenvl (high sub) FF], 3mL/min, 30% B 液洗脫得到目的蛋白；30kDa millipore超濾離心管濃縮得到SDS-PAGE電泳純。 [0022] 堿性果膠酶熱穩(wěn)定性檢測(cè):在不同溫度下按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，以處理前酶活定為100%.，將酶液分別在30°C保溫24h，40°C保溫2h，50°C保溫2h，55°C下保溫lh，利用冰浴迅速冷卻后，按上述方法測(cè)殘余酶活力，考察其熱穩(wěn)定性。
[0023]堿性果膠酶Km、Vmax檢測(cè):在0.05-2g/L不等的底物濃度下測(cè)定，由GraphPadPrism5預(yù)測(cè)得到。
[0024]實(shí)施例1突變表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及重組枯草芽孢桿菌的獲得
[0025]1、以pET_20b (+) -pgl質(zhì)粒為模板構(gòu)建突變表達(dá)載體
[0026]編碼野生型堿性果膠酶及由21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，野生型成熟堿性果膠酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。通過比對(duì)耐熱果膠酶序列:Bacillus Iicheniformis 的 CAD56882,來自 Bacillus sp.strain P-4-N 的BAA96478,以及來自 Thermotoga maritima MSB82 的 AAD35518，最適溫度分別為 69°C，70°C和90°C。結(jié)合堿性果膠酶的三維結(jié)構(gòu)，推測(cè)229位的絲氨酸S對(duì)堿性果膠酶的熱穩(wěn)定性有較大影響，設(shè)計(jì)突變實(shí)驗(yàn)，將229位的絲氨酸突變成其他三個(gè)耐熱序列的相同氨基酸一賴氨酸K。
[0027]以pET-20b(+)-pgl質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物將第229位的絲氨酸S變?yōu)橘嚢彼酜。用于定點(diǎn)突變的引物:
[0028]pglS229K primerl:5’-GACGGCCAAACGGATGCGAAAAACGGCGCTAACTATATC-3’
[0029]pglS229K primer2:5’-GATATAGTTAGCGCCGTTTTTCGCATCCGTTTGGCCGTC-3’
[0030]PCR反應(yīng)體系如下:(引物濃度為2O μ mol/L)
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種熱穩(wěn)定性提高的堿性果膠酶突變體，其特征在于，是將氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示的堿性果膠酶的第229位絲氨酸S點(diǎn)突變?yōu)橘嚢彼酜。
2.編碼權(quán)利要求1所述突變體的基因。
3.攜帶權(quán)利要求2所述基因的載體或細(xì)胞。
4.一種獲得權(quán)利要求1所述堿性果膠酶突變體的方法，是通過設(shè)計(jì)引物對(duì)編碼堿性果膠酶的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變后表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，是以質(zhì)粒pET-20b(+)-pgl為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行突變并將突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli JM109進(jìn)行擴(kuò)增，然后以E.coli BL21(DE3)表達(dá)含突變基因的重組質(zhì)粒，得到熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的堿性果膠酶突變體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，用于定點(diǎn)突變的引物是:
pglS229K primerl:5’-GACGGCCAAACGGATGCGAAAAACGGCGCTAACTATATC-3’
pglS229K primer2:5’-GATATAGTTAGCGCCGTTTTTCGCATCCGTTTGGCCGTC-3’ 。
7.應(yīng)用 基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)權(quán)利要求1所述堿性果膠酶突變體的方法，其特征在于，是將含有突變堿性果膠酶基因的重組菌活化培養(yǎng)后接種到含有100 μ g mL-1氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37°C，200r mirT1培養(yǎng)；菌體生長到OD6tltl = 0.6，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)將溫度調(diào)整為30°C，誘導(dǎo)發(fā)酵48h。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述活化培養(yǎng)是將重組菌E.coliBL21(DE3) (pET-20b(+)-pglS229K)接種于含有100 μ g mL—1氨芐青霉素的種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37°C，200rpm搖床上振蕩培養(yǎng)IOh。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基組成:酵母粉5g/L，胰蛋白胨 10g/L，NaC110g/L，葡萄糖 20g/L，ρΗ7.0。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成:酵母粉24g/L，胰蛋白胨 12g/L，甘油 5g/L，K2HP0472mmol L—1，KH2PO417mmoI L—1。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103981167SQ201410191602
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 堵國成, 劉松, 汪明星 申請(qǐng)人:江南大學(xué)