青花菜品種臺綠1號雜交種的快速鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種能夠快速、準(zhǔn)確、高效地對青花菜品種‘臺綠1號’雜交種進(jìn)行分子鑒定的方法，取待測樣品提取基因組DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR引物為：5’-TCTCTCTCTCTCTCTCN-3’，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳成像分析，以同時(shí)擴(kuò)增出約800bp和約600bp的條帶，判斷待測樣品為‘臺綠1號’雜交種單株；并可計(jì)算待測樣本遺傳純度（雜交種遺傳純度=真雜交種株數(shù)÷待測樣品株數(shù)×100%）。本發(fā)明使用的ISSR引物TNISSR15鑒定青花菜‘臺綠1號’雜交種純度的準(zhǔn)確性高，與田間鑒定結(jié)果相符度達(dá)99%，結(jié)果可靠；鑒定在10天以內(nèi)即可完成，避免了田間種植鑒定的繁瑣程序，節(jié)約了勞動力和土地資源，鑒定成本降低；能在制種當(dāng)年確定種子遺傳純度，便于種子定級與收購，提高了鑒定效率。
【專利說明】青花菜品種臺綠1號雜交種的快速鑒定方法
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種青花菜品種‘臺綠I號’雜交種的快速鑒定方法。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]青花菜(Brassica oleracea var.1talica),又名綠花菜、西蘭花等,是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的一個(gè)變種。其食用部分是帶有花蕾群的肥嫩花莖，營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，而且具有抗癌和抗氧化功效，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。近年來我國青花菜栽培面積逐年增加，對優(yōu)勢青花菜品種的需求也不斷加大，利用雜種優(yōu)勢生產(chǎn)青花菜F1雜交種已經(jīng)成為一種趨勢。但是，在雜交種制種過程中母本自交，人們操作過程的相互傳粉，鳥類、蜜蜂等造成的串粉都會形成假雜種，再加上青花菜雜交種種粒小且品種之間差異小，在收獲、脫粒、加工、貯藏、包裝、銷售的過程中也容易造成混雜。目前育種者主要依靠常規(guī)大田種植對青花菜雜交種進(jìn)行鑒定，但其周期長且費(fèi)工、占地，易受季節(jié)限制，對當(dāng)年生產(chǎn)的雜交種純度難以確定，對因環(huán)境條件影響所引起的變異與本品種遺傳所產(chǎn)生的變異區(qū)分較困難，不適應(yīng)當(dāng)前生產(chǎn)的需要。植物品種之間的差異歸根結(jié)底是基因的差異，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段從遺傳基礎(chǔ)上鑒定雜交種的真?zhèn)胃臃鲜袌鲂枨蟆?br> [0003]ISSR (Inter-simple sequence repeats)是一種可在沒有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的情況下開展的新型DNA分子標(biāo)記技術(shù)，它利用生物基因組中廣泛存在的簡單重復(fù)序列SSR (Simple Sequence Repeat)設(shè)計(jì)引物,通過PCR方法擴(kuò)增基因組中兩個(gè)相距較近、方向相反的SSR序列之間的區(qū)段，所獲得的多個(gè)條帶通過瓊脂糖凝膠電泳或者聚丙烯酰胺凝膠電泳得以分辨，無需預(yù)先克隆和測序。與SSR相比，ISSR在不同物種之間的通用性更強(qiáng)且引物開發(fā)更加容易，與RAH)相比，穩(wěn)定性更高，是一種操作簡單、成本低廉的檢測手段，目前研究者已經(jīng)利用ISSR進(jìn)行水稻、黃瓜等多種作物的雜交種純度鑒定，但是將ISSR應(yīng)用于青花菜雜交種遺傳純度鑒定的卻未見報(bào)道。
[0004]臺綠1號’【浙(非)審蔬2011004】是臺州市農(nóng)科院利用材料‘Br60-2-2-l_2’和‘Β19-10-1-2-配組育成的中晚熟品種，該品種生長勢較強(qiáng)，側(cè)枝較少，花球高圓且緊實(shí)，球面圓整，蕾粒中細(xì)均勻，花球外觀商品性好，采收期長，適宜于可做保鮮和速凍加工，適合在臺州、寧波及蕭山等青花菜重要產(chǎn)區(qū)種植，具有較好的推廣前景。為保證‘臺綠I號’的種子純度，規(guī)范青花菜雜交種種子產(chǎn)業(yè)，保證農(nóng)業(yè)用種質(zhì)量，建立一套準(zhǔn)確、快速、高效、低成本、易推廣的青花菜雜交種遺傳鑒定體系具有重要意義。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提出一種能夠快速、準(zhǔn)確、高效地對青花菜品種‘臺綠I號’雜交種進(jìn)行分子鑒定的方法，從而大大提高青花菜商品種的鑒定效率。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是: [0007]青花菜品種‘臺綠I號’雜交種的快速鑒定方法，所述方法包括:
[0008](I)待測青花菜樣品的基因組DNA的提?。豢刹捎肅TAB簡易[0009]提取法快速提取青花菜幼苗基因組DNA ；
[0010](2) PCR 擴(kuò)增；
[0011]擴(kuò)增引物(TNISSR15)序列如下:
[0012]5， -TCTCTCTCTCTCTCTCN-3，；
[0013]PCR反應(yīng)體系每15 μ L組成如下:待測樣品基因組DNAlOng，10 μ M引物0.85 μ L，25mM Mg2+0.6 μ L, IOmM dNTP0.3 μ L，5U.μ L-1Taq DNA 聚合酶 0.15 μ L，10 X buffer 1.5 μ L,無菌重蒸水補(bǔ)齊至15 μ L ;
[0014]PCR反應(yīng)條件如下:94°C預(yù)變性4min，94°C變性0.5min，51°C退火lmin，72°C延伸2min，35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 10min，4°C保存；
[0015](3)結(jié)果分析:取PCR產(chǎn)物與含8% (v/v) GelRad核酸染料的loading Buffer混合后上樣于2% (w/v)瓊脂糖凝膠上，電泳分離后進(jìn)行凝膠成像，以同時(shí)擴(kuò)增出約SOObp和約600bp的條帶，判斷待測樣品為‘臺綠I號’雜交種單株；否則不屬于臺綠I號’雜交種。
[0016]所述方法可進(jìn)一步包括雜交種純度計(jì)算步驟:根據(jù)步驟(3)檢測結(jié)果計(jì)算待測青花菜樣品的雜交種遺傳純度，所述雜交種遺傳純度=真雜交種株數(shù)+待測樣品株數(shù) X 100%O
[0017]具體的，所述步驟(1)方法如下:
[0018]①苗期取青花菜的幼嫩葉片0.2~0.5g，剪成小塊，裝入離心管中，同時(shí)每只離心管加入I粒不銹鋼鋼珠，蓋好離心管蓋后放入裝有液氮的泡沫盒中靜置10~15min，倒出液氮，快速用力搖晃泡沫盒5~IOmin ；
[0019]②打開離心管蓋倒出鋼珠，向離心管中加入CTAB裂解液，65±2°C水浴20~30min,所述 CTAB 裂解液組成如下:CTAB2% (w/v), EDTA20mmol/L, NaCl1.4mol/L,Tris50mmol/L, pH8.0 ；
[0020]③步驟②所得液體加入等體積的氯仿:異戊醇體積比24:1的混合液，輕輕搖晃后離心；
[0021]④取上清，加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇(即預(yù)冷異丙醇體積為上清體積的2/3)，混勻，-20°C冰箱靜置120min，離心；
[0022]⑤棄上清，取沉淀DNA用70% (v/v)乙醇洗滌，干燥后加入ddH20-20°C保存?zhèn)溆?。[0023]采用本發(fā)明引物在母本材料中能夠擴(kuò)增出一條約800bp的特異標(biāo)記，在父本材料中能擴(kuò)增出一條約600bp的父本特異標(biāo)記。只有同時(shí)具有父母本特異性條帶的單株才為真正的‘臺綠I號’雜交種單株，缺少其中的任意一條帶記為假雜種。并可根據(jù)電泳結(jié)果分別確定真雜交種與假雜交種單株數(shù)量，計(jì)算待測雜交種的遺傳純度。
[0024]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:
[0025](I)本發(fā)明使用的ISSR引物TNISSR15鑒定青花菜‘臺綠I號’雜交種純度的準(zhǔn)確性高，與田間鑒定結(jié)果相符度達(dá)99%，結(jié)果可靠；鑒定在10天以內(nèi)即可完成，避免了田間種植鑒定的繁瑣程序，節(jié)約了勞動力和土地資源，鑒定成本降低；能在制種當(dāng)年確定雜交種遺傳純度，便于種子定級與收購，提高了鑒定效率。
[0026](2)本發(fā)明對DNA提取、凝膠電泳等試劑使用與實(shí)驗(yàn)操作都做了相應(yīng)的簡化處理，降低了整個(gè)操作的繁瑣性。比如，在基因組DNA提取過程中，采用鋼珠-液氮磨樣法在短時(shí)間之內(nèi)即達(dá)到研磨的效果，節(jié)約了人力、物力和時(shí)間，更適合大規(guī)模批量樣本的處理。在電泳階段，采用將GelRad核酸染料與Loading Buffer混合后再加入樣品中，與常用的將核酸染料加入凝膠中或者電泳結(jié)束后利用含有核酸燃料的緩沖液浸泡等方法相比，GelRad核酸燃料使用量降低了 35%以上，節(jié)約了成本。本發(fā)明步驟簡單，適合在‘臺綠一號’的制種、繁種、經(jīng)銷企業(yè)推廣中應(yīng)用。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為利用引物TNISSR15擴(kuò)增的‘臺綠I號’親本、雜交一代及假雜種的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0028]其中，M為marker, I為父本,2為母本;3_16為‘臺綠I號’雜交一代，17-24為人為混入其中的其它青花菜材料。
[0029]圖2為以2013年大田制種并隨機(jī)混入少量假雜種的‘臺綠I號’雜交種為待測樣品雜交種鑒定的部分樣品瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0030]其中，M為marker，23為母本，24為父本；1_22、25_48為待測樣品。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0032]實(shí)施例1:
[0033]以‘臺綠I號’親本、雜交種以及假雜交種為材料用以證明本發(fā)明方法及其專用引物鑒定青花菜‘臺綠I號’真假雜交種的可行性。
[0034](I)人為混入假雜種的‘臺綠I號’樣品幼苗基因組DNA的提取。其中青花菜‘臺綠I號’父本和母本各一份，‘臺綠I號’雜交種子14份，其它隨機(jī)混雜種子8份，依次單株編號，采用CTAB簡易提取法快速提取青花菜幼苗基因組DNA，具體步驟如下:
[0035]①苗期取幼嫩葉片0.2g，剪成小塊，裝入2mL離心管中，同時(shí)每只離心管加入I粒不銹鋼鋼珠(直徑約0.5cm)，蓋好離心管蓋后放入裝有液氮的泡沫盒中靜置lOmin，倒出液氮，快速用力搖晃泡沫盒5min ；
[0036]②打開離心管蓋倒出鋼珠，向離心管中加入600 μ L CTAB裂解液，65°C水浴30min ；CTAB 裂解液組成如下:CTAB2% (w/v)，EDTA20mmol/L，NaCll.4mol/L, Tris50mmol/L, pH8.0 ；
[0037]③加入等體積 氯仿:異戊醇(24:1)輕輕搖晃數(shù)次，12000rpm離心10min ；
[0038]④取上清，加入2/3體積預(yù)冷異丙醇，混勻，_20°C冰箱靜置120min，12000rpm離心IOmin ；
[0039]⑤棄上清，沉淀出的DNA用70%乙醇洗滌兩次，干燥后加入ddH20-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0040](2) PCR 引物 TNISSRl5:5，-TCTCTCTCTCTCTCTCN-3，。
[0041]PCR擴(kuò)增的體系、成分及反應(yīng)程序。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為15 μ L，體系成分為:基因組 DNAlOng，10 μ M 引物 0.85 μ L，25mM Mg2+0.6 μ L, IOmM dNTP0.3 μ L，5U.μ L-1Taq DNA 聚合酶0.15yL，lOXbufferl.5 μ L，無菌重蒸水補(bǔ)齊至15 μ L。
[0042]擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性4min，94°C變性 0.5min，51°C退火 lmin，72°C延伸 2min，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。
[0043](3)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。取8 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與 1.5 μ L loading Buffer(含8%GelRad核酸染料)上樣于2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，在恒定電壓IOOV下電泳50min ;凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，檢測PCR結(jié)果。
[0044]對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。利用引物TNISSR15在母本材料中能夠產(chǎn)生出一條約800bp的特異條帶,在父本材料中能產(chǎn)生一條約600bp的父本特異標(biāo)記條帶。14份青花菜‘臺綠I號’雜交種材料均能同時(shí)擴(kuò)增出與父母本特異性條帶相同的條帶，確定為‘臺綠I號’雜交種。而混入的8份材料則不能同時(shí)擴(kuò)增出父母本特異性條帶，確定為假雜交種。
[0045]實(shí)施例2:
[0046]以臺州農(nóng)科院西蘭花育種基地2013年大田制種并隨機(jī)混入少量假雜種的‘臺綠I號’雜交種為待測樣品，隨機(jī)編號，采用常規(guī)田間種植鑒定法和本發(fā)明方法分別鑒定青花菜‘臺綠I號’雜交種純度，比較兩種方法的鑒定結(jié)果，進(jìn)一步考察本發(fā)明方法的可行性、可靠性與時(shí)效性。
[0047]待測樣品共210份，對其單株編號，進(jìn)行常規(guī)田間種植鑒定和本發(fā)明方法鑒定。
[0048](I)田間種植鑒定法:2013年8月3將210份待測樣品按編號順序依次播種，9月3日移栽于大田,全生育期觀察植株性狀,確定真雜交種株數(shù)，根據(jù)公式“雜交種純度=真雜交種株數(shù)+210X 100%”計(jì)算待測樣品遺傳純度。
[0049](2)本發(fā)明鑒定法:待測樣品基因組提取及檢測方法同實(shí)例I。根據(jù)檢測結(jié)果確定真雜交種株數(shù)，根據(jù)公式“雜交種遺傳純度=真雜交種株數(shù)+210 X 100%”計(jì)算待測樣品遺傳純度。 [0050](3)結(jié)果顯示(圖2為部分樣品檢測結(jié)果)，利用常規(guī)田間鑒定法確定210株待測樣品中共有32株假雜交種，雜交種純度為84.8% ;根據(jù)本發(fā)明結(jié)果得知210份材料中共存在33份假雜種，雜交種遺傳純度為84.2% ;兩種方法鑒定結(jié)果相符度達(dá)99.3%，基本一致。采用田間鑒定從播種到鑒定需要5~6個(gè)月時(shí)間，而本發(fā)明方法從播種到鑒定只需10天；田間種植鑒定成本包括勞動力、農(nóng)藥、化肥、用地等是本發(fā)明方法的所需費(fèi)用的五倍以上。由此可見，本發(fā)明方法在雜交種鑒定的可行性、可靠性與時(shí)效性方面都具有明顯優(yōu)勢，適合在‘臺綠一號’的制種、繁種、經(jīng)銷企業(yè)推廣應(yīng)用。
【權(quán)利要求】
1.青花菜品種‘臺綠I號’雜交種的快速鑒定方法，所述方法包括: (1)待測青花采樣品的基因組DNA的提取； (2)PCR 擴(kuò)增； 擴(kuò)增引物序列如下:5’ -TCTCTCTCTCTCTCTCN-3’ ； PCR反應(yīng)體系每15 μ L組成如下:待測樣品基因組DNAlOng，10 μ M引物0.85 μ L，25mMMg2+0.6 μ L，IOmM dNTP0.3 μ L，5U.μ L-1Taq DNA 聚合酶 0.15 μ L，10 X buffer 1.5 μ L,無菌重蒸水補(bǔ)齊至15 μ L ; PCR反應(yīng)條件如下:94°C預(yù)變性4min，94°C變性0.5min，51°C退火lmin，72°C延伸2min，35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 10min，4°C保存； (3)結(jié)果分析:取PCR產(chǎn)物與含8%GelRad核酸染料的LoadingBuffer混合后上樣于2%瓊脂糖凝膠上，電泳分離后進(jìn)行凝膠成像，以同時(shí)擴(kuò)增出約SOObp和約600bp的條帶，判斷待測樣品為‘臺綠I號’雜交種單株；否則不屬于臺綠I號’雜交種。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法進(jìn)一步包括:根據(jù)鑒定結(jié)果計(jì)算待測青花菜樣品的雜交種遺傳純度，所述雜交種遺傳純度=真雜交種株數(shù)+待測樣品株數(shù) X 100%O
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)方法如下: ①苗期取青花菜的幼嫩 葉片0.2~0.5g，剪成小塊，裝入離心管中，同時(shí)每只離心管加入I粒不銹鋼鋼珠，蓋好離心管蓋后放入裝有液氮的泡沫盒中靜置10~15min，倒出液氮，快速用力搖晃泡沫盒5~IOmin ； ②打開離心管蓋倒出鋼珠，向離心管中加入CTAB裂解液，65±2°C水浴20~30min，所述 CTAB 裂解液組成如下:CTAB2%，EDTA20mmol/L，NaCl1.4mol/L, Tris50mmol/L, pH8.0 ； ③加入等體積的氯仿:異戊醇體積比24:1的混合液，輕輕搖晃后離心； ④取上清，加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，混勻，_20°C冰箱靜置120min，離心； ⑤棄上清，取沉淀DNA用70%乙醇洗滌，干燥后加入ddH20-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號】C12Q1/68GK103993073SQ201410151956
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】張志仙, 何道根, 朱長志, 檀國印 申請人:臺州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院