一對胃癌發(fā)生相關(guān)的競爭性內(nèi)源rna的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一對胃癌發(fā)生相關(guān)的競爭性內(nèi)源RNA，該競爭性內(nèi)源RNA為FER1L4-PTEN；FER1L4與PTEN之間在胃癌組織中存在正相關(guān)性，即FER1L4表達(dá)高時(shí)，PTEN表達(dá)也高，F(xiàn)ER1L4表達(dá)低時(shí)，PTEN表達(dá)也低，而FER1L4在胃癌組織和癌旁組織中表達(dá)相差9.17倍，說明FER1L4-PTEN在胃癌組織表達(dá)異常，與胃癌發(fā)生存在相關(guān)性，對于進(jìn)一步研究lncRNA與mRNA參與的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在生命活動(dòng)和疾病發(fā)生中的作用具有重要的意義。
【專利說明】—對胃癌發(fā)生相關(guān)的完?duì)幮詢?nèi)源RNA
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及競爭性內(nèi)源RNA，具體涉及一對胃癌發(fā)生相關(guān)的競爭性內(nèi)源RNA。
【背景技術(shù)】
[0002]在生物體內(nèi)，mRNA、假基因轉(zhuǎn)錄物、長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA,IncRNA)等轉(zhuǎn)錄物可以競爭性結(jié)合相同的微小RNAUicroRNA，miRNA)而相互影響各自的表達(dá)水平。這些轉(zhuǎn)錄物互相稱為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)。研究表明，ceRNA參與正常生命活動(dòng)過程和疾病的發(fā)生，特別是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。VAPA、CN0T6L、ZEB2、versican和CD44等mRNA以ceRNA方式影響結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌和黑色素瘤等腫瘤的發(fā)生'PTENPUKRASPI和0CT4_pg4等假基因轉(zhuǎn)錄物以ceRNA方式影響前列腺癌和肝癌等腫瘤的發(fā)生'HULC等IncRNA以ceRNA方式影響肝癌的發(fā)生等等。IncRNA是一類理想的ceRNA，因?yàn)樗鼈儾皇芊g活性的干擾，可以高效地結(jié)合miRNA。除了HULC以外，Iinc-MDl、IincRNA-RoR和扭沒等IncRNA均可以在ceRNA角色中發(fā)揮作用；如2013 年發(fā)表在《Journal of Translational Medicine》雜志上的論文 “Long non-codingRNA expression profile in human gastric cancer and its clinical significances，，指出，lncRNA-/--7Z￥在胃癌組織中的表達(dá)水平比癌旁組織中的水平低9.17倍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一對胃癌發(fā)生相關(guān)的競爭性內(nèi)源RNA，既FER1L4與/7TEV之間 在胃癌組織中存在正相關(guān)性，可以進(jìn)一步研究IncRNA與mRNA參與的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、在生命活動(dòng)和疾病發(fā)生中的作用具有重要的意義。
[0004]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一對胃癌發(fā)生相關(guān)的競爭性內(nèi)源RNA,該競爭性內(nèi)源RNA為FER1L4-PTEN。
[0005]該競爭性內(nèi)源RNA的介導(dǎo)miRNA為miR-106a_5p。
[0006]該競爭性內(nèi)源RNA為的篩選:利用IncRNA芯片檢測胃癌組織和癌旁組織中IncRNA表達(dá)水平，篩選出在胃癌組織中低表達(dá)9.17倍的\mmk_FERlL4 ;使用miRcode算法預(yù)測與相互作用的miRNA，結(jié)果顯示上存在miR-106a_5p的結(jié)合位點(diǎn)；進(jìn)一步可以采用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明miR-106a-5p與相互作用；從TarBase數(shù)據(jù)庫獲取并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-106a_5p祀標(biāo)mRNA,其中/TSAr為miR-106a_5p的革巴標(biāo)之一，因此和/7TEV通過miR-106a_5p介導(dǎo)組成一對ceRNA。采用RT-qPCR檢測互為ceRNA的FER1L4和PTE味胃癌組織中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)水平的相關(guān)性，得出競爭性內(nèi)源RNA與之間在胃癌組織中存在正相關(guān)性。
[0007]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于一對胃癌發(fā)生相關(guān)的競爭性內(nèi)源RNA，該競爭性內(nèi)源RNA為FER1L4-PTEN -'FERllA與PTEN之間在胃癌組織中存在正相關(guān)性，即FER1L4表達(dá)高時(shí)，表達(dá)也高，F(xiàn)ER1L4表達(dá)低時(shí)，表達(dá)也低，而在胃癌組織和癌旁組織中表達(dá)相差9.17倍，說明在胃癌組織表達(dá)異常，與胃癌發(fā)生存在相關(guān)性，對于進(jìn)一步研究IncRNA與mRNA參與的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在生命活動(dòng)和疾病發(fā)生中的作用具有重要的意義。
【具體實(shí)施方式】
[0008]以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0009]使用IncRNA 芯片 Human LncRNA Array (Arraystar, Rockville, MD, USA)檢測3對胃癌和癌旁組織中IncRNA表達(dá)水平。該芯片覆蓋18534種IncRNA。雜交、清洗后，使用Axon GenePix 4000B Microarray Scanner (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)進(jìn)行掃描，NimbleScan v2.5 (Roche NimbleGen, Madison, WI, USA)分析原始數(shù)據(jù)，篩選出在胃癌組織中低表達(dá)9.17倍的\mmk-FMlL4。使用miRcode算法預(yù)測與相互作用的miRNA，表明FER1L4上存在miR-106a_5p的結(jié)合位點(diǎn)。令沲FER1L4中miR-106a_5p結(jié)合位點(diǎn)上下游約200 bp序列，其中野生型中結(jié)合位點(diǎn)為5’-GCACUU-3’，突變型中結(jié)合位點(diǎn)為 5’ -UACAGG-3’: 野生型序列為:
TGAGCCTCCCCAGGCCCAGCAGGGGTCCACGTTGTCCCGGCTCACCCGAAAGAAGAAAAAGAAAGCCAGAAGGGATCAGACCCCAAAGGCGGTTCCGCAGCACTTGGACGCCAGCCCCGGTGCCGAGGGGCCTGAGATCCCCCGTGCCATGGAGGTGGAGGTGGAGGAGCTGCTGCCGCTGCCAGAGAATGTCCTGGCGCCCTGT突變型序列為:
TGAGCCTCCCCAGGCCCAGCAGGGGTCCACGTTGTCCCGGCTCACCCGAAAGAAGAAAAAGAAAGCCAGAAG
GGATCAGACCCCAAAGGCGGTTCCGCATACAGGGGACGCCAGCCCCGGTGCCGAGGGGCCTGAGATCCCCCGTGCCA
TGGAGGTGGAGGTGGAGGAGCTGCTGCCGCTGCCAGAGAATGTCCTGGCGCCCTGT
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前一天，將人胚腎細(xì)胞HEK 293T接種到24孔板中培養(yǎng)。使用Lipofectamine2000 Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)將 miR-106a_5p 真核表達(dá)質(zhì)粒 GV268(吉?jiǎng)P，上海，中國)、包含結(jié)合位點(diǎn)序列(野生型或突變型)的螢火蟲螢光素酶質(zhì)粒GV272(吉?jiǎng)P，上海，中國)和作為對照的海腎螢光素酶質(zhì)粒pRL-TK Vector (Promega, Madison,WI, USA)共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，使用Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega, Madison, WI, USA)試劑盒處理細(xì)胞，檢測熒光值。結(jié)果顯示，突變型一組的相對熒光值高出野生型一組約56%。這表明結(jié)合位點(diǎn)突變后，miR-106a-5p對的抑制作用減弱，即野生型和miR-106a-5p存在直接相互作用。TarBase數(shù)據(jù)庫獲取經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的 miR-106a-5p 靶標(biāo)，/7TEV為 miR-106a_5p 的靶標(biāo)之一，和/7TEV通過 miR-106a_5p介導(dǎo)組成一對ceRNA。用RT-qPCR檢測胃癌組織中和的表達(dá)水平:使用GoTaq2-Step RT-qPCR System (Promega, Madison, WI, USA)試劑盒進(jìn)行 RT_qPCR，/--7Z￥ 退火溫度為54°C，/退火溫度為53°C，似作為外參照，從13例胃癌組織中分析互為ceRNA的/?和/TiJV在胃癌組織中表達(dá)水平的相關(guān)性，得到表1結(jié)果。所用引物序列分別如下:
正向引物:5’ -CCGTGTTGAGGTGCTGTTC-3’
反向引物:5’ -GGCAAGTCCACTGTCAGATG-3’
/7TEV正向引物:5’ -GITTACCGGCAGCATCAAAT-3’
/"TEV反向引物:5’ -CCCCCACTTTAGTGCACAGT-3’似正向引物:5’ -AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3，
似戶繼反向引物:5’ -AATGAAGGGGTCAITGATGG-3’
表1胃癌組織中FER1L4和PTEN的相對表達(dá)水平
【權(quán)利要求】
1.一對胃癌發(fā)生相關(guān)的競爭性內(nèi)源RNA，其特征在于該競爭性內(nèi)源RNA為FER1L4-PTEN。
2.如權(quán)利要求1所述的一對胃癌發(fā)生相關(guān)的競爭性內(nèi)源RNA，其特征在于該競爭性內(nèi)源 RNA 的介導(dǎo) miRNA 為 miR-106a_5p。
【文檔編號】C12Q1/68GK103937796SQ201410150768
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】郭俊明, 夏天, 肖丙秀 申請人:寧波大學(xué)