多肽的制作方法【專利摘要】我們描述了一種可源自具有非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶活性的親本多肽的PS4變體多肽,其中所述PS4變體多肽參照如SEQIDNO:1所示嗜糖假單胞菌外切型淀粉酶序列的位置編號在選自：121,161,223,146,157,158,198,229,303,306,309,316,353,26,70,145,188,272,339的一個或多個位置上包含氨基酸突變?！緦＠f明】多化[0001]本申請是申請?zhí)枮?00580029996.8,申請日為2005年7月7日，發(fā)明名稱為"多膚"的中國專利申請的分案申請。[0002]參考2003年7月7日提交的美國臨時申請系列號60/485,413,60/485,539和60/485,616。還參考2004年7月7日提交并指定美國的國際申請PCT/US2004/021723和PCT/US2004/021739(申請人:=GenencorInternational,Inc)。還參考全都在2004年7月7日提交的美國實用新型申請系列號10/886,905和10/866,903。[0003]還參考US臨時申請系列號60/608,919(2004年7月7日提交為美國實用新型申請系列號10/887,056,但在2004年9月15日轉(zhuǎn)為臨時申請）。還參考2004年9月22日提交的美國臨時申請系列號60/612,407。[0004]另外參考2003年7月7日提交的美國申請系列號60/485,539。還參考2004年7月7日提交并指定美國的國際申請PCT/IB2004/002487(申請人:=DaniscoA/S)。還參考2004年7月7日提交的美國實用新型申請系列號10/886,023。[0005]還參考全部都在2004年7月7日提交的美國實用新型申請系列號10/886,505,10/886,527和10/886,504。還參考2004年9月22日提交的美國實用新型申請系列號10/947,612。[0006]特此將在前申請、在本申請和在前申請每一篇中引用或參考的每篇文件，包括在每個在前申請的審批過程期間（"申請和論文引用的文件"），W及在每一個在前申請和論文中和在任何申請和論文引用的文件中所引用或提及的任何生產(chǎn)商的說明書或產(chǎn)品目錄并入本文作為參考。另外，特此將在本文中引用的所有文件，W及在本文中引用的文件中所有引用的文件或參考文獻，W及在本文或在特此并入本文的任何文件中引用或提及的任何生產(chǎn)商的說明書或產(chǎn)品目錄并入本文作為參考?？蒞將并入本文作為參考的文件或其中的任何教導用于本發(fā)明的實踐中。通過參考并入本文的文件并被承認為現(xiàn)有技術。【
技術領域：
】[0007]本發(fā)明涉及多膚，特別是淀粉酶多膚和編碼該些的核酸，W及它們作為非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶在生產(chǎn)食品產(chǎn)品中的用途。已經(jīng)對本發(fā)明的淀粉酶進行了工程化設計W便具有更有益的品質(zhì)。具體地，本發(fā)明的淀粉酶顯示改變的外切特異性和/或改變的熱穩(wěn)定性。特別地，所述多膚源自具有非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶活性，特別地，葡聚糖l，4-a-麥芽糖四水解酶（glucanl,4-al地a-maltotetr址y化olase)巧C3.2.1.60)活性的多膚?！?br>背景技術：
】[0008]改進的淀粉酶可W改善在某些加工過程，如烘賠中固有的問題。烘賠后數(shù)天在淀粉顆粒中發(fā)生支鏈淀粉的結晶，其導致面包硬度提高并導致面包陳化（staling)。當面包陳化時，面包喪失面包也（crumb)軟度和面包也水分。結果，面包也彈性變小，并且面包形成皮革似的面包皮（crust)。[0009]支鏈淀粉側(cè)鏈的酶水解（例如，通過淀粉酶）可W減少結晶并提高抗陳化性。結晶依賴于支鏈淀粉側(cè)鏈的長度：側(cè)鏈越長，結晶越嚴重。大多數(shù)淀粉顆粒由兩種聚合物的混合物組成：支鏈淀粉和直鏈淀粉，其中大約75%是支鏈淀粉。支鏈淀粉是極大的，分枝的分子，其由通過（1-4)連接連接的a-D-化喃葡糖巧基單位組成，其中通過a-D-(I-S)連接附著W形成分枝。直鏈淀粉是具有少數(shù)a-D-(l-6)分枝的（1-4)連接的a-D-化喃葡糖巧基單位的線性鏈。[0010]含淀粉的面包產(chǎn)品如白面包、由篩制的（bolted)黑麥粉和小麥粉（wheatflower)制得的面包和面包卷的烘賠通過在從18(TC到25(TC范圍的烤箱溫度烘賠面包生面團持續(xù)大約15到60分鐘來實現(xiàn)。在烘賠過程中在外部生面團層上迅速升高（steep)的溫度梯度(200-12(TC)占上風，在那里形成烘賠過的產(chǎn)品的面包皮。不過，由于蒸氣，在烘賠過程結束時面包也中的溫度只有大約l〇(TC。在大約85C的溫度W上，可W發(fā)生酶失活并且酶將沒有抗陳化的特性。因而，只有熱穩(wěn)定淀粉酶能夠在烘賠過程中有效地改變淀粉。[0011]通過產(chǎn)生粘性的面包也，所述粘性的面包也由于分枝糊精聚集而帶來，內(nèi)淀粉酶活性可W負面影響最后面包產(chǎn)品的質(zhì)量。優(yōu)選外切型淀粉酶活性，因為它實現(xiàn)所需的淀粉修飾，所需的淀粉修飾導致陳化延遲，并伴隨較少的與內(nèi)淀粉酶活性相關聯(lián)的負效應。內(nèi)淀粉酶活性的減弱能夠?qū)е赂蟮耐馇刑禺愋?，所述外切特異性能夠減少分枝的糊精并產(chǎn)生更高質(zhì)量的面包?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0012]根據(jù)本發(fā)明，我們提供如權利要求中所述的PS4變體多膚。我們進一步提供該種PS4變體多膚的用途，包括如權利要求中所述在食品添加劑、食品產(chǎn)品、面包產(chǎn)品、改良劑組合物、飼料產(chǎn)品包括動物飼料等中和作為該些的用途。我們提供在權利要求中所述的編碼和涉及PS4變體多膚的核酸。在權利要求中還列出了生產(chǎn)該些PS4變體多膚的方法，W及本發(fā)明的其它方面。[0013]序列表[0014]SEQIDNO:1顯不源自嗜糖假單胞菌（Pseudomonassaccharophila)麥芽糖四水解酶氨基酸序列的PS4參照序列。SEQIDN0:2顯示PSac-D34序列；具有11個取代和缺失了淀粉結合結構域的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:3顯示PSac-D20序列；具有13個取代和缺失了淀粉結合結構域的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:4顯示PSac-DH序列；具有14個取代和缺失了淀粉結合結構域的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列.SEQIDN0:5顯示嗜糖假單胞菌葡聚糖l，4-a-麥芽糖四水解酶前體巧C3.2.1.60)佑4-淀粉酶）（形成麥芽四糖(maltotetraose)的淀粉酶）（外切型麥芽糖四水解酶）（形成麥芽四糖的外切型淀粉酶）。SWISS-PR0T編號P22963。沈QIDN0:6顯示編碼麥芽四水解酶（EC號=3.2.1.60)的嗜糖假單胞菌mta基因。GenBank編號X16732。沈QIDN0:7顯示源自施氏假單胞菌（PseudomonasS化tzeri)麥芽糖四水解酶氨基酸序列的PS4參照序列。SEQIDN0:8顯示PS化-D34序列；具有9個取代的施氏假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:9顯示PS化-D20序列；具有11個取代的施氏假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDNO:10顯示PS化-D14序列；具有12個取代的施氏假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。沈QIDNO:11顯示施氏假單胞菌（全海假單胞菌Pseudomonaspe計ectomarina)葡聚糖1,4-a-麥芽糖四水解酶前體巧C3.2.I.60)佑4-淀粉酶）（形成麥芽四糖的淀粉酶）（外切型麥芽糖四水解酶）（形成麥芽四糖的外切型淀粉酶）。5胖155斗301'編號？13507。56910^:12顯示施氏假單胞菌形成麥芽四糖的淀粉酶（amy巧基因，完整編碼序列（cds)。GenBank編號124516。沈910側(cè)：13顯示9]\?55序列；具有11個取代佑134氏4141?，115化，62234，冊07LS334P，N33Y，D34N，L178F，A179T和G121巧的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。56910側(cè)：13顯示9]\?55序列；具有11個取代佑134氏4141?，115化，62234，冊0化，5334口，N33Y，D34N，L178F，A179T和G121巧和缺失淀粉結合結構域的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:14顯示PMD96序列：在N33Y，D34N，G121F，G134R，A141P，I157LS161A，L178F，A179T，G223E，冊0化和S334P上具有突變的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDNO:15顯示SSM381序列：在33Y,34N,121F,134R,141P,146G,15化，161A，178F，179T，223E，30化和334P上具有突變的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。沈QIDNO:16顯示SSM279B1序列：在33Y,：MN，121F,1：MR，141P,157M,161A,178F,179T，223E，30化和334P上具有氨基酸突變的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDNO:17顯示SSM237P2序列：在33Y,：MN，121F,1：MR，141P,157L158T,161A,178F,179T,223E，30化和334P上具有氨基酸突變的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:18顯示在33Y，：MN，121F，1：MR，141P，157レ161A，178F，179T，198W，223E，30化和334P上具有氨基酸突變的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDNO:19顯示SSM325F3序列：在33Y,34N,121F,134R,141P,15化，161A,178F,179T,223E,229P,30化和334P上具有突變的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:20顯示PMD129序列：在33Y,：MN，121F,1：MR，141P,157L161A,178F,179T,198W,223E,229P,30化和334P上具有突變的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDNO:21顯示SSM341A9序列：在33Y，34N,121F,134R,141P,15化，161A,178F,179T,223E,303E,30化和334P上具有突變的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:22顯示SSM341G11序列：在33Y，34N，121F,134R,141P,15化，161A,178F,179T,223E,303D,30化和334P上具有突變的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:23顯示SSM350B11序列：在33Y，34N，121F，134R,141P,15化，161A,178F,179T,223E,306T,30化和334P上具有突變的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:24顯示SSM350C12序列：在33Y，34N，121F，134R，141P，15化，161A，178F，179T，223E，306G，30化和334P上具有突變的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:25顯示SSM332Q4序列：在33Y,34N,121F,134R,141P,157L，161A，178F，179T，223E，309P，30化和334P上具有氨基酸突變的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:26顯示SSM365B4序列：在33Y,34N,121F,134R,141P,157L161A，178F，179T，223E，30化，316S，和334P上具有氨基酸突變的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:27顯示SSM365F4:在33Y，34N,121F,134R,141P,157L161A,178F，179T，223E，307^316P和334P上具有突變的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。沈QIDN0:28顯示SSM360C7:在33Y,：MN，121F,1：MR，141P,157L161A,178F,179T,223E，307^334P和353T上具有突變的嗜糖假單胞菌麥芽糖四水解酶氨基酸序列。【具體實施方式】[0015]在下列描述和實施例中，除非上下文另外規(guī)定，PS4變體多膚的劑量W每百萬面粉中的部分/(微克每克）來給出。例如，表2中所用的"1D34"表示基于重量/重量的每百萬中的1部分pSac-D34。優(yōu)選地，利用Rra壯ord(1976,Arapidandsensitivemethodforthequanti円cationofmicroorganismquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.Anal.Biochem.72:248-254)中所述的測定，基于作為W牛血清白蛋白（BSA)為標準測量的純酶蛋白的等同物的活性測定來確定酶數(shù)量或量。[0016]在描述通過本文生產(chǎn)或預期為本文所包括的不同PS4變體多膚變體中，將采用下列命名法W易于參照：[0017](i)在取代包括數(shù)字和字母時，例如，141P，則該指[根據(jù)編號系統(tǒng)的位置/取代氨基酸]。因此，例如，在位置141上氨基酸取代成脯氨酸表示為141P;[0018](ii)當取代包括字母時，數(shù)字和字母，例如，A141P，則該指[最初氨基酸/根據(jù)編號系統(tǒng)的位置/取代氨基酸]。因此，例如，在位置141上W脯氨酸取代丙氨酸表示為A141P。[0019]在特定位置上可能有兩種或多種取代物時，該將通過鄰接的字母來表示，其可W任選地由斜線標記"/"來分隔，例如，G303邸或G303E/D。當在一定位置上的相關氨基酸能夠由任何氨基酸取代時，該通過[根據(jù)編號系統(tǒng)的位置/X]來表示，例如，121X。[0020]多個突變可W通過由斜線標記V"分隔來表示，例如A141P/G223A代表在位置141和223上的突變，分別W脯氨酸取代丙氨酸和W丙氨酸取代甘氨酸。[0021]除非另外指定，本文所用的全部技術和科學術語都具有與本發(fā)明所屬【
技術領域：
】普通技術人員通常所理解的相同意義。Singleton,等人,Dictionary日FMice日biologyANDM日LECULARBiology,2〇Ed.，JohnWileyandSons,NewYork(1994)，和Hale&Marham,成邸邸00化燃DictionaryOFBiology,HarperPerennial,NY(1991)向本領域技術人員提供本發(fā)明中所用到的許多術語的通用辭典。盡管可W將與本文所述那些方法和材料類似或等同的任何方法和材料用于本發(fā)明的實踐或測試中，還是描述了優(yōu)選的方法和材料。數(shù)字范圍包括定義范圍的數(shù)字。除非另外指定，分別地，棱酸W5'到3'方向從左到右書寫：氨基酸序列W氨基到簇基方向從左到右書寫。[0022]除非另外指定，本發(fā)明的實踐將采用，化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學常規(guī)技術，其在本領域普通技術人員的能力么內(nèi)。這些技術在文獻中得W解釋。見，例如，J.Sambrook,E.F.F'ritsch,和T.Maniatis,1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,Booksl-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress:AusubeI，F(xiàn).M.等人(1995andperiodicsupplements：CurrentProtocolsinMolecularBiology,ch.9,13,andl6,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.):B.民oe,J.Crabtree,andA.Kahn,1996,DNAIsolationandSequencing!EssentialTechniques,JohnWiley&Sons：J.M.PolakandJamesD.McGee,1990,InSituHybridizationiPrinciplesandPractice：OxfordUniversityPress:M.J.Gait(Editor)，1984,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IrlPress:D.M.J.LilleyandJ.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymology:DNAStructurePartA:SynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress：UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBNO-87969-544-7)：Antibodies:ALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor),DavidLane(Editor)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBNO-87969-314-2),1855,Lars-IngeLarsson''Immunocytochemistry:TheoryandPractice'，，CRCPressinc.,BacaRaton,Florida,1988,ISBNO-8493-6078-1,JohnD.Pound(ed);"ImmunochemicalProtocols,vol80",intheseries:"MethodinMolecularBiology",HumanaPress,Totowa,NewJersey,1998,ISBNO-89603-493-3,HandbookofDrugScreening,editedbyRamakrishnaseethala,PrabhavathiB.Fernandes(2001,NewYork,NY,MarcelDekker,ISBN〇-8247-〇562-9);和LabRef:AHan化ookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,EditedJaneRoskamsandLindaRodgers,2002,ColdSpringHarborL油oratory,ISBNO-87969-630-3。將該些一般性文本的每一篇都并入本文作為參考。[0023]將本文中參考的所有專利和公開出版物，包括該些專利和公開出版物中公開的所有序列都并入本文作為參考。[0024]PS4變體多膚[0025]我們提供在一個或多個位置上具有取代的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶，其帶來相對于親本酶的改變的特性，優(yōu)選改變的外切特異性或改變的熱穩(wěn)定性，或二者都有。[0026]我們進一步提供組合物，包括含有具有非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶活性的多膚的食品添加劑、食品、烘賠產(chǎn)品、改良劑組合物、飼料產(chǎn)品包括動物飼料等，W及制備和利用該些多膚和組合物的方法。我們提供該些組合物如在制備去污劑、作為甜味劑、糖漿等中的其它用途。所述組合物包括多膚與至少一種其它組分。特別地，我們提供包含所述多膚的食品或飼料添加劑。[0027]通過包括多個突變該些多膚和核酸區(qū)別于它們的親本序列，并且為了方便稱作"PS4變體多膚"。換句話說，PS4變體多膚或核酸的序列在多個位置或殘基上有別于其親本。在優(yōu)選的實施方案中，突變包含氨基酸取代，即，一個氨基酸殘基改變成另一個。PS4變體多膚在親本序列的一個或多個位置上包含多個氨基酸殘基性質(zhì)的變化。[0028]本文所用的術語"變體"應當用來意指可源自親本分子的分子。變體包括多膚W及核酸。變體包括在一個或多個位置上的取代、插入、顛換和倒位等等。變體還包括截短。變體包括親本分子的同源和功能性衍生物。變體包括與能夠雜交本文給出的核巧酸序列的序列互補的序列。[0029]PS4變體多膚的取代[0030]我們提供具有序列改變化的PS4變體多膚，所述多膚包含非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶序列中的氨基酸取代。相對于SEQIDN0:1中所示的嗜糖假單胞菌（Pseudomonassaccharophilia)外切型淀粉酶序列的位置編號，氨基酸取代可W是在位置26,70,121，145,146,157,158,161，188,198,223,229,272,303,306,309,316,339和353的其中一個或多個上。[0031]氨基酸突變可W是在選自下組的一個或多個位置上：（a)位置121，161,223;化）位置146,157,158,198,229,303,306,309,316,353;和（C)位置26,70,145,188,272,339;W及（a)、化）和（C)的任意組合。[0032]氨基酸取代可W包含對121F，121Y，121W，161A，223E，223K的改變?；蛘?，或此外，氨基酸取代可W包含對146G,146M,157M,158T,158A,158S,198W,198F,229P,303E,303D,306T，306G，309P，316S，316P，31服，316Q，353T的改變。還或者，或此外，氨基酸取代可W包含對26E,70D,114抓，188S,188T,188H,272Q,339A,33犯的改變。[0033]該些變體多膚在本文中稱為"PS4變體多膚"。還公開了編碼該些變體多膚的核酸并且為了方便將稱作"PS4變體核酸"。PS4變體多膚和核酸將在下面更詳細地描述。[0034]"親本"序列，即，PS4變體多膚和核酸W其為基礎的序列，優(yōu)選是具有非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶活性的多膚。應當相應地解釋術語"親本酶"和"親本多膚"，并用來意指PS4變體多膚W其為基礎的酶和多膚。下面對它們作更詳細地描述。[0035]在特別優(yōu)選的實施方案中，親本序列是非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶，優(yōu)選細菌非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶。在高度優(yōu)選的實施方案中，親本序列包含葡聚糖1,4-a-麥芽糖四水解酶(麥芽糖四水解酶）巧C3.2.1.60)。優(yōu)選地，親本序列可源自假單胞菌屬菌種，例如嗜糖假單胞菌或施氏假單胞菌。[0036]在一些實施方案中，親本多膚包含，或與例如，來自假單胞菌屬的種（SPP.)的野生型非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶序列同源。[0037]因而，親本多膚可W包含具有如SEQIDNO:1所示序列的嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶。在其它優(yōu)選的實施方案中，親本多膚包含具有如SEQIDNO:11所示序列的來自施氏假單胞菌的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶，或具有SWISS-PR0T編號P13507的施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶。[0038]在另一方面，親本多膚可W是任何野生型序列的變體，也就是說，親本多膚可W自身進行工程化改造，或包含PS4變體多膚。[0039]不過，對于熟練讀者將會顯而易見的是盡管PS4變體多膚可W通過突變已經(jīng)突變過的序列而衍生，但有可能通過起始自野生型序列（或事實上任何合適的序列），鑒定起始序列與所需變體之間的差異，W及將需要的突變導入起始序列中W便獲得所需的變體來構建該些變體多膚。[0040]涉及、優(yōu)選與如SEQIDNO:1所示的嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶序列或與如SEQIDNO:11所示序列的施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶具有序列或功能同源性的蛋白質(zhì)和核酸在本文中稱作"PS4家族"成員。下面進一步詳細地披露適用于生成PS4變體多膚和核酸的"PS4家族"非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶的例子。[0041]本文描述的PS4變體多膚優(yōu)選保留親本多膚的特征，并且另外優(yōu)選具有其它有益特性，例如，增強的活性或熱穩(wěn)定性、或抑耐受性、或任意組合（優(yōu)選全部）。下面對該進行更詳細的描述。[0042]該里描述的PS4取代突變體可W用作任意合適的目的。它們可W優(yōu)選用于適于親本酶的目的。特定地，它們可W用于任何使用外切型麥芽糖四水解酶的應用中。在高度優(yōu)選的實施方案中，它們具有較高熱穩(wěn)定性，或較高外切型淀粉酶活性或較高抑穩(wěn)定性，或任意組合的額外優(yōu)點。PS4變體多膚和核酸的適當用途的例子包括食品生產(chǎn)，特別是烘賠，W及食物生產(chǎn)；下面更詳細地列出其它例子。[0043]除了上面給出的那些位置之外，PS4變體多膚可W包含一個或多個其它突變。除了已經(jīng)給出那些的之外還可W有一個，兩個，H個，四個，五個，六個，走個或更多的突變優(yōu)選取代。還可W在一個或多個其它位置上包括其它突變，如缺失、插入、取代、顛換、轉(zhuǎn)換和倒位。此外，PS4變體不必在列出的位置上具有全部取代。事實上，它們可W缺失一個，兩個，H個，四個，或五個取代，即，野生型氨基酸殘基存在于該些位置上。[0044]基于野生型序列的PS4變體多膚[0045]在親本多膚包含野生型序列的實施方案中，PS4變體多膚可W包含野生型序列，但是在位置121，161和223,優(yōu)選121F，121Y，121W，161A，223E或223K，更加優(yōu)選G121F,G121Y,G121W,S161A,G223E或G223K的一個或多個上具有突變。[0046]PS4變體多膚可W包含野生型序列，或在前段落中給出的序列，但是在位置146,157,158,198,229,303,306,309,316或353,優(yōu)選146G,146M,157M,158T,158A,158S,198W,198F,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P,316K,316Q或353T,更加優(yōu)選146G,157M,158T,198W,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P或353T的一個或多個上具有突變。[0047]PS4變體多膚可W包含野生型序列，或在前兩段中給出的序列，但是在位置26,70,145,188,272或339,優(yōu)選26E,26D,70D,14抓，188S,188T,188H,272Q,339A或33犯，更加優(yōu)選N26E,N26D,G70D,N14抓，G188S,G188T,G18細，肥72Q,W339A或W33犯的一個或多個上具有突變。[0048]通常，位置的任意組合，取代和特定突變可W任意方式和W任意數(shù)目組合W產(chǎn)生本文公開的PS4變體多膚。[0049]因而，我們公開了基于野生型PS4親本序列的PS4變體多膚，優(yōu)選地，具有如SEQIDN0:1所示序列的嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶。因而，PS4變體多膚可W包含SEQIDNO:1中所示的序列，但是在上面給出的位置上具有任何一種或多種突變。PS4變體多膚還可W基于如下面SEQIDN0:7所示的野生型施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽糖酶序列，但是在上面給出的位置上具有任何一種或多種突變。[0050]盡管PS4變體多膚可W基于野生型PS4親本序列，在優(yōu)選的實施方案中PS4變體多膚是基于野生型PS4親本序列的工程化改造(或突變的）版本。因而，在該些實施方案中，親本序列包含已經(jīng)突變的PS4序列。如下面更加詳細地描述的，可W重新或通過一次或多次突變堿基序列制備該些序列。[0051]位置121，161和/或223[0052]PS4變體多膚可W包含野生型序列，或作為野生型序列變體的突變序列，如在又一個位置如121，161和223上具有取代的已經(jīng)突變的序列。[0053]因而，在相應一個或多個位置上的一個或多個目標突變一般可W與位置121，161或223中的一個、兩個或所有位置上的單個其它突變有益地組合。[0054]位置121取代，在存在時，優(yōu)選選自下組：121F，121Y，121W，121H，121A，121M，121G,121S,121T,121D,121E,12比，12化和121V。優(yōu)選地，位置121取代是121F,121Y或121W。位置161取代，在存在時，優(yōu)選是161A，更加優(yōu)選S161A。當位置161被突變時，在位置160上的其它突變也可W存在，優(yōu)選160化更加優(yōu)選E160D。[00巧]位置223取代，在存在時，優(yōu)選選自下組：223K,223E,223V,223R,223A,223P和223D。更加優(yōu)選地，223取代是223E或223K。在特別優(yōu)選的實施方案中，其它一個或多個取代選自下組：G121F，G121Y，G121W,161A，223E和223K。[0056]在特別優(yōu)選的實施方案中，PS4變體多膚至少包含H個下列的取代121F/Y/W，161A，223E/K?？蒞包括如下面所給出的其它突變。[0057]位置146,157,158,198,229,303,306,309,316和353[0058]PS4變體多膚可W包含野生型序列，或作為野生型序列變體的突變體序列，如已經(jīng)突變了的序列-包括在位置121，161和223中的一個或多個上具有突變的PS4變體多膚。在另一個位置如位置146,157,158,198,229,303,306,309,316和353上具有取代。[0059]位置26,70,145,188,272和339[0060]PS4變體多膚可W包含野生型序列，或作為野生型序列變體的突變體序列，如已經(jīng)突變了的序列一包括在位置121，161，223,146,157,158,198,229,303,306,309,316和353中的一個或多個上具有突變的PS4變體多膚…在另一個位置如26,70,145,188,272和339上具有取代。[0061]因而，在相應一個或多個位置上的一個或多個目標突變一般可W與位置26,70,145,188,272和339中的一個、兩個或所有位置上的單個其它突變有益地組合。[0062]PS4變體多膚可W在位置26上包含取代，優(yōu)選26E或26E。更加優(yōu)選地，位置26取代包含N26E或N2抓。最優(yōu)選地，位置26取代包含N26E。[0063]PS4變體多膚可W在位置70上包含取代，優(yōu)選70D。更加優(yōu)選地，位置26取代包含G70D。[0064]PS4變體多膚可W在位置145上包含取代，優(yōu)選14抓。更加優(yōu)選地，位置145取代包含N145D。[0065]PS4變體多膚可W在位置188上包含取代，優(yōu)選188S，188T或188H。更加優(yōu)選地，位置188取代包含G188S,G188T或G188H。最優(yōu)選地，位置188取代包含G188S或G188H。[0066]PS4變體多膚可W在位置272上包含取代，優(yōu)選272Q。更加優(yōu)選地，位置272取代包含肥72Q。[0067]PS4變體多膚可W在位置W339A上包含取代，優(yōu)選339A或33犯。更加優(yōu)選地，位置339取代包含W339A或W33犯。[0068]基于變體序列的PS4變體多膚[0069]與位置33,34,121，134,141，157,178,179,223,307和/或334的組合[0070]在一些實施方案中，親本序列在位置33,34,121，134,141，157,178,179,223,307和334中的一個或多個，優(yōu)選全部位置上包含突變（因此PS4變體多膚也將包含有關相應的突變）。[0071]在該些實施方案中，突變優(yōu)選為：N33Y,D：MN，G121D,G1：MR，A141P,1157^L178F,A179T，G223A，冊0化和S334P中的一個或多個，優(yōu)選全部。[0072]在該些實施方案中，PS4變體多膚可W便利地衍生自包含序列PSac-D34(SEQIDN0:2)的嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽糖酶序列。[0073]與位置33,34,121，134,141，157,178,179,223,307和334,121，161和/或223的組合[0074]PS4變體多膚可W進一步包含位置33,34,121，134,141，157,178,179,223,307和334中任一個上的突變，組合W位置121，161和/或223中任一個上的突變。因而，我們公開了包含W下的任意組合的PS4變體多膚：（a)在殘基33,34,121，134,141，157,178,179，223,307和334上的任意一個或多個突變，優(yōu)選N33Y,D34N,G121D,G134R,A141P,11571^，Ll78F，A179T，G223A，冊O化和S334P;(b)在位置121，161或223上的任意一個或多個突變，優(yōu)選121F,121Y,121W,161A,223E或223K,更加優(yōu)選121F,161A或223E,和（C)在位置146,157,158,198,229,303,306,309,316或353上的任意一個或多個突變，優(yōu)選146G,146M,157M,158T,158A,158S,198W,198F,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P,316K,316Q或353T,更加優(yōu)選146G,157M,158T,198W,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P或353T。[0075]在一些優(yōu)選的實施方案中，我們提供該樣的PS4變體多膚，其包含上面（a)中給出的所有下列突變，組合W上面（C)中給出的一個或多個突變。在其它優(yōu)選的實施方案中，我們提供該樣的PS4變體多膚，其包含上面（a)中給出的所有下列突變，組合W上面化）中給出的所有突變，組合W上面（C)中給出的任一個或多個突變。[0076]基于pMD96的PS4變體多膚[0077]在包括所有（a)和化）中突變的實施方案中，PS4變體多膚可W便利地衍生自包含序列pMD96(SEQIDN0:14)的嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽糖酶序列。[0078]因而，我們具體地提供了實施例12到20中給出的PS4變體多膚，其具有序列SEQIDNO:15-28。如實施例中所示，與其親本相比每一種該些多膚都具有一種或多種改進的特性。[007引其它組合[0080]另外，還可W使用在其它位置，例如，134,141，157,223,307和334中的任一個或多個上包含突變的親本序列。任選地，該些可W包括位置33和34中的一個或兩個上的突變。[0081]因而，親本序列可W包含在選自下組：134,141，157,223,307,334的位置上的一個或多個突變，和任選地33和34(因此當然PS4變體多膚也將包含有關的相應突變）。[0082]在一些實施方案中，親本多膚包含取代位置134上的精氨酸，位置141上的脯氨酸和位置334上的脯氨酸，例如，G134R，A141P和S334P。[0083]在另外的實施方案中，親本多膚進一步包含位置121上的突變。親本多膚可W進一步包含位置178上的突變。它可W進一步包含位置179上的突變。它還可W進一步包含位置87上的突變。各自特別優(yōu)選的取代優(yōu)選為121化更加優(yōu)選G121化優(yōu)選178F，更加優(yōu)選L178F，優(yōu)選179T，更加優(yōu)選A179T和優(yōu)選87S，更加優(yōu)選G87S。[0084]該些位置上的殘基可W被許多殘基所取代，例如I157V或I157N或G22化或G223I或G223S或G223T或冊071或冊07V或D34G或D34A或D34S或D34T或A179V。不過，親本多膚優(yōu)選包含取代1157^G223A,冊071^，L178F和A179T(任選地N33Y,D34N)。[0085]在高度優(yōu)選的實施方案中，PS4變體多膚包含位置146,157,158,198,229,303,306,309,316和353中的任一個或多個位置上的取代，優(yōu)選146G，157M，158T，198W，229P，303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P或353T,W及一個或多個下列取代：G134R,A141P,115TLG223A,冊071^，S3：MP，N33Y和D34N,W及L178F和A179T中的一個或兩個。[0086]基于PSac-D20的PS4變體多膚[0087]PS4變體可W基于嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽糖親本酶序列PSac-D20(SEQIDNO:3)。[0088]在該種實施方案中，PS4變體多膚包含位置146,157,158,198,229,303,306,309，316和353中的任一個或多個位置上的取代，優(yōu)選146G，157M，158T，198W，229P，303E，303D，306T,306G,309P,316S,316P或353T,W及一個或多個下列取代：G134R,A141P,115化，G223A,冊O化，S334P,N33Y,D34N和G121D,W及L178F和A179T中的一個或兩個。[0089]基于PSac-DH的PS4變體多膚[0090]PS4變體可W基于嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽糖親本酶序列PSac-D14(SEQIDN0:4)。[0091]在該種實施方案中，因此PS4變體多膚包含位置146,157,158,198,229,303,306，309,316和353中的任一個或多個位置上的取代，優(yōu)選146G,157M,158T,198W,229P,303E，303D,306T,306G,309P,316S,316P或353T,W及一個或多個下列取代：G134R,A141P,1157LG223A,冊071^，S3：MP，N33Y,D：MN，G121D和G87S,W及L178F和A179T中的一個或兩個。[0092]基于pMD55的PS4變體多膚[009引PS4變體可W基于嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽糖親本酶序列PMD55(沈QIDNO:13).[0094]在該種實施方案中，PS4變體多膚包含位置146,157,158,198,229,303,306,309，316和353中的任一個或多個位置上的取代，優(yōu)選146G,157M,158T,198W,229P,303E,303D，306T,306G,309P,316S,316P或353T,W及一個或多個下列取代：G134R,A141P,115化，G223A,冊071^，S3：MP，N33Y,D：MN，G121F和G87S,W及L178F和A179T中的一個或兩個。PS4變體多膚可W衍生自具有該種取代的親本多膚。[0095]基于施氏假單胞菌親本多膚的PS4變體多膚[0096]在一些實施方案中，PS4變體源自施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽糖酶序列，優(yōu)選如下面SEQIDNO:7所示。[0097]因此，PS4變體多膚可W衍生自序列PS化-D34(SEQIDN0:8)。我們進一步公開了基于施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽糖酶序列并包括G121和/或G87取代的PS4變體多膚。該些可W包含下列取代：G134R，A141P，I15化，G223A，冊0化，S334P，N33Y，D34N和G121D，W及L178F和A179T中的一個或兩個，W及包含下列取代的PS4變體多膚：G134R，A141P，I15化，G223A,冊071^，S3：MP，N33Y,D：MN，G121D和G87S,W及L178F和A179T中的一個或兩個。[0098]所W，PS4變體多膚可W源自施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽糖酶親本序列，所述親本序列具有序列PSUi-D20(SEQIDN0:9),其包含G121D，或具有序列PSUi-D14(SEQIDN0:10),其進一步包含G87S。[0099]PS4變體核酸[0100]我們還描述了具有對應于或編碼PS4變體多膚序列中變化的序列的PS4核酸，用于為了該里描述的目的來生產(chǎn)該些多膚。因而，我們提供能夠編碼本文中給出的任意多膚序列的核酸。[0101]技術人員將會意識到核酸序列與多膚序列之間的關系，特別是，遺傳密碼W及該種密碼的簡并性，并且將能夠毫不困難地構建該些PS4核酸。例如，他將會意識到對于PS4變體多膚序列中的每個氨基酸取代，都可W有一個或多個密碼子編碼取代氨基酸。因此，將會顯而易見的是，取決于該特定氨基酸殘基的遺傳密碼簡并性，對應于該PS4變體多膚序列可W生成一種或多種PS4核酸序列。另外，當PS4變體多膚包含一種W上的取代時，例如A141P/G223A，對應的PS4核酸可W包含分別編碼兩種氨基酸變化的密碼子的成對組合。[0102]PS4變體核酸序列可W衍生自編碼上述任意親本多膚的親本核酸。特別地，親本核酸可W包含野生型序列，例如，SEQIDN0:6或SEQIDNO:12。所WPS4變體核酸可W包含編碼野生型非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶的核酸，但其在相應的位置上編碼另一種氨基酸而非野生型氨基酸殘基。PS4變體核酸序列還可W包含具有一個或多個突變的野生型序列，例如，其編碼上述歸于"組合"之下的親本多膚。[0103]將會理解的是與特定PS4變體核酸序列不同，但涉及該些的核酸序列，也將可用于本文所述的方法和組合物，如PS4變體核酸序列的變體、同源物、衍生物或片段，或其能夠雜交的補體或序列。除非本文另外規(guī)定，術語"PS4變體核酸"應當用來包括上面列出的該些實體的每一種。[0104]可W通過多種本領域已知若干技術中的任一種來制成氨基酸序列和核酸序列中的突變。通過任一種已知誘變技術可W輕易制成變體序列，例如，利用PCRW適當?shù)墓押饲伤嵋镞M行的定點誘變，5'添加突變，錯配引物突變等?；蛘?，或此外，PS4變體核酸序列可W重新制備。[0105]在特別優(yōu)選的實施方案中，如實施例中所說明的，通過使用適當引物的PCR(聚合酶鏈式反應）將突變引入親本序列。如所述的，所W有可能通過將任意所需的氨基酸取代導入優(yōu)選具有非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶活性的親本多膚中來改變多膚序列，如在氨基酸或核酸水平上導入嗜糖假單胞菌或施氏假單胞菌外切型淀粉酶序列。我們介紹了通過改變編碼非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶的核酸序列來改變非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶序列的方法。[0106]不過，當然將會理解的是PS4變體多膚并不需要實際上源自野生型多膚或核酸序列，例如，通過一步步的突變。相反，一旦確定了PS4變體多膚的序列，技術人員就能夠輕易地通過本文已知的方法，例如，使用合適的寡核巧酸引物和PCR，由野生型制成具有所有突變的序列。事實上，可W通過，例如，膚合成方法來從頭制成具有其所有突變的PS4變體多膚。[0107]不過，通常PS4變體多膚和/或核酸衍生自或可W衍生自"前體"序列。本文所用的術語"前體"意指在根據(jù)本文所述方法修飾的酶和該里所描述的組合物之前的酶。所W前體包括用來產(chǎn)生經(jīng)修飾的酶的酶。因而，前體可W是通過本文中其它任何地方所述的誘變進行修飾的酶。同樣地，前體可W是野生型酶，變體野生型酶或已經(jīng)突變過的酶。[010引可W通過本領域已知的任何方法來產(chǎn)生PS4變體多膚和核酸。具體地，它們可W由表達系統(tǒng)進行表達，所述表達系統(tǒng)性質(zhì)上可W是體外或體內(nèi)的。具體地，我們介紹了含有PS4核酸序列的質(zhì)粒和表達載體，優(yōu)選能夠表達PS4變體多膚。還公開了包含W及優(yōu)選用該些PS4核酸、質(zhì)粒和載體轉(zhuǎn)化的細胞和宿主細胞，并且應當清楚該些也包括在本文中。[0109]在優(yōu)選的實施方案中，將PS4變體多膚序列W分離的形式用作食品添加劑。術語"分離的"意指該序列至少基本上不含一種其它組分，所述其它組分在自然界中與該序列天然相關聯(lián)并在自然中發(fā)現(xiàn)。在一方面，優(yōu)選該序列為純化的形式。術語"純化的"意指該序列處于相對純的狀態(tài)一例如至少大約90%純，或至少大約95%純或至少大約98%純。[0110]位置編號[0111]本文中通過編號提及的所有位置都參照下面所示的嗜糖假單胞菌外切型淀粉酶參照序列（SEQIDN0:1)的編號：[0112]【權利要求】1.一種非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體，其在對應于SEQID勵：1的位置121、146、157、161、223、229、272、303和309或在親本非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶的對等位置含有至少一個氨基酸取代，其中親本非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶的氨基酸序列是SEQIDNO:l、2、3、4、5、7或8。2.-種通過在具有非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶活性的親本多肽中引入至少一個氨基酸取代獲得的PS4變體多肽，其中氨基酸取代選自參照SEQIDNO:l的位置編號的121F、121Y、146G、157M、161A、223E、229P、272Q、303E和309P。3.如權利要求1或2所述的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽，其中親本非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶缺少淀粉結合結構域。4.如權利要求1或2所述的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽，其中親本非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶是SEQIDNO:1或5。5.如權利要求1或2所述的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽，其中變體包含參照SEQIDN0:1的位置編號的一個或多個下述取代：121F、121Y、146G、157M、161A、223E、229P、272Q、303E和309P。6.如權利要求1或2所述的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽，其中變體選自下組：PSac-D34(SEQIDN0:2)、PSac-D20(SEQIDN0:3)、PSac-D14(SEQIDN0:4)、PStu-D34(SEQIDN0:8)、PStu-D20(SEQIDN0:9)、PStu-D14(SEQIDN0:10)、pMD55(SEQIDNO:13)、pMD96(SEQIDNO:14)、SSM381(SEQIDNO:15)、SSM279B1(SEQIDN0:16)、SSM237P2(SEQIDN0:17)、SEQIDN0:18、SSM325F3(SEQIDN0:19)、pMD129(SEQIDN0:20),SSM341A9(SEQIDNO:21),SSM341G11(SEQIDNO:22),SSM350B11(SEQIDN0:23),SSM350C12(SEQIDNO:24),SSM332Q4(SEQIDNO:25),SSM365B4(SEQIDN0:26)、SSM365F4(SEQIDN0:27)和SSM360C7(SEQIDN0:28)、SSM219B3、SAS1401L10、SAS1387D16bf、pMD236、pMD237bf、SAS1379013和SAS137909。7.如權利要求1或2所述的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽，其中親本非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶選自獲自假單胞菌屬，優(yōu)選嗜糖假單胞菌或施氏假單胞菌的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶。8.如權利要求7所述的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽，其中親本非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶獲自嗜糖假單胞菌。9.如權利要求1或2所述的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽，其中，與親本非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶相比，非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽顯示增加的熱穩(wěn)定性。10.如權利要求1或2所述的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽，其中，與親本非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶相比，非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽顯示增加的特異性活性。11.如權利要求1或2所述的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽，其中，與親本非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶相比，非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽既顯示增加的熱穩(wěn)定性又顯示增加的特異性活性。12.-種多核苷酸，其編碼權利要求1到11任一項所述的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽。13.-種載體，其包含權利要求12所述的多核苷酸。14.一種宿主細胞，其包含權利要求13所述的載體。15.如權利要求14所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是細菌細胞、真菌細胞或酵母細胞。16.-種酶組合物，其包含權利要求1到11任一項所述的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽。17.如權利要求16所述的酶組合物，其包含Novamyl。18.如權利要求16或17所述的酶組合物，其中酶組合物用于生面團產(chǎn)品以延遲或減弱生面團產(chǎn)品的陳化。19.一種在宿主細胞中生產(chǎn)非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽的方法，其包括在適于表達和生產(chǎn)非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽的條件下培養(yǎng)權利要求14或權利要求15所述的宿主細胞并生產(chǎn)非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽。20.如權利要求19所述的方法，其進一步包括從培養(yǎng)物回收非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽。21.-種制作烘焙產(chǎn)品的方法，其包括：(a)提供淀粉介質(zhì)；(b)向所述淀粉介質(zhì)中添加權利要求1-11任一項所述的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽；和（c)在步驟(b)之中或之后加熱所述淀粉介質(zhì)以生產(chǎn)烘焙產(chǎn)品。22.-種通過權利要求21所述的方法獲得的食品產(chǎn)品、飼料產(chǎn)品、生面團產(chǎn)品或烘焙產(chǎn)品。23.-種組合物，其包含面粉和權利要求1-11任一項所述的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽。24.-種食品產(chǎn)品、飼料產(chǎn)品、生面團產(chǎn)品或烘焙產(chǎn)品，其包含權利要求1-11任一項所述的非產(chǎn)麥芽糖外切型淀粉酶變體或PS4變體多肽?！疚臋n編號】C12N9/28GK104357424SQ201410136270【公開日】2015年2月18日申請日期:2005年7月7日優(yōu)先權日:2004年7月7日【發(fā)明者】卡斯珀·T·伯格,帕特里克·M·F·德克斯,卡羅爾·菲奧里西,吉斯伯特·格里茨,安賈·H·凱利特－史密斯,卡斯滕·M·克拉夫,劉巍,安德魯·肖,鮑·S·索倫森,夏洛特·R·索達爾申請人:杜邦營養(yǎng)生物科學有限公司,美國丹尼斯克公司