具有改良的氮利用和逆境耐性的植物的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物具有增加的氮利用效率、逆境耐性或者這二者且用新的載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，所述載體構(gòu)建體包含調(diào)節(jié)植物中氮利用的核酸序列。在各種實施方案中，所述載體構(gòu)建體包含選自如下一組的一或多個核酸序列：SEQ?ID?NO：2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36或者38。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化植物的分離的載體以及用于檢測轉(zhuǎn)化的植物的抗體。本發(fā)明還涉及在植物中表達核酸分子的方法，所述核酸分子相應(yīng)于調(diào)節(jié)植物中的氮利用或者由氮條件調(diào)節(jié)的核酸序列?！緦＠f明】具有改良的氮利用和逆境耐性的植物[0001]本申請是申請日為2007年10月27日的申請?zhí)枮?00780048109.0標題為“具有改良的氮利用和逆境耐性的植物”的申請的分案申請_2]相關(guān)申請的交叉參考[0003]本申請要求2006年10月27日申請的美國申請系列號60/854，927的優(yōu)先權(quán)，其全文引入本文做參考。發(fā)明領(lǐng)域[0004]本發(fā)明一般性涉及具有改良的氮利用和逆境耐性的植物，更特別涉及用改良逆境耐性和氮攝取、代謝或者這二者的基因轉(zhuǎn)化的玉米植物。_5]發(fā)明背景[0006]植物在其營養(yǎng)生長和生殖生長階段需要氮。氮通過土壤礦化、應(yīng)用氮肥或者這二者而可為植物所利用。然而估計應(yīng)用于農(nóng)作物的50%-70%的氮從植物-土壤系統(tǒng)中喪失[Peoples,M.B.etal.,“MmimizingGaseousLossesofNitrogen,，，InNitrogenFertilizerintheEnvironment(Bacon,PE.,ed.)MarceIDekker,pp.565-606(1995)]。氮是最昂貴的植物營養(yǎng)素之一，氮肥不總是可以以合理成本獲得且氮肥的過量應(yīng)用可導(dǎo)致徑流中的污染問題。玉米是通常需要氮肥以發(fā)揮其遺傳潛力的農(nóng)業(yè)重要植物的實例。[0007]發(fā)明概沭[0008]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物，該植物具有增加的氮利用效率、逆境耐性或者這二種性質(zhì)，其已經(jīng)使用包括調(diào)節(jié)植物中氮利用的核酸序列的新載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。本發(fā)明還涉及用以轉(zhuǎn)化植物的分離的載體以及涉及用于檢測轉(zhuǎn)化的植物中感興趣的核苷酸序列的表達的抗體。本發(fā)明還涉及在植物中表達相應(yīng)于調(diào)節(jié)植物中氮利用的核酸序列的核酸分子的方法。[0009]特別地，用于轉(zhuǎn)化植物的載體已經(jīng)使用選自如下的核苷酸序列構(gòu)建:SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30,SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDN0:36和SEQIDNO:38以及其變體、片段和互補序列。這些載體包含5’DNA啟動子序列和3’終止子序列，其中所述核酸序列、DNA啟動子序列和終止子序列是可操縱地連接的，以允許所述核苷酸序列轉(zhuǎn)錄。在一些實施方案中，所述啟動子序列可以是組成型植物啟動子或者組織特異性啟動子。[0010]本發(fā)明還包括多克隆抗體，包含由選自如下的核苷酸序列編碼的多肽的多克隆抗體:SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36以及SEQIDNO:38。[0011]本發(fā)明還包括用選自如下的一或多個核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物:SEQIDNO:2、SEQIDNO:4,SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:1USEQIDNO:13、SEQIDNO:15,SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32,SEQIDNO:34、SEQIDNO:36和SEQIDNO:38以及其變體和片段。所述植物選自水稻、玉米、大豆、蕓苔(canola)、小麥、苜猜、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、甘薯、豆(bean)、豌豆(pea)、馬鈴薯、油菜(oilseedrape)、高粱、飼草(foragegrass)、牧草(pasturegrass)、草坪草以及甘鹿。本發(fā)明還包括這種植物的組成部分、從這種植物產(chǎn)生的植物種子以及用本發(fā)明的載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物種子。[0012]本發(fā)明還包括用選自如下的一或多個核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞:SEQIDNO:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17,SEQIDNO:22,SEQIDNO:24,SEQIDNO:26,SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36以及SEQIDNO:38。所述宿主細胞可以是細菌細胞或者植物細胞。[0013]本發(fā)明還包括在植物中表達由氮調(diào)節(jié)的核酸分子的方法，所述方法包括提供用本發(fā)明的載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或者植物種子，以及在有效條件下生長所述轉(zhuǎn)基因植物或者由所述轉(zhuǎn)基因植物種子長成的植物，所述條件是在所述轉(zhuǎn)基因植物或者由所述轉(zhuǎn)基因植物種子長成的植物中表達所述核酸分子的條件。轉(zhuǎn)基因植物的生長有效增加所述轉(zhuǎn)基因植物或者由所述轉(zhuǎn)基因植物種子長成的植物的氮攝取，和/或增加所述轉(zhuǎn)基因植物或者由所述轉(zhuǎn)基因植物種子長成的植物的氮利用效率。本發(fā)明還包括前述方法，其中提供轉(zhuǎn)基因植物或者轉(zhuǎn)基因植物種子。本發(fā)明還包括前述方法，其中所述植物選自水稻、玉米、蕓苔、小麥、苜猜、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、甘薯、豆、豌豆、馬鈴薯、油菜、高粱、飼草、牧草、草坪草以及甘蔗。[0014]本發(fā)明還包括通過在植物中表達由氮調(diào)節(jié)的核酸分子而改良植物逆境耐性的方法，所述方法包括提供用本發(fā)明的載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或者植物種子并且在有效條件下生長所述轉(zhuǎn)基因植物或者由所述轉(zhuǎn)基因植物種子長成的植物，所述條件是在所述轉(zhuǎn)基因植物或者由所述轉(zhuǎn)基因植物種子長成的植物中表達所述核酸分子的條件。[0015]本發(fā)明還包括通過在植物中表達由氮調(diào)節(jié)的核酸分子而改變植物形態(tài)學(xué)的方法，所述方法包括提供用本發(fā)明的載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或者植物種子并且在有效條件下生長所述轉(zhuǎn)基因植物或者由所述`轉(zhuǎn)基因植物種子長成的植物的步驟，所述條件是在所述轉(zhuǎn)基因植物或者由所述轉(zhuǎn)基因植物種子長成的植物中表達所述核酸分子的條件。[0016]本發(fā)明還包括載體構(gòu)建體，其包含編碼選自SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:8、SEQIDNO:10,SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:16,SEQIDNO:18、SEQIDNO:23,SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35,SEQIDN0:37和SEQIDNO:39的氨基酸序列的核苷酸序列、5’DNA啟動子序列和3’終止子序列，其中所述核苷酸序列、DNA啟動子序列以及終止子序列可操縱地連接以允許所述核苷酸序列轉(zhuǎn)錄。[0017]本發(fā)明還包括包含由植物中氮調(diào)節(jié)的核苷酸序列的載體構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列選自核苷酸序列SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13,SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26,SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36和SEQIDNO:38;與如下核苷酸序列具有至少95%序列相同性的核苷酸序列:SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17,SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32,SEQIDNO:34、SEQIDNO:36或者SEQIDNO:38，其中所述核苷酸序列由植物中氮調(diào)節(jié)；編碼選自如下氨基酸序列的核苷酸序列:SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:23,SEQIDNO:25,SEQIDNO:27,SEQIDNO:29,SEQIDNO:3USEQIDNO:33、SEQIDNO:35,SEQIDNO:37和SEQIDNO:39;以及編碼與如下氨基酸序列具有至少95%序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列:SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35,SEQIDNO:37或者SEQIDNO:39，其中所述核苷酸序列由植物中氮調(diào)節(jié)；其中所述構(gòu)建體進一步包含5’DNA啟動子序列和3’終止子序列，其中所述核苷酸序列、DNA啟動子序列以及終止子序列是可操縱地連接的以允許所述核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。[0018]優(yōu)選實施方案詳述[0019]更有效利用氮的植物品種的開發(fā)將降低氮的過量施用、節(jié)約農(nóng)場主的生產(chǎn)成本、幫助不能獲得肥料的發(fā)展中國家的農(nóng)場主獲益并且降低與應(yīng)用過量氮肥相關(guān)的污染。一種已經(jīng)用于開發(fā)具有改良的氮利用的植物品種的方法依賴于常規(guī)的植物育種技術(shù)。[0020]需要開發(fā)更有效地吸收和利用氮的植物栽培種。植物學(xué)家已經(jīng)采用簡略語氮利用效率(NUE)，且已經(jīng)開發(fā)了各種測量和評估NUE的方法[CraswelI，E.T.andGodwin,D.C.(1984)Theefficiencyofnitrogenfertilizersappliedtocerealsgownindifferentclimates.1nAdvancesinPlantNutrition(Vol.1)(Tinker,P.B.andLauchli,A.,eds),pp.1-55,PraegerPublishers；Steenbjerg,FandJakobsen,S.T.(1963)Plantnutritionandyieldcurves.SoilSc1.95,69-90:Siddiqi,Μ.Y.andGlass,D.M.(1981)Utilizationindex:amodifiedapproachtotheestimationandcomparisonofnutrientutilizationefficiencyinplants.T.PlantNutr.4,289-302:Moll,R.H.etal.(1`982)Analysisandinterpretationoffactorswhichcontributetoefficiencyofnitrogenutilization.Agron.T.74,562-5641。在定義中有一些差異。一些定義基于總生物量，而其它定義基于產(chǎn)生的谷物的重量。另一組定義使用從土壤中提取氮的效率加以描述。用于改良谷物產(chǎn)量所應(yīng)用的氮的效率可以通過農(nóng)學(xué)利用率(AE)即生理學(xué)效率和利用效率的乘積或者攝取效率與利用效率的乘積NUEg進行測量。其它定義將生理學(xué)因素考慮在內(nèi)。[0021]如在本說明書中所用，術(shù)語氮利用效率或者NUE被定義為包括在同化途徑中任何主要氮代謝庫大小的可測量改變(例如可包括如下一或多項的可測量改變:硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、賴氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、酪氨酸、植物部分的總蛋白質(zhì)含量、植物部分的總氮含量和/或葉綠素含量)，或者植物示出在較低的施氮肥水平提供相同或提高的產(chǎn)量，或者植物示出當(dāng)與未用本發(fā)明的氮調(diào)節(jié)的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物相比時在相同施氮肥水平提供提高的產(chǎn)量。“可測量改變”可包括氮同化途徑的任何成分(代謝庫)的量的增加或降低。改變可包括所述途徑中一或多個代謝庫的降低或增加，或者一或多個庫的降低伴隨一或多個其它庫的增加，例如當(dāng)?shù)緩街幸粋€中間體被用于產(chǎn)生另一個中間體或者所述途徑的產(chǎn)物時。例如，在谷氨酸向谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化中，谷氨酸的水平可降低而谷氨酰胺的水平可增加。因此，雖然不受任何特別的理論或機制的束縛，一或多個這些庫中的任何改變均提示氮被植物更有效地利用。[0022]氮利用效率的增加可以與同化途徑中任何主要氮代謝庫大小中大約5%、大約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、大約200%或者更高的可測量改變相關(guān)。在一個實施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物當(dāng)與不含本發(fā)明的氮調(diào)節(jié)序列的植物相比時從環(huán)境攝取增加的氮?！暗{(diào)節(jié)序列”是指應(yīng)答暴露于氮而被調(diào)節(jié)(例如增加或降低，或者上調(diào)或下調(diào))的核苷酸或氨基酸序列，“調(diào)節(jié)氮利用的核苷酸序列”是指編碼與氮代謝相互作用的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。[0023]本發(fā)明進一步提供了通過在植物中表達一或多個氮調(diào)節(jié)核苷酸序列而改良植物逆境耐性的方法。在一個實施方案中，所述氮調(diào)節(jié)核苷酸序列是SEQIDN0:2、4、7、9、ll、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36或38，或者其變體和片段。在另一個實施方案中，所述氮調(diào)節(jié)核苷酸序列是編碼SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37或39的核苷酸序列，或者其變體和片段。[0024]如本文所用，術(shù)語“逆境(stress)”或“逆境條件(stresscondition)”是指植物、植物細胞等暴露于對植物的代謝、生長、發(fā)育、繁殖和/或存活(統(tǒng)稱“生長”)具有不利作用的物理或化學(xué)劑或者條件。逆境可以通過例如環(huán)境因素如水(例如灌溉、干旱、脫水)、厭氧條件(例如低水平氧)、異常滲透條件、鹽度或溫度(例如高熱/溫?zé)?、寒冷、嚴寒、霜?、營養(yǎng)素缺乏如氮缺乏或者暴露于污染物或者通過激素、第二信使或者其它分子而施加于植物。厭氧逆境例如是由于足以產(chǎn)生逆境應(yīng)答的氧水平降低(低氧或缺氧)。灌溉逆境可以是由于植物、植物部分、組織或分離的細胞在液體介質(zhì)中長期或短暫浸泡所致，例如在季風(fēng)、多雨季節(jié)、洪水或者過量灌溉植物等期間發(fā)生。寒冷逆境或者熱逆境可以是分別由于溫度從特定植物物種的最佳生長溫度范圍降低或升高而發(fā)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于確定且已知這種最佳生長溫度范圍。脫水逆境可以通過細胞、組織、器官或者完整植物的水分喪失、膨壓降低、或者水含量降低而引起。干旱逆境可由于水的匱乏或者供給細胞、組織、器官或生物體的水減少而引起或者與之相關(guān)。鹽逆境可以與細胞的胞內(nèi)或胞外環(huán)境的滲透壓波動相關(guān)或者由其引起。滲透逆境可以與例如植物細胞的胞內(nèi)或胞外環(huán)境中分子濃度的改變相關(guān)或者由其引起，特別是在所述分子不能穿過植物細胞膜而隔離(panitioned)的情況中。[0025]逆境耐性的改良可以在指定逆境條件下對植物性能進行任何定量或定性測量而評定并且與在相同逆境條件下生長的未用本發(fā)明的氮調(diào)節(jié)序列轉(zhuǎn)化的植物的性能進行對t匕。因此，所述植物可表現(xiàn)為改良的氮含量、改變的氨基酸或蛋白質(zhì)組成、健壯的生長特性、增加的營養(yǎng)體產(chǎn)量(vegetativeyield)或者更好的種子產(chǎn)量和品質(zhì)。這些植物可以通過檢查如下任何參數(shù)而鑒別:1)生長速度，根據(jù)濕重或干重的增長速度測量；2)成熟植物的營養(yǎng)體產(chǎn)量，根據(jù)鮮重或干重測量；3)種子或果實產(chǎn)量；4)種子或果實重量；5)植物的總氮含量；6)果實或種子的總氮含量；7)植物的游離氨基酸含量；8)果實或種子的游離氨基酸含量；9)植物的總蛋白質(zhì)含量；以及10)果實或種子的總蛋白質(zhì)含量。檢測這些參數(shù)的程序和方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這些方法可包括測量酶/蛋白質(zhì)水平的酶測定法和免疫測定法；測量各種植物組織的氨基酸組成、游離氨基酸庫或者總氮含量的測定法；根據(jù)鮮重隨著時間的增加測量生長速度；或者根據(jù)總干重和/或總種子重量測量植物產(chǎn)量。[0026]細菌或植物細胞的轉(zhuǎn)化[0027]本發(fā)明提供了新的核苷酸序列，其調(diào)節(jié)植物中氮利用效率。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。[0028]可以對本發(fā)明的氮調(diào)節(jié)核苷酸序列進行修飾以獲得或者增強在植物細胞中的表達。本發(fā)明的氣調(diào)節(jié)序列可以提供在表達盒中以在感興趣的植物中表達?！爸参锉磉_盒”包括能導(dǎo)致在植物細胞中從開放讀框中表達蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體。所述盒包括5'-3'轉(zhuǎn)錄方向的與本發(fā)明的DNA序列可操縱地連接的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(即啟動子)以及在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即終止區(qū))。所述盒可另外含有被共轉(zhuǎn)化進生物體中的至少一個其它基因，如選擇標記基因。或者，所述其它基因可以提供在多個表達盒上。這種表達盒具有多個限制位點，用以插入氮調(diào)節(jié)序列使之在調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下。[0029]“啟動子”是指發(fā)揮指導(dǎo)下游編碼序列轉(zhuǎn)錄功能的核酸序列。啟動子與其它轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸序列(也稱作控制序列)在一起是感興趣的DNA序列表達所必需的。優(yōu)選地，啟動子是已知在導(dǎo)入了本發(fā)明的核苷酸序列的生物體中刺激轉(zhuǎn)錄的啟動子。[0030]啟動子與植物宿主和/或本發(fā)明的DNA序列可以是天然的或者類似的，或者是外源或異源的。另外，啟動子可以是天然序列或者是合成序列。在啟動子與植物宿主是“天然”或者“同源”的情況中，所述啟動子是指在導(dǎo)入所述啟動子的天然植物中發(fā)現(xiàn)的啟動子。在啟動子與本發(fā)明的DNA序列是“外源”或者“異源”的情況中，所述啟動子是指與本發(fā)明的DNA序列可操縱地連接的非天然或非自然發(fā)生的啟動子。“異源”通常是指核酸序列與其存在于之中的細胞或者天然基因組的一部分不是內(nèi)源的核酸序列，但是已經(jīng)通過感染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔、顯微轟擊(microproiection)等技術(shù)加入細胞中?！翱刹倏v地連接”是指啟動子與第二個序列之間的功能性連接，其中所述啟動子序列起始并介導(dǎo)相應(yīng)于第二個序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。通?！翱刹倏v地連接”是指連接的核酸序列是鄰近的，且在需要連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)的情況中是鄰近并且位于相同讀框中。[0031]在一個實施方案中，啟動子是組成型啟動子。用于植物中的合適的組成型啟動子包括:來自植物病毒的啟動子，如花生褪綠條死病花椰菜花葉病毒(chloroticstreakcaulimovirus,PCISV)啟動子(美國專利N0.5，850，019);花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子(Odelletal.(1985)Nature313=810-812);小球藻病毒甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動子(美國專利N0.5，563，328)以及玄參花葉病毒(FMV)全長轉(zhuǎn)錄啟動子(美國專利N0.5,378,619);如水稻肌動蛋白這樣的基因啟動子(McElroyetal.(1990)PlantCell2:163-171);遍在蛋白基因啟動子(Christensenetal.(1989)PlantMol.Biol.12:619-632和Christensenetal.(1992)PlantMol.Biol.18:675-689)，包括TrpPro5啟動子(美國專利申請N0.10/377,318;2005年3月16日提請)；pEMU啟動子(Lastetal.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588);MAS啟動子(Veltenetal.(1984)EMBOJ.3:2723-2730);玉米H3組蛋白啟動子(Lepetitetal.(1992)Mol.Gen.Genet.231:276_285和Atanassovaetal.(1992)PlantJ.2(3):291-300)；歐洲油菜(Brassicanapus)ALS3(PCT申請W097/41228)；以及各種農(nóng)桿菌基因的啟動子(見美國專利N0.4，771，002,5,102，796,5,182，200和5，428，147)。[0032]在另一個實施方案中，啟動子是組織特異性啟動子。常用的組織特異性啟動子的列表可見于Mooreetal.(2006)PlantJ.45(4):651-683中的綜述，該文獻以其全部內(nèi)容并入本文作參考。[0033]這種構(gòu)建體通常也含有5'和3'非翻譯區(qū)。這種構(gòu)建體可含有“信號序列”或者“前導(dǎo)序列”以促進感興趣的肽的共翻譯或者翻譯后轉(zhuǎn)運至一定的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)如葉綠體(或者其它質(zhì)體)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者高爾基體或者被分泌。例如，基因可以被工程化為含有信號肽以促進肽轉(zhuǎn)移進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。“信號序列”是指已知或者推測導(dǎo)致共翻譯或翻譯后的肽轉(zhuǎn)運穿過細胞膜的序列。在真核細胞中，這典型包括分泌進高爾基體中，一些導(dǎo)致糖基化?！扒皩?dǎo)序列”是指這樣的任何序列，當(dāng)其被翻譯時導(dǎo)致氨基酸序列足以觸發(fā)肽鏈共翻譯轉(zhuǎn)運至亞細胞細胞器。因此，其包括通過進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、進入液泡、質(zhì)體包括葉綠體、線粒體等而靶向轉(zhuǎn)運和/或糖基化的前導(dǎo)序列。。也可以優(yōu)選工程化植物表達盒使其含有內(nèi)含子，由此內(nèi)含子的mRNA加工為表達所需。[0034]“3'非翻譯區(qū)”是指位于編碼序列下游的核苷酸序列。多腺苷酸化信號序列及編碼能影響mRNA前體3'末端添加聚腺苷酸段(tracts)的調(diào)節(jié)信號的其它序列是3'非翻譯區(qū)?！?,非翻譯區(qū)”是指位于編碼序列上游的核苷酸序列。[0035]其它上游或下游非翻譯元件包括增強子。增強子是增強啟動子區(qū)域表達的核苷酸序列。增強子為本領(lǐng)域所熟知，包括但不限于SV40增強子區(qū)域和35S增強子元件。[0036]終止區(qū)與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可以是天然的，可以與本發(fā)明的氮調(diào)節(jié)序列是天然的，或者可以衍生自另一來源。實用的終止區(qū)可得自根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)的T1-質(zhì)粒,如章魚堿合酶及胭脂氨酸合成酶終止區(qū)，或者馬鈴薯蛋白酶抑制劑II序列(PinlI)，如Liuetal.(2004)ActaBiochimBiophysSin36(8):553-558所述。也見于Guerineauetal.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell64:671-674；Sanfaconetal.(1991)GenesDev.5:141-149;Mogenetal.(1990)PlantCell2:1261-1272;Munroeetal.(1990)Gene91:151-158；Ballasetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:7891-7903；以及Joshietal.(1987)NucleicAcidRes.15:9627-9639。[0037]在適當(dāng)情況下，可以優(yōu)`化基因以增加在轉(zhuǎn)化的宿主細胞中的表達。也就是說，基因可以通過使用改良表達的宿主細胞優(yōu)選密碼子合成，或者可以通過使用宿主優(yōu)選的密碼子使用頻率的密碼子合成。通?；虻腉C含量將增加。見例如CampbellandGowri(1990)PlantPhysiol.92:1-11論述的宿主優(yōu)選的密碼子使用。本領(lǐng)域已知合成宿主優(yōu)選的基因的方法。見例如美國專利N0.6，320，100,6,075，185,5,380，831和5，436，391，美國公布的申請N0.20040005600和20010003849，以及Murrayetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:477-498，所述文獻在此并入本文作參考。[0038]在一個實施方案中，感興趣的核酸靶向葉綠體以表達。在這種方式中，在感興趣的核酸未直接插入葉綠體中時，表達盒將另外含有編碼轉(zhuǎn)運肽的核酸以指導(dǎo)感興趣的基因產(chǎn)物到達葉綠體。這種轉(zhuǎn)運肽為本領(lǐng)域所已知。見例如VonHeijneetal.(1991)PlantMol.Biol.Rep.9:104-126；Clarketal.(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppaetal.(1987)PlantPhysiol.84:965-968；Romeretal.(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；以及Shahetal.(1986)Science233:478-481所述。[0039]被靶向于葉綠體的感興趣的核酸可以優(yōu)化為在葉綠體中表達，以解決在植物細胞核與該細胞器之間密碼子使用中的差異。在這種方式中，感興趣的核酸可以通過使用葉綠體優(yōu)選密碼子合成。見例如在此并入作參考的美國專利N0.5，380，831所述。[0040]典型地，這種“植物表達盒”被插入“植物轉(zhuǎn)化載體”中。“轉(zhuǎn)化載體”是指細胞有效轉(zhuǎn)化必需的DNA分子。這種分子可以由一或多個表達盒組成，且可以組織成一個以上的“載體”DNA分子。例如二元載體是這樣的植物轉(zhuǎn)化載體，其利用兩個非鄰近的DNA載體編碼植物細胞轉(zhuǎn)化所有必需的順式和反式作用功能(HellensandMullineaux(2000)TrendsinPlantScience5:446-451)。“載體”是指設(shè)計為在不同宿主細胞之間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體?！氨磉_載體”是指在外源細胞中具有摻入、整合及表達異源DNA序列或片段能力的載體。[0041]這種植物轉(zhuǎn)化載體可以包含為實現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化所需的一或多個DNA載體。例如，本領(lǐng)域通常利用包含一個以上連續(xù)DNA節(jié)段的植物轉(zhuǎn)化載體。本領(lǐng)域通常將這些載體稱作“二元載體”。二元載體以及具有輔助質(zhì)粒的載體最常用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中實現(xiàn)有效轉(zhuǎn)化所需的DNA節(jié)段的大小和復(fù)雜性非常大，且有利于區(qū)別各個DNA分子的功能。二元載體典型含有質(zhì)粒載體，其含有T-DNA轉(zhuǎn)移所需的順式作用序列(如左邊界和右邊界)、被工程化能在植物細胞中表達的選擇標記，以及“感興趣的核苷酸序列”(被工程化能在希望產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的植物細胞中表達的核苷酸序列)。在這個質(zhì)粒載體上還存在細菌復(fù)制所需的序列。順式作用序列的排列方式是使得有效轉(zhuǎn)移進植物細胞中并且在其中表達。例如，選擇標記基因和感興趣的基因位于左邊界與右邊界之間。通常第二個質(zhì)粒載體含有反式作用因子，其介導(dǎo)T-DNA從農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至植物細胞。如本領(lǐng)域所已知，這個質(zhì)粒通常含有毒力功能(Vir基因)，使得農(nóng)桿菌感染植物細胞，并且通過在邊界序列裂解以及vir-介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移而轉(zhuǎn)移DNA(HellensandMulIineaux(2000)TrendsinPlantScience,5:446-451)。一些類型的農(nóng)桿菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用于植物轉(zhuǎn)化。第二個質(zhì)粒載體對于通過其它方法例如是顯微轟擊、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇法等轉(zhuǎn)化植物不是必需的。[0042]可用于本發(fā)明構(gòu)建體中的改變或改良的變體[0043]可用于本發(fā)明中的`核苷酸序列和氨基酸序列可以通過各種方法改變，而且這些改變可產(chǎn)生編碼蛋白質(zhì)的序列，所述蛋白質(zhì)與由本文揭示的氮調(diào)節(jié)序列編碼的蛋白質(zhì)具有不同的氨基酸序列。[0044]可用于本發(fā)明的核苷酸序列包括SEQIDNO:2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36和38所示序列，以及其變體、片段和互補序列。如本文所用，術(shù)語“核苷酸序列”或者“核酸分子”包括DNA分子(例如cDNA或者基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈分子但優(yōu)選是雙鏈DNA。“互補序列”是指與指定核苷酸序列充分互補的核苷酸序列，由此其可以與指定核苷酸序列雜交，從而形成穩(wěn)定雙鏈體。由這些核苷酸序列編碼的氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的相應(yīng)氨基酸序列示于SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37和39，以及其變體和片段。本發(fā)明還包含如下核酸分子的應(yīng)用，所述核酸分子包含編碼部分長度的氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的核苷酸序列及其互補序列。[0045]是這些氮調(diào)節(jié)核苷酸序列的片段的核酸分子也可用于本發(fā)明?！捌巍笔侵妇幋a氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可編碼氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性部分，或者其可以是在下文所述方法中可用作雜交探針或PCR引物的片段。是氮調(diào)節(jié)核苷酸序列的片段的核酸分子根據(jù)指定用途包含本文揭示的全長氮調(diào)節(jié)核苷酸序列的至少大約15、20、50、75、100、200、300、350或者至少大約400個連續(xù)的核苷酸或者直至全長序列核苷酸?！斑B續(xù)”核苷酸是指彼此緊密相鄰的核苷酸殘基。[0046]是這些氮調(diào)節(jié)多肽的片段的多肽也可用于本發(fā)明中。“片段”是指編碼SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分，且其保留氮利用效率。氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性部分可以是這樣的多肽，即例如長度為10、25、50、100、125、150、175、200、250、300、350、400或更多個氨基酸。這種生物學(xué)活性部分可以通過重組技術(shù)制備，并評估其氮利用效率。如本文所用，片段包含SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示序列的至少8個連續(xù)氨基酸。然而，本發(fā)明也包含其它片段，如超過大約10、20、30、50、100、150、200、250、300、350或400個氨基酸的任何蛋白質(zhì)片段。[0047]本發(fā)明還包含變體核酸分子或者變體氨基酸序列在本發(fā)明的方法和組合物中的應(yīng)用。氮調(diào)節(jié)核苷酸序列的“變體”包括那些序列，其編碼本文揭示的氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)但是由于遺傳密碼的簡并性而有所不同的序列，以及與上述序列基本相同的那些序列。天然發(fā)生的等位基因變體可以通過熟知的分子生物學(xué)技術(shù)鑒別，例如在下文概述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體核苷酸序列還包括通過合成獲得的核苷酸序列，其已經(jīng)例如通過使用定點誘變技術(shù)產(chǎn)生但是其仍編碼本發(fā)明揭示的氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，如下文論述?？捎糜诒景l(fā)明中的變體蛋白質(zhì)是生物學(xué)活性的，即其保留希望的天然蛋白質(zhì)生物學(xué)活性，即氮利用效率和/或改良的逆境耐性。[0048]“變體”是指具有與SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示氨基酸序列具有至少大約60%、65%、大約70%、75%、80%、85%、或者90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者99%相同性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽。變體還包括由在嚴格條件下與SEQIDNO:2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36或38所示核酸分子或其互補序列雜交的核酸分子編碼的多肽。變體包括由于誘變而導(dǎo)致氨基酸序列不同的多肽。本發(fā)明涵蓋的變體蛋白質(zhì)是生物學(xué)活性的，即其仍具有天然蛋白質(zhì)的希望的生物學(xué)活性，即保留氮利用效率和/或改良的逆境耐性。[0049]可用于本發(fā)明中的優(yōu)選的氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)由與SEQIDNO:2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36或38所示核苷酸序列基本相同的核苷酸序列編碼。術(shù)語“基本相同的”是指利用本文描述的序列對比程序之一使用標準參數(shù)與參考序列相比具有至少大約60%或65%序列相同性、大約70%或75%序列相同性、大約80%或85%序列相同性、或者大約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相同性的氨基酸或核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到可以對這些值適當(dāng)調(diào)節(jié)以通過考慮到密碼子簡并性、氨基酸相似性、讀框位置等因素確定由兩個核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)相同性。[0050]為了確定兩個氨基酸序列或者兩個核酸的相同性百分比，對序列進行排列以進行最佳對比。兩個序列之間的相同性百分比是所述序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即相同性百分比=相同位置數(shù)/總位置數(shù)(例如重疊位置)X100)。在一個實施方案中，兩個序列是相同長度的。兩個序列之間的相同性百分比可以使用與下文描述的那些相似的技術(shù)確定，允許或不允許缺口。在計算相同性百分比時，典型計算精確匹配。[0051]兩個序列之間的相同性百分比的確定可以使用數(shù)學(xué)算法完成。用于對比兩個序列的數(shù)學(xué)算法的非限制性例子是KarlinandAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2264中描述的算法，由KarlinandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877加以修改。將這種算法與Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403所述的BLASTN和BLASTX程序組合。BLAST核苷酸檢索可以利用BLASTN程序進行，score=100、wordlength=12,以獲得與本發(fā)明氮調(diào)節(jié)核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以利用BLASTX程序進行，score=50、wordlength=3,以獲得與本發(fā)明氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得缺口對比以進行對比，可以利用Altschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389所述的GappedBLAST?；蛘?，可以使用PS1-Blast進行重復(fù)檢索，檢測分子之間的距離關(guān)系。見Akschuletal.(1997)Supra0當(dāng)利用BLAST、GappedBLAST和PS1-Blast程序時，可以使用各自程序(例如BLASTX和BLASTN)的默認參數(shù)。見WWW.ncb1.nlm.nih.gov。用于序列對比的另一個數(shù)學(xué)算法的非限制性例子是ClustalW算法(Higginsetal.(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-4680)。ClustalW對比序列并排列對比了完整氨基酸或DNA序列，因此可以提供關(guān)于完整氨基酸序列的序列保守性數(shù)據(jù)。ClustalW算法用于一些可商購的DNA/氨基酸分析軟件包中，例如theVectorNTIProgramSuite的ALIGNX模塊(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)。在利用ClustalW進行氨基酸序列排列對比之后，可以確定氨基酸相同性百分比。用于分析ClustalW序列對比的一個非限制性軟件程序例子是GENED0C?。GENED0C?(KarlNicholas)可以評定多個蛋白質(zhì)之間的氨基酸(或DNA)相似性和相同性。用于序列對比的數(shù)學(xué)算法的另一個非限制性例子是MyersandMiller(1988)CAB10S4所述算法。將這個算法與ALIGN程序(2.0版)組合，后者是GCG序列對比軟件包(得自Accelrys,Inc.,9865ScrantonRd.，SanDiego,California,USA)的一部分。當(dāng)利用ALIGN程序?qū)Ρ劝被嵝蛄袝r，可以使用PAMl20權(quán)重殘基表(weightresiduetable)、缺口長度罰分為12以及缺口罰分為4。[0052]優(yōu)選的程序是GAPversionlO,其使用NeedlemanandWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453所述算法。GAPVersionlO可以使用如下參數(shù):核苷酸序列的相同性百分比和相似性百分比使用GAPWeight為50和LengthWeight為3,以及nwsgapdna.cmp評分矩陣；氨基酸序列的相同性百分比和相似性百分比使用GAPWeight為8和LengthWeight為2，以及BL0SUM62評分矩陣。也可以使用等價程序?！暗葍r程序”是指這樣的任何序列對比程序，其對于質(zhì)詢的兩個序列`而言，當(dāng)與通過GAPVersionlO產(chǎn)生的相應(yīng)序列排列對比結(jié)果進行對比時，產(chǎn)生具有相同核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同序列相同性百分比的序列對比結(jié)果。[0053]技術(shù)人員會進一步意識到在本發(fā)明的核苷酸序列中可以通過突變導(dǎo)入變化，從而導(dǎo)致編碼的氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的氨基酸序列變化，而不改變所述蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。因此，變體分離的核酸分子可以通過在本文揭示的相應(yīng)核苷酸序列中導(dǎo)入一或多個取代、添加或者缺失而產(chǎn)生，由此在編碼的蛋白質(zhì)中導(dǎo)入一或多個氨基酸取代、添加或缺失。可以通過標準技術(shù)導(dǎo)入突變，例如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。這種變體核苷酸序列也包含在本發(fā)明中。[0054]例如，保守氨基酸取代可以在一或多個預(yù)定的、優(yōu)選非必需氨基酸殘基進行?！胺潜匦琛卑被釟埢窃诘{(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的野生型序列中可以被改變但是不改變生物學(xué)活性的殘基，而“必需”氨基酸殘基是為生物活性所必需的殘基?！氨Ｊ匕被崛〈笔瞧渲邪被釟埢删哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基置換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中有詳細說明。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側(cè)鏈氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，無電荷極性側(cè)鏈氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-分支側(cè)鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳族側(cè)鏈氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。保留功能的氨基酸取代可以在非保守區(qū)域進行。通常這種取代不是針對保守氨基酸殘基或者保守基序中的氨基酸殘基進行，這種殘基是蛋白質(zhì)活性必需的。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員理解功能變體在保守殘基中可具有少量保守或非保守的改變。保守的且為蛋白質(zhì)活性必需的殘基的例子包括例如在已知參與氮同化作用的相似或相關(guān)序列的對比中包含的在所有蛋白質(zhì)之間均相同的殘基。保守的但是可允許保守氨基酸取代且仍保留活性的殘基的例子包括例如在已知參與氮同化作用的相似或相關(guān)序列的對比中包含的在所有蛋白質(zhì)之間僅具有保守取代的殘基。[0055]或者，變體核苷酸序列可以通過沿著所有或部分編碼序列隨機導(dǎo)入突變例如通過飽和誘變而產(chǎn)生，對所得突變體篩選賦予氮利用效率的能力以鑒別保留活性的突變體。在誘變之后，編碼的蛋白質(zhì)可以重組表達，蛋白質(zhì)的活性可以通過使用標準測定技術(shù)確定。[0056]使用例如PCR、雜交等方法可以鑒別相應(yīng)的氮調(diào)節(jié)序列，這種序列與本發(fā)明的序列基本相同。見例如SambrookJ.,andRussell,D.w.(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)以及Innis,etal.(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,NY)。在雜交方法中，所有或部分氮調(diào)節(jié)核苷酸序列可用于篩選cDNA或基因組文庫。構(gòu)建這種cDNA和基因組文庫的方法為本領(lǐng)域所已知,在SambrookandRussell,2001,supra中揭示。[0057]本發(fā)明的核苷酸或氨基酸序列的變體或片段通常編碼保留全長氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性(即保留氮利用效率)的蛋白質(zhì)片段?！氨Ａ舻眯省笔侵杆鲎凅w或片段具有SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示全長氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)或者SEQIDNO:`2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36、或38所示全長氮調(diào)節(jié)核苷酸序列的至少大約30%、至少大約50%、至少大約70%或者至少大約80%的氮利用效率和/或逆境耐性。監(jiān)測氮利用效率的方法包括檢測同化途徑中任何主要氮代謝庫大小的變化(例如硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、賴氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、酪氨酸、植物部分的總蛋白質(zhì)含量、植物部分的總氮含量和/或葉綠素含量中可測量的變化)或者檢測與不含有或者不表達本發(fā)明的氮調(diào)節(jié)序列的植物相比，植物以較低的氮肥水平提供相同或增加的產(chǎn)量的能力或者植物在相同氮肥水平提供增加的產(chǎn)量的能力。“相同”或“較低”氮肥水平是指通常應(yīng)用于不表達本發(fā)明的氮調(diào)節(jié)序列的植物的氮的水平。本領(lǐng)域已知大多數(shù)(如果不是所有)感興趣的植物品種的足夠的氮水平。其它指導(dǎo)可見于例如Hewitt(1966)SandandWaterCultureMethodsUsedintheStudyofPlantNutrition,2nded.,FamhamRoyal(Bucks),CommonwealthAgriculturalBureaux;以及Hewitt(1975)PlantMineralNutrition,London,EnglishUniversityPress。[0058]可用于本發(fā)明中的多肽序列可以通過各種方式改變，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。這種處理方法為本領(lǐng)域所已知。例如，本文揭示的氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的氨基酸序列變體可以通過核苷酸序列中的突變而制備。這也可以通過各種形式的誘變和/或定向進化中的一種實現(xiàn)。在一些情況中，氨基酸序列中編碼的改變基本上不影響蛋白質(zhì)的功能。這種變體具有希望的氮利用效率。然而，本發(fā)明的氮調(diào)節(jié)序列改變或改良氮利用的能力可以通過使用這種技術(shù)之一在本發(fā)明組合物上進一步改良。例如，可以在DNA復(fù)制期間呈現(xiàn)高比率堿基錯摻入的宿主細胞例如XL-1Red(Stratagene，LaJolla,CA)中表達本文揭示的核苷酸序列。在這種菌株增殖之后，可以分離DNA(例如通過制備質(zhì)粒DNA或者通過PCR擴增以及將所得PCR片段克隆進載體中)，如本文在別處所述將DNA轉(zhuǎn)化進植物中并測量氮利用效率。[0059]或者，可以在氨基或羧基末端對許多蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列進行改變而基本不影響其活性。這可包括通過現(xiàn)代分子學(xué)方法導(dǎo)入的插入、缺失或者改變，所述分子學(xué)方法例如為PCR,包括依靠在PCR擴增中使用的寡核苷酸中包含氨基酸編碼序列而改變或延伸蛋白質(zhì)編碼序列的PCR擴增?；蛘?，加入的蛋白質(zhì)序列可包括完整的蛋白質(zhì)編碼序列，如本領(lǐng)域常用于產(chǎn)生融合蛋白的那些序列。這種融合蛋白通常用于(I)增加感興趣的蛋白質(zhì)的表達，(2)導(dǎo)入結(jié)合結(jié)構(gòu)域、酶活性或者表位以促進蛋白質(zhì)純化、蛋白質(zhì)檢測或者本領(lǐng)域已知的其它實驗性應(yīng)用，或者(3)使蛋白質(zhì)靶向亞細胞細胞器分泌或翻譯，例如靶向革蘭氏陰性細菌的周質(zhì)空間或者真核細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，后者通常導(dǎo)致蛋白質(zhì)糖基化。[0060]本發(fā)明的變體核苷酸和氨基酸序列還包含衍生自誘變和重組程序如DNA改組的序列。使用這種程序，一或多個不同的氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼區(qū)可用于產(chǎn)生具有希望性質(zhì)的新的氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)。以這種方式，從包含具有充分的序列相同性且可以在體外或體內(nèi)同源重組的序列區(qū)域的一群相關(guān)序列多核苷酸中產(chǎn)生重組多核苷酸文庫。例如，使用這種方法，編碼感興趣的結(jié)構(gòu)域的序列基序在用于本發(fā)明中的氮調(diào)節(jié)序列與其它已知的氮調(diào)節(jié)序列之間可以改組以獲得編碼具有改良的感興趣的性質(zhì)如改良的氮利用的蛋白質(zhì)的新序列。本領(lǐng)域已知這種DNA改組的方法。見例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:10747-10751,Stemmer(1994)Nature370:389-391,Cramerietal.(1997)NatureBiotech.15:436_438、Mooreetal.(1997)J.Mol.Biol.272:336_347、Zhangetal.(1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:4504-4509>Cramerietal.(1998)Nature391:288-291以及美國專利N0.5，605，793和5，837，458所述。[0061]棺物轉(zhuǎn)化[0062]本發(fā)明的方法包括在植物中導(dǎo)入一或多個氮調(diào)節(jié)核苷酸序列。在一些實施方案中，僅一個本發(fā)明揭示的氮調(diào)節(jié)序列被導(dǎo)入植物中。在其它實施方案中，導(dǎo)入至少2個、至少3個、至少4個或者更多個所述序列。在導(dǎo)入多個序列的情況中，每個核苷酸序列均不相同。如果兩個核苷酸序列在至少一個核苷酸位置不同則認為這兩個序列是不相同的。因此，不相同的核苷酸序列包括編碼相同氨基酸序列的兩或多個不同的核苷酸序列(例如已經(jīng)優(yōu)化以在植物中表達的一或多個)以及編碼至少兩個不同氨基酸序列的兩或多個不同的核苷酸序列。[0063]“導(dǎo)入”是指為植物提供包含一或多個氮調(diào)節(jié)序列的一或多個構(gòu)建體，由此所述構(gòu)建體得以進入植物細胞的內(nèi)部。本發(fā)明的方法不需要使用將核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物的特殊方法，僅是所述核苷酸構(gòu)建體得以進入至少一個植物細胞的內(nèi)部即可。將核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物中的方法為本領(lǐng)域所已知，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時轉(zhuǎn)化方法以及病毒介導(dǎo)的方法。[0064]通常植物轉(zhuǎn)化方法包括將異源DNA轉(zhuǎn)移進靶植物細胞(例如不成熟或成熟胚，懸浮培養(yǎng)物、未分化的愈傷組織、原生質(zhì)體等)中，隨后應(yīng)用最大閾值水平的合適選擇(依賴于選擇標記基因)從未轉(zhuǎn)化的一組細胞中回收轉(zhuǎn)化的植物細胞。典型將外植體轉(zhuǎn)移至新鮮供應(yīng)的相同培養(yǎng)基中并常規(guī)培養(yǎng)。隨后，轉(zhuǎn)化的細胞在被置于補加了最大閾值水平選擇劑(即抗生素，如壯觀霉素和卡那霉素)的再生培養(yǎng)基中之后分化為芽(shoot)。然后將芽轉(zhuǎn)移至選擇性生根培養(yǎng)基中以回收生根的芽或小植物。隨后使該轉(zhuǎn)基因小植物生長為成熟植物并產(chǎn)生能育種子(例如Hieietal.(1994)ThePlantJournal6=271-282；Ishidaetal.(1996)NatureBiotechnologyl4:745-750所述)。將外植體轉(zhuǎn)移至新鮮供應(yīng)的相同培養(yǎng)基中并常規(guī)培養(yǎng)。關(guān)于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)和方法的一般描述見AyresandPark(1994)CriticalReviewsinPlantSciencel3:219-239和BommineniandJauhar(1997)Maydica42:107-120所述。由于轉(zhuǎn)化的材料含有許多細胞，因此轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的細胞均存在于任何選定的靶愈傷組織或組織或細胞中。殺死未轉(zhuǎn)化的細胞并且使得轉(zhuǎn)化的細胞增殖的能力產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物培養(yǎng)物。通常除去未轉(zhuǎn)化的細胞的能力是對快速回收轉(zhuǎn)化的植物細胞以及成功產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的一個限制。然后可以使用分子和生物化學(xué)方法證實轉(zhuǎn)基因植物的基因組中整合的感興趣的異源基因的存在。[0065]轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生可以通過許多方法進行，所述方法包括但不限于通過農(nóng)桿菌在植物細胞中導(dǎo)入異源DNA(農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)、用與粒子附著的異源外源DNA轟擊植物細胞以及各種其它非粒子直接介導(dǎo)的方法(例如Hieietal.(1994)ThePlantJournal6:271-282；Ishidaetal.(1996)NatureBiotechnologyl4:745-750；AyresandPark(1994)CriticalReviewsinPlantSciencel3:219-239；RommineniandJauhar(1997)Maydica42:107-120所述)轉(zhuǎn)移DNA。[0066]轉(zhuǎn)化葉綠體的方法為本領(lǐng)域所已知。見例如Svabetal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:8526-8530；SvabandMaliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:913-917；SvabandMaliga(1993)EMBOJ12:601-606所述。所述方法依賴于基因槍輸送含有選擇標記的DNA并且通過同源重組使得所述DNA靶向于質(zhì)體基因組。此外，質(zhì)體轉(zhuǎn)化可以通過核編碼的及質(zhì)體指導(dǎo)的RNA聚合酶的組織優(yōu)選表達反式激活沉默的質(zhì)體攜帶轉(zhuǎn)基因而實現(xiàn)。這種系統(tǒng)已經(jīng)在Mcfcideetal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:7301-7305中報道。[0067]細菌細胞的轉(zhuǎn)化是通過本領(lǐng)域已知的一些技術(shù)實現(xiàn)的，所述技術(shù)包括但不限于電穿孔或者化學(xué)轉(zhuǎn)化(見例如Ausubel,ed.(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Inc.，Indianapolis,IN所述)。賦予對毒性物質(zhì)抗性的標記可用于從未轉(zhuǎn)化的細胞(不含有或者不表達檢測DNA的那些細胞)中鑒別轉(zhuǎn)化的細胞(含有及表達檢測DNA的細胞)。[0068]在本發(fā)明的一個方面中，本發(fā)明的核苷酸序列可用作標記以評定細菌或植物細胞的轉(zhuǎn)化。在這種方式中，轉(zhuǎn)化是通過如上述監(jiān)測氮利用效率評定。[0069]植物細胞的轉(zhuǎn)化可以通過相似方式實現(xiàn)?！爸参铩笔侵竿暾参锘蛘咧参锏慕M成部分包括植物器官(例如葉、莖干、根等)、種子、植物細胞、繁殖體、胚和后代。植物細胞可以是分化的或者未分化的(例如愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細胞、原生質(zhì)體、葉細胞、根細胞、韌皮部細胞、花粉)?！稗D(zhuǎn)基因植物”或者“轉(zhuǎn)化的植物”或者“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”植物或者細胞或者組織是指在植物細胞中已經(jīng)摻入或者整合了外源核酸序列或者DNA片段的植物?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”是指導(dǎo)入植物中的核苷酸構(gòu)建體整合進植物的基因組中且能被植物后代遺傳。[0070]已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞可以根據(jù)常規(guī)方式生長為植物。見例如McCormicketal.(1986)PlantCellR印orts5:81-84所述。然后使這些植物生長，并且用相同的轉(zhuǎn)化植株或者不同的植株授粉，鑒別組成型表達希望的表型特征的所得雜交體。生長兩或多個世代以保證希望的表型特征的表達得以穩(wěn)定保持和遺傳，然后收獲種子以保證希望的表型特征的表達已經(jīng)實現(xiàn)。以這種方式，本發(fā)明提供了在其基因組中穩(wěn)定摻入本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體例如本發(fā)明的表達盒的轉(zhuǎn)化的種子(也稱作“轉(zhuǎn)基因種子”)。[0071]通過調(diào)節(jié)氮利用增加植物產(chǎn)暈的方法[0072]本發(fā)明提供了增加植物產(chǎn)量的方法。所述方法包括將本發(fā)明揭示的氮調(diào)節(jié)核苷酸序列導(dǎo)入植物或者植物細胞中，由此氮利用效率的增加相應(yīng)于植物產(chǎn)量的增加。如本文所定義，植物的“產(chǎn)量”是指由植物產(chǎn)生的生物量的質(zhì)量和/或數(shù)量。“生物量”是指任何測量的植物產(chǎn)物(例如植物的任何組成部分，如種子、莖、根、谷粒、葉等)。生物量生產(chǎn)中的增加是測量的植物產(chǎn)物的產(chǎn)量的任何改良。植物產(chǎn)量增加具有一些商業(yè)用途。例如，植物葉生物量的增加可增加為人和動物消費的葉類植物的產(chǎn)量。此外，葉生物量的增加可用于增加產(chǎn)生得自植物的藥物或工業(yè)產(chǎn)品。產(chǎn)量的增加可包括具有任何統(tǒng)計學(xué)意義的增加，包括但不限于與其中未導(dǎo)入本發(fā)明的調(diào)節(jié)氮利用的核苷酸序列的植物的產(chǎn)量相比，所述植物的產(chǎn)量增加至少1%、至少3%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少50%、至少70%、至少100%或更高。[0073]植盤[0074]本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)化任何植物物種，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。感興趣的植物的例子包括但不限于玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油菜、蕓苔屬植物(Brassicasp.)、苜蓿、黑麥、小米、紅花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑橘樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、番木瓜、腰果、堅果、杏、燕麥、蔬菜、草(例如飼草、草坪草或牧草)、觀賞植物、果樹以及針葉樹。[0075]蔬菜包括但不限于洋蔥、番茄、萵苣、綠豆、利馬豆、豌豆，以及Curcumis屬成員如黃瓜、甜瓜和香瓜。觀賞植物包括但不限于杜鵑花、繡球花屬植物、芙蓉屬植物、玫瑰、郁金香、水仙花、矮牽牛、康乃馨、一品紅和菊花。優(yōu)選本發(fā)明的植物是農(nóng)作物(例如玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜等)。[0076]本發(fā)明特別適合單子葉植物家族的任何成員，包括但不限于玉米、水稻、大麥、燕麥、小麥、高粱、黑麥、甘蔗、菠蘿、薯蕷、洋蔥、香蕉、椰子和椰棗(date)。[0077]植物轉(zhuǎn)化的評估[0078]在將異源外源DNA導(dǎo)入植物細胞中之后，異源基因在植物基因組中的轉(zhuǎn)化或整合可通過各種方法證實，例如分析與整合的基因相關(guān)的核酸、蛋白質(zhì)和代謝物。[0079]PCR分析是在植入土壤之前的早期階段篩選轉(zhuǎn)化的細胞、組織或芽中摻入的核昔酸序列存在的一種快速方法(SambrookandRussell(2001)MolecularCloning.:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,NY)。使用特異于感興趣的基因或者農(nóng)桿菌載體背景等的寡核苷酸引物進行PCR。[0080]植物轉(zhuǎn)化可以通過基因組DNA的Southern印跡分析證實(SambrookandRussell,2001,supra)。通常從轉(zhuǎn)化體中提取總DNA,用合適的限制酶消化,在瓊脂糖凝膠中分級分離并轉(zhuǎn)移至硝化纖維素或尼龍膜上。然后根據(jù)標準技術(shù)將該膜或“印跡”用例如放射標記的32P靶DNA片段探查以證實植物基因組中導(dǎo)入的基因的整合(SambrookandRussell,2001,supra)。[0081]在Northern分析中，根據(jù)本領(lǐng)域常用的標準方法從轉(zhuǎn)化體的特定組織中分離RNA,將其在甲醒瓊脂糖凝膠中分級分離，印跡于尼龍濾膜上(SambrookandRussell,2001，supra)。然后根據(jù)本領(lǐng)域已知方法通過將所述濾膜與衍生自本發(fā)明多核苷酸的放射性探針雜交以檢測由本發(fā)明的核苷酸序列編碼的RNA的表達(SambrookandRussell,2001,supra)。[0082]可以對所述轉(zhuǎn)基因植物進行Western印跡和生物化學(xué)測定以確定由氮調(diào)芐基因編碼的蛋白質(zhì)的存在情況，這通過標準方法(SambrookandRussell,2001,supra)使用結(jié)合所述氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)上存在的一或多個表位的抗體進行。例如，通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多克隆抗體可用于檢測氮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的存在。[0083]技述[0084]本發(fā)明還包含用于本發(fā)明中的多肽或者其變體或片段的抗體。產(chǎn)生抗體的方法為本領(lǐng)域所熟知(見例如HarlowandLane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.;美國專利N0.4,196，265所述)。[0085]實驗[0086]材料和方法[0087]這個計劃的大多數(shù)起始遺傳材料以玉米表達序列標簽或“EST”形式提供，得自鑒別應(yīng)答氮而被上調(diào)或下調(diào)的潛在基因的微陣列實驗。所述微陣列實驗鑒別了可能用于轉(zhuǎn)化的幾百個候選物。雖然這些序列能預(yù)測應(yīng)答氮波動的基因轉(zhuǎn)錄，但是它們未提供對于應(yīng)答氮水平而被調(diào)節(jié)的基因或者調(diào)節(jié)氮水平的基因的明確鑒別?；诨蚪M選擇標準篩選來自微陣列實驗的候選EST以分析并確定少量優(yōu)選候選物隨后用于如本說明書描述的轉(zhuǎn)基因表達中。首先檢驗進入這個計劃的所有EST序列(即“計劃基因(piOjectgene)”)以鑒別可以編碼應(yīng)答植物氮水平的蛋白質(zhì)的開放讀框。在EST中典型存在多個開放讀框。最后，基于多重標準選擇各個計劃基因，所述標準包括開放讀框的大小，其中優(yōu)先選擇較長的開放讀框，并推測翻譯的基因的功能，其中各個開放讀框被翻譯，然后進行BLAST搜索以鑒別蛋白質(zhì)同源物。在鑒別同源物的情況中，我們推斷所述基因很可能編碼具有相似功能的蛋白質(zhì)。這個信息用于評定基因是否編碼與植物中氮同化作用相關(guān)的蛋白質(zhì)功能。[0088]通過這種選擇方法，從每個EST中選擇個體基因靶。選自每個EST的完整基因序列在下文實施例中揭示。EST序列之一(N-EST77-A01)用作進入計劃的兩個不同基因(N-EST77A和N-EST77B)以及一個其它EST(ESTN-EST76-H12)的來源。我們發(fā)現(xiàn)可以對EST進行修飾以產(chǎn)生比未修飾的EST中存在的開放讀框長的開放讀框。概括而言，三個開放讀框組合產(chǎn)生一個較長的基因(N-EST76A)。[0089]在一些情況中，由微陣列實驗提供的DNA樣品用作所有隨后的DNA克隆步驟的原材料。在EST樣品不合適的情況中，產(chǎn)生合成序列。N-EST76b基因是購自BlueHeronBiotechnology,Inc.(Bothell,WA)的合成基因。每個EST以及每個合成基因的基因序列通過DNA測序證實，之后亞克隆每個基因以進行蛋白質(zhì)過表達。[0090]蛋白質(zhì)i寸表汰和鈍化[0091]將針對計劃選擇的每個基因均亞克隆進促進蛋白質(zhì)在大腸桿菌(E.coli)中過表達的表達載體中。進行蛋白質(zhì)過表達以使得各個蛋白質(zhì)得以純化。純化的蛋白質(zhì)可用于在一對兔中產(chǎn)生每種蛋白質(zhì)的多克隆抗體。最后，所述多克隆抗體可用于檢測轉(zhuǎn)基因植物中靶蛋白質(zhì)的存在。[0092]使用本領(lǐng)域已知的方法，將每個計劃基因均亞克隆進大腸桿菌表達載體pRSFlb(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)中。所得克隆通過DNA測序證實并用于誘導(dǎo)每種蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達。然后如本領(lǐng)域所已知的那樣使用鈷親和樹脂(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA)純化表達的His標記的蛋白質(zhì)。[0093]棺物轉(zhuǎn)化[0094]將各自的計劃基因亞克隆進載體中以進行玉米的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。在載體構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化之后，通過本領(lǐng)域已知的Southern印跡方法證實載體。然后使通過這些檢測的陽性農(nóng)桿菌菌株在固體培養(yǎng)基上生長，產(chǎn)生細胞計數(shù)以進行大規(guī)模轉(zhuǎn)化實驗。[0095]如下實驗描述了植物載體構(gòu)建與植物轉(zhuǎn)化的方法。[0096]進行植物轉(zhuǎn)化的載體的構(gòu)建[0097]通過PCR從玉米EST序列或者合成基因中擴增每個計劃基因的開放讀框(ORF)。在PCR期間在ORF的每個末端加入限制位點(例如BamHI和AscI)。此外，在基因的起始密碼子的立即5’加入核苷酸序列ACC以增加翻譯效率(Kozak(1987)NucleicAcidsResearchl5:8125-8148Joshi(`1987)NucleicAcidsResearchl5:6643-6653)。將PCR產(chǎn)物亞克隆進中間載體(例如pRSF-lb)中并使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)測序以保證在PCR期間未導(dǎo)入突變。含有計劃基因的質(zhì)粒用例如BamHI和PstI消化并分離和純化含有完整ORF的片段。[0098]然后將含有計劃ORF的純化的DNA片段亞克隆進質(zhì)粒如pSBll(Japantobacco,Inc.)中，例如在BamHI和PstI位點以完成植物表達載體。所述植物表達載體含有例如磨擦草屬(Tripsacum)遍在蛋白啟動子、TripPro5啟動子(2006年3月16日申請的美國專利申請系列N0.11/377，318，在此并入本文作參考)以及PinII終止子(Anetal.(1989)ThePlantCelll:115-122)形成最終的質(zhì)粒，在此稱作pSBll-lA。pSBll-?Α是這樣組成的，即含有例如啟動子-NUE基因-終止子構(gòu)建體的DNA片段可以由適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈畈⑶乙灿糜诶缤ㄟ^氣霧束注射(aerosolbeaminjection)轉(zhuǎn)化進植物中。pSBll-?Α的結(jié)構(gòu)通過限制消化和凝膠電泳以及通過對各種克隆連接處進行測序而證實。[0099]使用本領(lǐng)域熟知的三親株雜交(triparentalmating)方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至還攜帶質(zhì)粒pSBl(Japantobacco,Inc.)的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404中，并且鋪板于含有抗生素的培養(yǎng)基上。質(zhì)粒pSBll-?Α攜帶壯觀霉素抗性但是是窄譜宿主范圍的質(zhì)粒且不能在農(nóng)桿菌中復(fù)制。當(dāng)通過同源重組將pSBll-?Α整合進廣譜宿主范圍的質(zhì)粒pSBl中時產(chǎn)生抗生素抗性集落。所得共合體產(chǎn)物通過Southern雜交證實。攜帶該共合體的農(nóng)桿菌菌株可用于轉(zhuǎn)化植物，例如通過PureIntro方法(Japantobacco,Inc.)轉(zhuǎn)化。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化植物[0100]在授粉8-12天后收集耳穗(ear)。從耳穗中分離胚，并將大小為0.8-1.5mm的那些胚用于轉(zhuǎn)化。將胚盾片側(cè)向上鋪板于合適的保溫培養(yǎng)基中，在25°C于黑暗中保溫過夜。然而，非必須將所述胚保溫過夜。將胚與含有適合Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移的載體的農(nóng)桿菌菌株接觸5-10分鐘，然后鋪板于共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天(于黑暗中25°C)。在共培養(yǎng)之后，將外植體轉(zhuǎn)移至恢復(fù)期培養(yǎng)基(recoveryperiodmedia)中培養(yǎng)5天(于黑暗中25°C)。根據(jù)利用的特定選擇方法的性質(zhì)和特性將外植體在選擇培養(yǎng)基中保溫直至8周。在選擇期之后，將所得愈傷組織轉(zhuǎn)移至胚成熟培養(yǎng)基中，直至觀測到成熟體細胞胚形成。然后將所得成熟體細胞胚置于低光照條件下，開始本領(lǐng)域已知的再生過程。使所得芽在生根培養(yǎng)基上生根，并將所得植物轉(zhuǎn)移至培育罐(nurserypot)中并且使其增殖為轉(zhuǎn)基因植物。此時，分離葉樣品并且通過PCR證實感興趣基因的存在。[0101]以此方式產(chǎn)生的所有植物均生長至結(jié)種并與分離自H1-1I植物(1waStateUniversity,Ames,1wa)的花粉雜交。受精的植物生長直至成熟。從各個植物中收獲成熟種子并且如果需要則保存以在Tl代進行進一步檢測。[0102]轉(zhuǎn)基因植物中的蛋白質(zhì)表達[0103]代表性的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件(transgenicmaizeevent)中的蛋白質(zhì)表達通過Western印跡評估。簡言之，在溫室中生長4周后取葉樣品并立即在干冰上冷凍。提取總蛋白質(zhì)(P-PER植物蛋白質(zhì)提取試劑盒，Pierce),通過Bradford測定法確定蛋白質(zhì)濃度。將各個植物蛋白質(zhì)樣品通過電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝化纖維素上，使用本領(lǐng)域已知的方法將固定的蛋白質(zhì)與兔多克隆抗血清接觸。利用ECLPlusWestern印跡檢測系統(tǒng)(GEHealthcareBio-SciencesCorp.,Piscataway,NJ)觀測結(jié)合的抗體復(fù)合物。_4]氮測定方法[0105]在氮測定的準備`中，從組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)移至溫室2或4周后(對于Tl植物為發(fā)芽后4周)的植物中切下葉。將該材料在干冰上速凍，在加工之前于_80°C貯存。[0106]硝酸鹽[0107]將50mg葉材料(鮮重，無中脈)凍干以進行干重測定。然后將脫水的葉組織在存在新鮮MilliQ水的條件下使用MiniBeadbeater-96?和2.3mm不銹鋼珠研磨。將研磨的葉組織通過0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)濾膜過濾并注射進AgilentllOOHPLC中，以1.8mM碳酸鈉和1.7mM碳酸氫鈉的混合物的流動相以1.5ml/分鐘運行。使用配有保護柱的1nPacAS9-SC離子層析柱分離離子。以再循環(huán)模式使用具有自生式抑制器(self-regeneratingsuppressor)的陰離子自抑制電導(dǎo)率(anionauto-suppressedconductivity)進行分析。將樣品與每個樣品運行中包含的內(nèi)部標準對比。[0108]銨[0109]將50mg葉材料(鮮重，無中脈)在存在60%甲醇的條件下使用MiniBeadbeater-96TM和2.3mm不銹鋼珠研磨。將經(jīng)研磨的葉組織通過0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)濾膜過濾并注射進配有3.3m、63°C不銹鋼線圈和冷卻的自動取樣器的AgilentllOOHPLC中。流動相含有3mM鄰苯二醛(OPA)、10πιΜβ-巰基乙醇和IOOmM磷酸鹽緩沖液(ρΗ6.8)，以0.4ml/分鐘運行。熒光(激發(fā)410nm,發(fā)射470nm)和二極管陣列檢測(410nm)用于量化葉提取物中的銨。每個運行中均包含內(nèi)部銨標準以進行對比。[0110]通過HPLC分析氨基酸[0111]將50mg葉材料(鮮重，無中脈)凍干以進行干重測定。然后將脫水的葉組織在存在新鮮MilliQ水的條件下用MiniBeadbeater-96?和2.3mm不銹鋼珠研磨。將經(jīng)研磨的葉組織通過0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)濾膜過濾并注射進AgilentllOOHPLC中，使用配有保護柱的ZorbaxEclipseAAA、4.6X75mm反相柱。冷卻的自動取樣器用于混合葉提取物與400mM硼酸鹽緩沖液(ρΗΙΟ.2)、在甲醇中的I%鄰苯二醛/I%3-巰基丙酸，然后在注射之前將其用水稀釋。注射程序的詳細描述如下:將0.5μI樣品加入2.5μI硼酸鹽緩沖液中，以最大速度混合兩次。在保持0.5分鐘后，將針置于水中以從針尖除去殘余物，然后加入0.5μIOPA溶液。將此組合的3.5μI溶液以最大速度混合六次。將針再次置于水中漂洗針尖，然后置于含有新鮮水的小瓶中。接著向樣品混合物中加入32μIMilliQ水，并將18μI以最大速度混合兩次。然后將樣品溶液注射進HPLC中，在5分鐘內(nèi)泵運行2ml/min流動相的具有0-26%乙腈/甲醇/水(45:45:10)(B)梯度的40mMNa2HP04(pH7.8)(A)，隨后是2分鐘的100%保持B，然后是2分鐘的100%A0天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸的量化通過二極管陣列檢測法(328-348nm)和熒光檢測法(激發(fā)340nm，發(fā)射450nm)進行。將樣品與每個樣品運行中包含的天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸的內(nèi)部標準對比。[0112]總氨基酸[0113]將50mg葉材料(鮮重，無中脈)凍干以進行干重測定。然后將脫水的葉組織在存在新鮮MilliQ水的條件下使用MiniBeadbeater-96?和2.3mm不銹鋼珠研磨。將經(jīng)研磨的葉組織通過0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)濾膜過濾。葉提取物在水中稀釋，加入茚三酮試劑溶液(在DMSO和乙酸鋰緩沖液中的茚三酮和還原茚三酮，pH5.2)。然后將樣品用厚箔帶密封，在90°C加熱10分鐘，精確冷卻2分鐘，在590nm在分光光度計中讀數(shù)。將數(shù)值與每個樣品分析期間包含的內(nèi)部標準對比。[0114]總蛋白質(zhì)[0115]將50mg葉材料(鮮重，無中脈)凍干以進行干重測定。然后將脫水的葉組織在存在新鮮MilliQ水的條件下使用MiniBeadbeater-96?和2.3mm不銹鋼珠研磨。將經(jīng)研磨的葉組織通過0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)濾膜過濾。向在水中稀釋的葉樣品中加入Bio-Rad蛋白質(zhì)染料，進行Bradford蛋白質(zhì)測定,在595nm在分光光度計中讀數(shù),并且與測定中包含的內(nèi)部蛋白質(zhì)標準對比。葉綠素[0116]將50mg葉材料(鮮重，無中脈)在存在60%甲醇的條件下使用MiniBeadbeater_96TM和2.3mm不鎊鋼珠研磨。將經(jīng)研磨的葉組織通過1.0μmA/B玻璃纖維濾膜過濾，將100μI提取物置于Corning3370平底微量培養(yǎng)板中，在分光光度計中讀數(shù)，空白孔含等體積的60%甲醇。使用SofiMaxPro軟件將光路長換成lem。使用Porra,R.J.PhotosynthesisResearch,73:149-156,2002所述等式計算葉綠素含量。[0117]實施例1:候詵EST的鑒別[0118]每個候選氮調(diào)芐基因的核苷酸序列信息在申請人:愛荷華州立大學(xué)Dr.PatSchnable指導(dǎo)下進行的差別氮微陣列實驗中產(chǎn)生。這個微陣列實驗用做初始篩選以選擇與氮條件也許相關(guān)的EST亞群(sub-set)。[0119]從在微陣列中示出一些差異的大量EST序列中(具有3’和5’數(shù)據(jù)的136個序列)在生物信息學(xué)分析之后進一步選擇。這個分析包括核查InternationalNucleotideSequence數(shù)據(jù)庫(位于NCBI)中的核苷酸序列相似性，核查蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫如NCBI和Swisspro中預(yù)測的蛋白質(zhì)相似性，研究關(guān)于已知或預(yù)測功能的信息以及核查專利局的核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。使用這些分析結(jié)果以及支持性關(guān)鍵信息選擇EST亞群在玉米中進行與氮利用效率相關(guān)的轉(zhuǎn)基因過表達。對于每個EST序列，鑒別了開放讀框并翻譯為氨基酸序列。候選的氮調(diào)節(jié)序列列于表1中。[0120]在植物中過表達氮調(diào)節(jié)序列的載體構(gòu)建[0121]隨后將每個候選氮調(diào)節(jié)EST的開放讀框?qū)胫参锉磉_載體中。使用本領(lǐng)域熟知的方法，應(yīng)用兩個不同的選擇標記系統(tǒng)，使得可以在存在選擇劑的條件下選擇轉(zhuǎn)化的植物。[0122]用氮調(diào)芐基因轉(zhuǎn)化玉米[0123]所述植物載體可用于植物轉(zhuǎn)化實驗，通過使用上述方法將氮調(diào)芐基因?qū)胗衩谆蚪M中。[0124]表1:氮調(diào)節(jié)序列[0125]【權(quán)利要求】1.一種調(diào)節(jié)植物中氮利用的方法，其中所述植物為玉米，包括:a)用包含分離的核酸分子的表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞，其中所述分離的核酸分子包含編碼與SEQIDNO:30所示的序列具有至少95%相同性的氨基酸序列的核苷酸序列；b)在所述植物細胞中表達所述核酸分子；c)從所述植物細胞生成過表達所述核苷酸序列的轉(zhuǎn)化的植物；及d)從多個所述轉(zhuǎn)化的植物選擇與相同條件下生長的對照植物相比氮利用被調(diào)節(jié)了的植物。2.權(quán)利要求1的方法，所述表達載體還包含5’DNA啟動子序列和3’終止子序列，其中所述核苷酸序列、DNA啟動子序列以及終止子序列可操縱地連接以允許所述核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述啟動子序列選自組成型植物啟動子和組織特異性啟動子。4.一種調(diào)節(jié)植物中氮利用的方法，其中所述植物為玉米，包括:a)用包含分離的核酸分子的表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞，其中所述分離的核酸分子包含編碼SEQIDNO:31所示的氨基酸序列的核苷酸序列；b)在所述植物細胞中表達所述核酸分子；c)從所述植物細胞生成過表達所述核苷酸序列的轉(zhuǎn)化的植物；及d)從多個所述轉(zhuǎn)化的植物選擇與相同條件下生長的對照植物相比氮利用被調(diào)節(jié)了的植物?！疚臋n編號】C12N15/84GK103773800SQ201410058569【公開日】2014年5月7日申請日期:2007年10月27日優(yōu)先權(quán)日:2006年10月27日【發(fā)明者】J·麥克拉倫,N·杜克,B·范德貝格,A·沙瓦爾德爾,V·貝林松,J·辛森申請人:愛荷華谷類推廣協(xié)會