沙漠齒肋赤蘚實時熒光定量pcr內(nèi)參分子的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種沙漠齒肋赤蘚實時熒光定量PCR內(nèi)參分子的篩選方法，該方法利用齒肋赤蘚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，選取15個內(nèi)參候選基因，以15個內(nèi)參基因為模板設(shè)計實時熒光定量PCR的內(nèi)參基因特異引物，選取受10種非生物脅迫和沒有脅迫（對照）的齒肋赤蘚配子體為實驗材料進行熒光定量PCR實驗，運用geNorm，NormFinder和Refinder軟件進行熒光定量數(shù)據(jù)的分析，從而篩選出齒肋赤蘚開展各種非生物脅迫下熒光定量研究的最適合，最穩(wěn)定的內(nèi)參分子是CDPK和α-TUB2。用本發(fā)明所述方法可避免不同非生物脅迫下的齒肋赤蘚配子體材料在RNA質(zhì)量，產(chǎn)量及反轉(zhuǎn)錄效率等上的存在的誤差，能更好的對實時熒光定量檢測的數(shù)據(jù)進行校正和標準化，提高了該種基因定量研究的準確性和可靠性。
【專利說明】沙漠齒肋赤蘚實時熒光定量PCR內(nèi)參分子的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種適用于沙漠蘚類齒肋赤蘚各種非生物脅迫下實時熒光定量PCR研究的內(nèi)參分子的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]干旱，高鹽等非生物脅迫是限制植物生長發(fā)育和作物產(chǎn)量的主要因素，每年導(dǎo)致作物減產(chǎn)達50%以上。隨著全球氣候變暖，溫室效應(yīng)和土地沙漠化的加劇，干旱問題將日益突出，干旱對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響也將更加嚴重。目前，利用干旱脅迫相關(guān)基因提高植物的抗旱能力，已經(jīng)成為植物抗逆分子生物學的研究熱點和植物抗逆基因工程重要的研究方向。
[0003]干旱區(qū)植物在長期進化過程中積累的抗干旱基因資源是開展種質(zhì)創(chuàng)新的源動力。干旱區(qū)嚴酷的自然環(huán)境孕育了特殊，天然，珍稀的逆境植物資源。荒漠極端耐旱蘚類齒肋赤蘚即為典型代表。齒肋赤蘚(Syntrichia caninervis Mitt.)隸屬叢蘚科、赤蘚屬,為典型的變水植物，是構(gòu)成蘚類結(jié)皮的優(yōu)勢種，自然干燥狀態(tài)下呈灰黑色，似一層“殼”分布在沙漠表面，形成有重要生態(tài)意義的苔蘚生物結(jié)皮，不僅具有較強的抗逆能力，而且在維持荒漠生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和受損生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)重建中起著重要的作用。此外，一旦遇到降水，齒肋赤蘚即在30s內(nèi)迅速通過再水化過程而“復(fù)原”呈鮮活的綠色，并開始執(zhí)行光合作用，其獨特的生理特性及抗旱性和耐熱性的分子調(diào)控機制已成為國內(nèi)外相關(guān)科學的研究熱點。同時，長期的環(huán)境壓力使得該種具有極好的抗旱，抗高溫等抵抗多種非生物脅迫的能力，其體內(nèi)必定蘊含著豐富的抗逆基因資源。目前，從極端抗旱蘚類齒肋赤蘚中發(fā)掘優(yōu)質(zhì)抗逆基因資源已經(jīng)展開，特別是齒肋赤蘚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的建立，更是為該種的基因研究提供了很好的平臺。目前，從齒肋赤蘚中克隆，分析ALDH，HSP70, DREB等家族基因的工作正在展開。而要了解齒肋赤蘚的抗逆機制以及挖掘豐富的抗逆基因資源，很關(guān)鍵的一個方法就是要分離這些基因并迅速、準確地定量檢測抗旱基因在各種非生物脅迫下的表達。傳統(tǒng)的印跡雜交，生物芯片技術(shù)和RT-PCR等手段在實時、定量檢測抗旱基`因表達量上，或存在缺陷，或價格昂貴、費時費力。隨著分子生物學各項技術(shù)的發(fā)展，實時熒光定量PCR已經(jīng)成為目前基因表達定量檢測的主要方法，該法不僅靈敏度高，樣品消耗量少，能檢測出低豐度靶基因表達量，定量線性寬，但是實時熒光定量PCR檢測的準確性很大程度上依賴于篩選適合的內(nèi)參基因?qū)?shù)據(jù)進行校正和標準化，從而避免不同標本在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量及逆轉(zhuǎn)錄率上可能存在的差別。因此，合適穩(wěn)定的內(nèi)參基因的選擇則是齒肋赤蘚抗逆機制和抗逆基因研究的基礎(chǔ)。
[0004]以往對內(nèi)參基因的穩(wěn)定性研究證實，任何一種內(nèi)參基因的所謂恒定表達都只是在一定類型的植物或特定實驗因素作用下的相對恒定，在其他類型的植物中或不同實驗處理下穩(wěn)定性則很可能是變化的。若盲目的參考別的物種中穩(wěn)定的一個內(nèi)參或或幾個內(nèi)參基因，一方面可能使基因表達的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，另一方面可能得到錯誤甚至是相反的結(jié)論。近年來，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性問題近年來越來越受爭議和關(guān)注。隨著人們對內(nèi)參基因穩(wěn)定行問題的越來越重視，目前，已開發(fā)出基于Excel程序多種軟件，用于評價內(nèi)參基因的穩(wěn)定性和變異系數(shù)，其中應(yīng)用最普遍的為GeNorm和NormFinder程序。[0005]綜上所述，荒漠極端耐旱蘚類齒肋赤蘚是研究沙漠蘚類抗逆機制和挖掘優(yōu)良抗逆基因的好材料。研究和篩選齒肋赤蘚中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是進行該種基因定量研究(熒光定量PCR實驗)的先決條件。近年來，做為極端抗旱蘚類的齒肋赤蘚的分子水平工作陸續(xù)展開，從齒肋赤蘚中已克隆出一些抗逆基因，如乙醛脫氫酶基因ALDH21 (NCBI登錄號:GQ245973)，特別是近年來本課題組對齒肋赤蘚轉(zhuǎn)錄組，蛋白組等高通量測序結(jié)果的相繼獲得，更是加快了齒肋赤蘚的分子研究工作。很多抗逆基因的特性和功能亟待研究，但關(guān)于該種的內(nèi)參基因的序列資料未見報道，最合適內(nèi)參分子的研究和篩選工作更是空白。因此，本發(fā)明就旨在找到一種在非生物脅迫條件下齒肋赤蘚開展實時熒光定量PCR研究最穩(wěn)定，最合適的內(nèi)參分子的篩選方法，為以后大規(guī)模開展抗逆基因特性及功能研究奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于，提供一種沙漠齒肋赤蘚實時突光定量PCR內(nèi)參分子的篩選方法，該方法利用實時熒光定量PCR方法研究苔蘚植物抗逆相關(guān)基因功能時，缺少適用的、可靠的、表達恒定的內(nèi)參分子，提出了一種適用于沙漠蘚類齒肋赤蘚在非生物脅迫條件下開展實時熒光定量PCR研究的最穩(wěn)定，最合適的內(nèi)參分子的篩選方法；利用齒肋赤蘚轉(zhuǎn)錄組測序得到的數(shù)據(jù)庫，選取了 15個齒肋赤蘚候選內(nèi)參基因，并以這些基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計實時熒光定量PCR的內(nèi)參基因特異引物。選取受10種非生物脅迫和沒有脅迫(對照)的齒肋赤蘚為實驗材料進行突光定量PCR實驗驗證,運用三大內(nèi)參穩(wěn)定性評估軟件包括geNorm,NormFinder和Refinder進行突光定量數(shù)據(jù)的分析,從而篩選出齒肋赤蘚開展各種非生物脅迫下熒光定量研究的最適合，最穩(wěn)定的內(nèi)參分子。運用本發(fā)明所述方法篩選的內(nèi)參分子，可避免在多種非生物脅迫下齒肋赤蘚樣本在RNA產(chǎn)量，質(zhì)量及反轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差另O，能更好的對實時熒光定量PCR檢測出的數(shù)據(jù)進行校正和標準化，提高對該種基因定量研究的準確性和可靠性。
[0007]本發(fā)明所述的一種沙漠蘚類齒肋赤蘚實時熒光定量PCR內(nèi)參分子的篩選方法，按下列步驟進行:`[0008]a、利用齒肋赤蘚轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，挑選15個齒肋赤蘚內(nèi)參候選基因，并以挑選的15個齒肋赤蘚序列為基礎(chǔ)設(shè)計了 15對實時熒光定量PCR的內(nèi)參基因引物，其中15個內(nèi)參基因的核苷酸序列及設(shè)計的15對實時熒光定量PCR引物序列為:
[0009]> 序列 I 齒肋赤蘚 SyntrichiacaninervisActin (ACT)核苷酸序列
[0010]ATGGCTGATGCTGAGGATGTCCAGCCTTTGGTGTGCGACAATGGATCGGGGATGGTTAAGGCCGGATTCGCCGGAG
[0011]ATGACGCCCCGCGTGCCGTATTTCCCAGCATTGTTGGGCGCCCGAGACACACCGGTGTGATGGTGGGCATGGGACA
[0012]GAAAGACGCGTATGTGGGCGACGAGGCGCAGTCCAAGAGGGGTATCCTGACGCTGAAGTACCCGATCGAGCACGG
[0013]CGTGGTCACCAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGCTGCGTGTGGCCCCCGA
[0014]GGAGCACCCGGTGCTGCTCACGGAGGCGCCTCTCAATCCCAAGGCCAACAGGGAGAAGATGACGCAGATCATGTT
[0015]CGAGACCTTCAACGTGCCGGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCGGTGCTGTCGCTGTACGCCAGTGGGCGAACCACC
[0016]GGAATTGTGCTGGATAGTGGAGACGGTGTGACTCACACAGTGCCCATCTATGAGGGGTACGCCTTGCCTCACGCCA
[0017]TTCTGCGGCTG
[0018]GACTTGGCCGGTCGCGACTTGACGGACGCGCTGATGAAGATTCTGACGGAGCGTGGTTACTCGTTCACCACCACGG
[0019]CCGAGCGCGAGATCGTGCGTGACATGAAGGAGAAGCTGGCGTACGTGGCAATCGACTTTGAGCAGGAGCTCGACA
[0020]CAGCGCGCTCATCGTCCTCGCTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCGGACGGGCAGGTGATCACGATCGGCGCGGAGC
[0021]GGTTCAGGTGCCCGGAGGTGCTGTTCAACCCGTCGCTGATCGGGATGGAAGCTGCGGGCATTCACGAGACCACTTA
【權(quán)利要求】
1.一種沙漠蘚類齒肋赤蘚實時熒光定量PCR內(nèi)參分子的篩選方法，其特征在于按下列步驟進行:a、利用齒肋赤蘚轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，挑選15個齒肋赤蘚內(nèi)參候選基因，并以挑選的15個齒肋赤蘚序列為基礎(chǔ)設(shè)計了 15對實時熒光定量PCR的內(nèi)參基因引物，其中15個內(nèi)參基因的核苷酸序列及設(shè)計的15對實時熒光定量PCR引物序列為: 序列I齒肋赤蘚SyntrichiacaninervisActin核苷酸序列
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中所述的內(nèi)參基因為18s核糖體RNA，肌動蛋白，α微管蛋白1，α微管蛋白2，β微管蛋白，甘油醛_3_磷酸脫氫酶I，甘油醛-3-磷酸脫氫酶2，泛素蛋白連接酶1，泛素蛋白連接酶2，鈣依賴型蛋白激酶，F(xiàn)-盒蛋白，轉(zhuǎn)錄延伸因子，肌動蛋白相關(guān)蛋白，SAND蛋白，組蛋白3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中總共11齒肋赤蘚配子體為完全復(fù)水24h后的經(jīng)各種脅迫處理后的去除假根的葉片組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中非生物脅迫處理的條件為:分別用20%聚乙二醇6000，250mM氯化鈉，100 μ M脫落酸，0.5mM硫酸銅，50mM雙氧水，0.5w/m2紫外輻射模擬干旱，高鹽，脫落酸，重金屬，氧化和紫外脅迫；將齒肋赤蘚分別置于溫度4°C冰箱和溫度42°C光照培養(yǎng)箱模擬低溫和高溫脅迫；用10%PEG+溫度42°C模擬干熱混合脅迫，機械損傷脅迫是通過剪斷葉片實現(xiàn)；所有處理均是在脅迫6h后取材，且取得的材料立即置于液氮中，并迅速置于溫度_80°C冰箱儲存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中實時熒光定量PCR模板均為I μ gRNA反轉(zhuǎn)得到的cDNA的5倍稀釋液，且熒光定量程序為:第一步是預(yù)變性:溫度95°C -30秒；第二步是PCR反應(yīng)階段，溫度95°C -5秒，溫度58°C -60°C，30秒，40個循環(huán)，收集熒光信號；第三步是溶解曲線分析，溫度65°C _951:，溫度651:在30秒逐步升至951:，每0.51:收集一次熒光 信號。
【文檔編號】C12Q1/68GK103866007SQ201410057384
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月19日
【發(fā)明者】張道遠, 李小雙, 李海燕, 楊紅蘭 申請人:中國科學院新疆生態(tài)與地理研究所