一種用于藍白斑篩選的自殺載體pGMB152及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于藍白斑篩選的自殺載體pGMB152及其應用，所述自殺載體pGMB152是將LacZYA基因克隆入自殺載體pGMB151中而形成；再使用該自殺載體以重組菌藍白斑篩選法可構(gòu)建雞白痢沙門菌hsdM基因缺失株。本發(fā)明在原有篩選方法的基礎上，通過pGMB152自殺載體上LacZYA報告基因編碼的β-半乳糖甘酶與其底物X-gal反應生成藍色物質(zhì)的特性，以顏色直觀地顯示重組菌中pGMB152載體的存在，以予辨別所產(chǎn)生的突變株。該方法顯著地減少了工作量，提高了篩選基因缺失株的效率；而且，結(jié)果比較直觀，只要通過識別藍白斑重組菌就可以篩選到基因缺失株，且無抗生素基因的殘留。
【專利說明】—種用于藍白斑篩選的自殺載體PGMB152及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及到構(gòu)建并使用PGMB152自殺載體以重組菌藍白斑篩選法構(gòu)建雞白痢沙門菌S06004 Δ hsdM基因缺失株的方法。
【背景技術】
[0002]目前，沙門菌構(gòu)建基因缺失株常用的有兩種方法，一種是高效自殺載體系統(tǒng)的同源重組法，另一種是Red同源重組法。自殺載體系統(tǒng)同源重組法基因敲除，是80年代發(fā)展起來的染色體基因修飾技術，其基本原理是構(gòu)建含2個同源DNA片段的重組自殺載體，在沙門菌中發(fā)生同源重組進行等位基因序列交換而致目的基因丟失。由于自殺載體的復制需要特定的η蛋白質(zhì)，而所研究的沙門菌不存在表達η蛋白的基因，不能提供η蛋白，因而重組自殺載體在二次同源重組發(fā)生等位基因交換后，就會從沙門菌中自動丟失，完成整個基因同源重組過程。但是原有的方法，篩選過程不僅繁瑣，而且存在許多不確定性，也缺乏直觀性，最主要的是在基因缺失株篩選最后階段，所構(gòu)建的基因缺失株與其親本株在表觀上無任何區(qū)別，難以辨別，挑選基因缺失株鑒定時盲目性較大。為進一步優(yōu)化自殺載體系統(tǒng)，我們在原有方法的基礎上進行改造，借鑒基因克隆藍白斑篩選法，創(chuàng)建了直觀高效且無抗生素基因殘留的篩選方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是進一步優(yōu)化聞效自殺載體系統(tǒng)，對自殺載體pGMB151進行改造，提高篩選基因缺失株的效率，顯著減少篩選基因缺失株過程中的工作量。在自殺載體PGMB151的Sma I和Sal I限制性酶切位點之間克隆進入LacZYA基因(GenBank: JO1636.1),形成pGMB151-LacZYA自殺載體，即自殺載體pGMB152。該自殺載體pGMB152因LacZYA表達β-半乳糖甘酶，在含有其底物 5-Bromo-4-chloro-3_indolyl- β -D-GalactopyranosideCX-gal)培養(yǎng)基中，使含有該載體的重組菌顯示藍色，通過重組菌藍白斑直觀地辨別自殺載體在沙門菌中存在與否。因基因缺失株丟失重組自殺載體而呈白色，與含重組自殺載體發(fā)生單等位基因同源重組菌(藍色)顏色不同，挑選基因缺失株鑒定時就不存在盲目性，從而提高基因缺失株篩選效率。篩選基因缺失株的方法也適用于其它細菌。
[0004]本發(fā)明所述的用于藍白斑篩選的自殺載體pGMB152，是將報告基因LacZYA克隆入自殺載體PGMB151而衍生的。具體是在自殺載體PGMB151的Sma I和Sal I限制性酶切位點之間克隆入LacZYA基因。
[0005]本發(fā)明 還公開了自殺載體PGMB152在篩選基因缺失株中的應用。
[0006]所述的應用，具體方法是:將氯霉素抗性基因CmK兩側(cè)連接有目的基因A的上下游同源臂的片段克隆到PGMB152載體Sal I限制性內(nèi)酶切位點上，去除CmK基因后，命名為PGMB152-AA;將該質(zhì)粒pGMB152-AA轉(zhuǎn)入宿主菌中，與宿主菌進行固相雜交，涂布于含有載體抗性的抗生素Amp、Sm且添加X-gal的LB平板，挑選藍色菌落，用含10%蔗糖無NaCl的培養(yǎng)基進行傳代，最后，涂布于含X-gal無抗生素的平板，挑選白色菌落得到目的基因缺失株。
[0007]以構(gòu)建雞白痢沙門菌AhsdM基因缺失株為例:在Sma I和Sal I限制性內(nèi)切酶酶切位點之間將LacZYA基因克隆進入pGMB151質(zhì)粒，接著將氯霉素抗性基因(CmK)兩側(cè)連接有hsdM基因的上下游同源臂的片段克隆到pGMB152載體Sal I限制性內(nèi)酶切位點上，去除CmK基因后，命名為pGMB152-AhsdM。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli x 7213菌(供體菌)中，與雞白痢沙門菌S06004 (受體菌)進行固相雜交，涂布于含有載體抗性的抗生素(Amp、Sm)且添加X-gal的LB平板，挑選藍色菌落，用含10%蔗糖無NaCl的培養(yǎng)基進行傳代，最后，涂布于含X-gal無抗生素的平板，挑選白色菌落，PCR鑒定后，命名為基因缺失株S06004AhsdM。本發(fā)明方法是在原有篩選方法的基礎上，通過PGMB152自殺載體上LacZYA報告基因編碼的 β -半乳糖甘酶與其底物 5-Bromo-4-chloro-3-1ndolyl- β -D-Galactopyranoside (X-gal)反應生成藍色物質(zhì)的特性，以顏色直觀地顯示重組菌中PGMB152載體的存在，以予辨別所產(chǎn)生的突變株。在含PGMB152自殺載體的沙門菌中，PGMB152自殺載體上等位基因片段與細菌基因組經(jīng)單等位基因同源重組(Single crossover)后，自殺載體上LacZYA報告基因編碼的半乳糖甘酶，催化培養(yǎng)基中的底物X-gal，從而使重組菌呈現(xiàn)藍色。在蔗糖的脅迫壓力下繼續(xù)傳代后，部分菌落轉(zhuǎn)呈白色，這表明它們所攜帶的報告基因LacZYA丟失，亦即表明自殺載體丟失，說明雙等位基因同源重組(double crossover)已經(jīng)發(fā)生而便于確定基因缺失株。此方法與原有的方法比較，顯著地減少了工作量，提高了篩選基因缺失株的效率；而且，結(jié)果比較直觀，只要通過識別藍白斑重組菌就可以篩選到基因缺失株，且無抗生素基因的殘留。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1.pMD- Δ hsdM經(jīng)Xho I酶切驗證和回收驗證電泳圖；
[0009]M:DNA Marker DL2000
[0010]Lanel、2:pMD_ Λ hsdM 經(jīng) Xho I 酶切后回收產(chǎn)物。
[0011]圖2.pMD-CmE經(jīng)Xho I酶切后回收驗證電泳圖；
[0012]M: λ 14DNA Marker
[0013]Lanel、2:pMD-CmE 經(jīng) Xho I 酶切后回收產(chǎn)物 CmK。
[0014]圖3.pMD- Δ hsdM/CmE經(jīng)Sal I酶切驗證電泳圖；
[0015]M: λ 14DNA Marker
[0016]lanel、2:pMD-Δ hsdM/CmE 經(jīng) Sal I 酶切產(chǎn)物。
[0017]圖4.pMD- Δ hsdM/CmE 經(jīng) Xho I 酶切驗證電泳圖；Μ: λ 14DNA Marker
[0018]lanel、2、3、4:pMD-AhsdM/Cm35Xho I 酶切產(chǎn)物。
[0019]圖5.pGMB152- Δ hsdM質(zhì)粒經(jīng)Sal I和Xho I酶切驗證電泳圖；
[0020]M: λ 14DNA Marker
[0021]lanel:pGMB152_ Δ hsdM 質(zhì)粒
[0022]lane2:pGMB152_ Δ hsdM 質(zhì)粒經(jīng) Sal I 酶切驗證
[0023]lane3:pGMB152_ Δ hsdM 質(zhì)粒經(jīng) Xho I 酶切驗證。
[0024]圖6.雙等位基因同源重組后PCR驗證電泳圖；
[0025]M:DNA Marker DL2000[0026]lanel:陽性對照(S06004PCR)
[0027]lane2:S06004 AhsdM PCR驗證(雙等位基因同源重組的白色菌落)
[0028]lane3:S06004 AhsdM PCR驗證(雙等位基因同源重組的白色菌落)
[0029]lane4:單等位基因同源重組菌(藍斑PCR)。
[0030]圖7.E.coli X 7213 (pGMB152_ Λ hsdM)與S06004單等位基因同源重組結(jié)果圖；
[0031]圖8.E.coli X 7213 (pGMB152_ Λ hsdM)與S06004雙等位基因同源重組(經(jīng)傳5代之后)結(jié)果。注:白色菌落為同源重量組后的突變株。
[0032]圖9基于pGMB152自殺載體的基因敲除過程。
[0033]圖10基于pGMD151自殺載體的基因敲除過程。
[0034]本發(fā)明中所說的S06004，是指雞白痢沙門氏菌S06004株，也稱野生株S06004。2006 年分離于徐州，基因組序列(Accession:CP006575.1，G1: 529190224)
[0035]本發(fā)明所獲得的雞白痢沙門氏菌基因缺失株S06004AhsdM。
【具體實施方式】
[0036]pFUSE 質(zhì)粒:BSumIer AJ, Tsolis RM, van der Velden AWM, StojiljkovicI,Anic S,Heffron F.1996.1dentification of a new iron regulated locus ofSalmonella typh1.Gene, 183, (1- 2): 207 - 213。pGMB151 質(zhì)粒:Khan AQ, Zhao L, HiroseK,Miyake M, Li TM Hashimoto Y, Kawamura Y,Ezaki T.1998.Salmonella typhi rpoSmutant is less cytotoxic than the parent strain but survives inside restingTHP-lmacrophages.FEMS Microbiology Letters, 161, 201-208.[0037]1.pGMB152- Δ hsdM 的構(gòu)建
[0038]1.1將LacZYA基因克隆到pGMB151質(zhì)粒
[0039]小量提取pFUSE質(zhì)粒和pGMB151質(zhì)粒，用Sal I和Sma I限制性內(nèi)切酶分別對這兩個質(zhì)粒進行單酶切，酶切體系(20μ L):質(zhì)粒(pFuse/pGMB151) 7μ L，BamH Il μ L，IOXMBuffer2y L，滅菌的ddH2010 μ L，37°C水浴酶切2h。質(zhì)粒pFUSE單酶切為兩個片段(5.0kb和4.4kb)，質(zhì)粒pGMB151單酶切為一個片段(7.8kb)。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒回收純化pFUSE的5.0kb片段和pGMB151的7.8kb片段，將兩者16°C金屬浴過夜連接。連接體系(IOyL):T4DNA 連接酶 I μ L，10 X 連接 Bufferl μ L，pFUSE 的 5.0kb 片段 2 μ L，PGMB151的7.8kb片段6μ L。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli SMlO(購于美國菌種庫ATCC)，涂布LB平板，挑取單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒pGMB151-LacZYA，命名為PGMB152。
[0040]1.2hsdM基因上下游同源臂的擴增
[0041]1.2.1引物設計與合成
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種用于藍白斑篩選的自殺載體PGMB152，是將報告基因LacZYA克隆入自殺載體PGMB151而衍生的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自殺載體PGMB152，其特征在于，是在自殺載體pGMB151的Sma I和Sal I限制性酶切位點之間克隆入LacZYA基因。
3.權(quán)利要求1所述的自殺載體PGMB152在篩選基因缺失株中的應用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于具體方法是:將氯霉素抗性基因CmK兩側(cè)連接有目的基因A的上下游同源臂的片段克隆到pGMB152載體Sal I限制性內(nèi)酶切位點上，去除CmK基因后，命名為pGMB152- Δ A ;將該質(zhì)粒pGMB152_ Δ A轉(zhuǎn)入宿主菌中，與宿主菌進行固相雜交，涂布于含有載體抗性的抗生素Amp、Sm且添加Χ-gal的LB平板,挑選藍色菌落，用含10%蔗糖無NaCl的培養(yǎng)基進行傳代，最后，涂布于含X-gal無抗生素的平板，挑選白色菌落得到目的基因缺失株。
5.用權(quán)利要求1所述PGMB152自殺載體構(gòu)建雞白痢沙門菌S06004Λ hsdM基因缺失株的方法，其特征在于，將氯霉素抗性基因CmK兩側(cè)連接有hsdM基因的上下游同源臂的片段克隆到pGMB152載體Sal I限制性內(nèi)酶切位點上，去除CmK基因后，命名為pGMB152_ Δ hsdM ；將該質(zhì)粒PGMB152-AhsdMRAE.coli x 7213宿主菌中，與雞白痢沙門菌進行固相雜交，涂布于含有載體抗性的抗生素Amp、Sm且添加X-gal的LB平板,挑選藍色菌落,用含10%鹿糖無NaCl的培養(yǎng)基進行傳代，最后，涂布于含X-gal無抗生素的平板，挑選白色菌落得到基因缺失株 S06004Ah sdM。
【文檔編號】C12N1/21GK103789337SQ201410054058
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月18日
【發(fā)明者】焦新安, 耿士忠, 田青, 潘志明, 陳祥, 孫林, 胡茂志 申請人:揚州大學