百脈根特異性表達h5n1抗原蛋白的三價ha-2ha1-ltb融合表達載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，涉及百脈根特異性表達H5N1抗原蛋白的三價HA-LTB融合表達載體。在百脈根植物表達載體的多克隆位點，由2E+35啟動子至poly(A)-Nos終止子方向，正向依次插入核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示的優(yōu)化HK97HA基因、核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示的優(yōu)化HK07HA1基因、核苷酸序列如SEQ?ID?No.6的優(yōu)化SX06HA1基因和核苷酸序列如SEQ?ID?No.8所示的優(yōu)化免疫佐劑LTB基因。本發(fā)明利用已建立的外源蛋白高水平表達平臺進行表達，為廣譜H5N1禽流感植物可飼疫苗的研制奠定基礎。
【專利說明】百脈根特異性表達H5N1抗原蛋白的三價HA-2HA1-LTB融合表達載體
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，涉及百脈根特異性表達H5N1抗原蛋白的三價HA-2HA1-LTB融合表達載體。
【背景技術】
[0002]H5N1高致病性禽流感病毒的不斷變異和可通過侯鳥遷徙傳播等特性，給傳統(tǒng)疫苗的研制及免疫途徑帶來了極大的困難。禽流感病毒具有極高的突變和重組頻率，加之其高毒性和潛在感染人的能力，使得禽流感的防控成為一個世界性難題。不斷蔓延的疫情給我們再一次敲響了警鐘，被動地根據(jù)發(fā)病病毒亞型進行治療往往具有滯后性和盲目性，且禽流感病毒具有宿主多樣化和隨候鳥遷徙等特點，只有建立成熟的疫苗生產平臺，研制可廣譜免疫中和多種亞型禽流感病毒的植物可飼疫苗，通過在候鳥遷徙地投放，才能從根本上控制甚至消滅禽流感病毒。
[0003]禽流感毒株 A/Hong Kong/156/97 (H5N1)血凝素基因(HA)序列(GenebankN0.AF028709.1)、蛋白序列(AAC40508.1), A/common magpie/Hong Kong/5052/2007 (H5N1)血凝素基因(HA)序列(Genebank N0.CY036173.1)、蛋白序列(ACJ26242.1), A/chicken/Shanxi/2/2006(H5N1)血凝素基因(HA) (Genebank N0.DQ914814.3)、蛋白序列(ABK34764.2)。此3株禽流感血凝素(HA)抗原蛋白包含所有H5HA蛋白的抗原表位，血凝素參與病毒與受體結合、細胞膜融合及進入細胞全過程，是流感病毒表面重要的糖蛋白。大腸桿菌熱敏毒素B亞基基因(LT-B)序列(Genebank N0.M17873.1)、蛋白序列(AAA98065.1)均來自 Genbank (http: //www.ncb1.nlm.nih.Rov/Renbank/)大腸木干菌熱敏毒素 B 亞基(LTB)能刺激腸道上皮細胞，蹭墻黏膜細胞對抗原通透性，從而增強免疫反應，具有高活性、無毒性的特點。
[0004]利用全價飼料豆科牧草-百脈根(Lotus corniculatus)作為植物生物反應器
生產廣譜(可免疫中和所有H5亞型禽流感病毒)禽流感轉基因植物可飼用疫苗，是解決這一難題的最有效的途徑。通過基因工程技術手段實現(xiàn)抗原蛋白在百脈根中的高水平表達，并在候鳥遷徙地投放轉基因植物疫苗，不僅可節(jié)省下游純化的成本，生產低成本的疫苗，更重要的是能夠切斷禽流感傳播途徑，實現(xiàn)根本上防控禽流感的目的。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供百脈根特異性表達H5N1抗原蛋白的三價HA-2HA1-LTB融合植物表達載體。
[0006]根據(jù)本發(fā)明的三價HA-2HA1-LTB融合植物表達載體，其特征在于，在百脈根植物表達載體的多克隆位點，由2E+35啟動子至Poly(A)-Nos終止子方向，正向依次插入核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的優(yōu)化HK97HA基因、核苷酸序列如SEQ IDN0.4所示的優(yōu)化HK07HA1基因、核苷酸序列如SEQ ID N0.6的優(yōu)化SX06HA1基因和核苷酸序列如SEQ IDN0.8所示的優(yōu)化免疫佐劑LTB基因。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的三價HA - 2HA1 - LTB融合植物表達載體，其中所述百脈根植物表達載體為 pCAMBIA2301。
[0008]本發(fā)明分析H5HA蛋白抗原表位多態(tài)性，依據(jù)主要抗原位點氨基酸差異、宿主、病毒致病性強弱，選取包含所有突變抗原表位的三株H5N1高致病性禽流感毒株即:HK97HA-A/Hong Kong/156/97 (H5N1 )、HK07HAl-A/common magpie/Hong Kong/5052/2007(H5N1)和 SX06HAl-A/chicken/Shanxi/2/2006 (H5N1),以其 HA 為目的抗原蛋白，構建三價HA-2HA1-LTB融合蛋白，并利用多種生物信息學軟件對融合蛋白的理化性質、二級結構及三級結構進行預測，結果顯示融合蛋白結構穩(wěn)定、構象合理，具備了通過構建植物融合表達載體，實現(xiàn)在植物中穩(wěn)定表達的基本條件。
[0009]為進一步提高外源蛋白的表達水平，對目的抗原蛋白基因進行修飾改造。分別對HK97HA.HK07HAUSX06HA1和免疫佐劑LTB基因進行密碼子優(yōu)化，同時對各目的基因起始密碼子上游序列進行改造，修飾后基因進行全序列合成。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的技術方案，構建完整融合三株HA抗原蛋白，并添加免疫佐劑LTB的三價HA-2HA1-LTB植物安全高效表達載體。同時根據(jù)HA中的HAl是病毒與宿主細胞膜表面受體結合部位，起著誘導機體產生抗體的主要作用，在不降低融合蛋白免疫原性的前提下，為了降低植物表達載體的轉化難度，構建完整HK97HA融合HK07HA1和SX06HA1，并添加免疫佐劑LTB的三價HA-2HA1-LTB融合植物表達載體。
[0011 ] 根據(jù)本發(fā)明的【具體實施方式】，為進一步提高外源蛋白的表達水平，對目的抗原蛋白基因進行修飾改造。分別對HK97HA、HK07HAU SX06H1A和免疫佐劑LTB基因進行密碼子優(yōu)化，同時對各目的基因起始密碼子上游序列進行改造，修飾后基因進行全序列合成。在不改變禽流感血凝素抗原蛋白(HA)及免疫佐劑大腸桿菌熱敏毒素B亞基(LTB)氨基酸組成的前提下，對抗原蛋白密碼子進行優(yōu)化，以促進提高外源抗原蛋白在受體植物百脈根中的表達水平。包括:
[0012]HK97HA基因的密碼子優(yōu)化
[0013]在不改變HK97HA抗原蛋白氨基酸順序的前提下，對HK97HA基因進行優(yōu)化，HK97HA基因全長1707bp，優(yōu)化后共改變堿基1325bp，即替換了 77.6%的核苷酸。HK97HA基因優(yōu)化前后的序列分別如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
[0014]HK97 優(yōu)化前序列 SEQ ID N0.1
[0015]ATGGAAAGAACAGTGCTTCTTCTTGCAACAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAATGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAGGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAAATGGAGTGAAGCCTCTCATTTTGAGGGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAACCCTATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGCCAGTCCAGCCAATGACCTCTGTTATCCAGGGAATTTCAACGACTATGAAGAACTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCAATCATGATGCCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACCTTGGGAGGTCCTCCTTTTTCAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTGCATACCCAACAATAAAGAGGAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGATCTTTTGGTACTGTGGGGGGTTCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGACAAAGCTCTAT CAAAATCCAACCACCTACATTTCCGTTGGAACATCAACACTGAACCAGAGATTGGTTCCAGAAATAGCTACTAGACCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGAATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATGCC
【權利要求】
1.一種異性表達H5N1抗原蛋白的三價HA-2HA1-LTB融合表達載體，其特征在于，在百脈根植物表達載體的多克隆位點，由2E+35啟動子至poly(A)-Nos終止子方向，正向依次插入核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的優(yōu)化HK97HA基因、核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示的優(yōu)化HK07HA1基因、核苷酸序列如SEQ ID N0.6的優(yōu)化SX06HA1基因和核苷酸序列如SEQID N0.8所示的優(yōu)化免疫佐劑LTB基因。
2.根據(jù)權利要求1所述的異性表達H5N1抗原蛋白的三價HA- 2HA1 - LTB融合表達載體，其特征在于，所述百脈根植物`表達載體為PCAMBIA2301。
【文檔編號】C12N15/84GK103865953SQ201410030497
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年1月22日 優(yōu)先權日:2014年1月22日
【發(fā)明者】吳燕民, 何景成, 張偉偉, 盧運明, 袁蓓, 王維部, 周美亮, 鄭平, 唐益雄, 陳肖英 申請人:中國農業(yè)科學院生物技術研究所, 深圳市農科集團有限公司