一種產(chǎn)g418單組分的工程菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于抗生素制藥領(lǐng)域，涉及一種產(chǎn)G418單組分的工程菌及其應(yīng)用，該工程菌為絳紅色小單孢菌GQ175，該菌株已于2013年12月6日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保蕆，保藏編號為CGMCCNo.8543，通過破壞絳紅小單孢菌中慶大霉素的生物合成關(guān)鍵基因，阻斷慶大霉素的生物合成代謝流，促使代謝產(chǎn)物中間體G418的積累，不再合成慶大霉素復(fù)合物。本發(fā)明通過基因框內(nèi)敲除的方法滅活絳紅小單孢菌中慶大霉素生物合成基因genQ，構(gòu)建穿梭載體pDB303，pDB303轉(zhuǎn)化絳紅小單孢菌G1008，篩選雙交換菌株，發(fā)酵生產(chǎn)，代謝產(chǎn)物檢測和新組分鑒定。本發(fā)明產(chǎn)單組分G418，填補國內(nèi)至今無法生產(chǎn)G418的空白，該工程菌生產(chǎn)工藝簡單，成本低，產(chǎn)率高，便于控制，質(zhì)量穩(wěn)定。
【專利說明】—種產(chǎn)G418單組分的工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬抗生素制藥領(lǐng)域，涉及一種產(chǎn)G418單組分的工程菌及其應(yīng)用，是利用分子生物學(xué)操作技術(shù)，闡明(GenBank accession N0.:AJ628149, genQ ； AY524043.1,gntX ;AJ575343.3，gacj)基因的功能，并破壞絳紅小單孢菌G1008中氨基寡糖生物合成的關(guān)鍵基因genQ,從而獲得一株聞廣G418的工程菌，可應(yīng)用于氣基募糖制造，生廣G418。
【背景技術(shù)】
[0002]氨基糖苷類抗生素是臨床上廣泛使用的抗生素藥物，包括鏈霉素、新霉素、卡那霉素和慶大霉素等，該類化合物依賴其自身的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，結(jié)合到30S核糖體亞基的不同區(qū)域，干擾細菌蛋白質(zhì)的合成，從而殺死或抑制細菌生長。氨基糖糖苷類抗生可分為含
2-D0S和不含2-D0S兩大類。2-D0S類依據(jù)糖基的取代位置不同，又可分為4-單取代，4，
5-和4，6-雙取代等三類。G418是一種以4，6-雙取代的2-005類抗生素，可作用于真核生物的80S核糖體上，因此可被用于抗寄生蟲藥。此外，G418也被用于治療遺傳病。在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，G418是細胞轉(zhuǎn)染實驗中不可缺少的抗性篩選標(biāo)記材料。
[0003]絳紅小單孢菌G1008是慶大霉素產(chǎn)生菌，主要組分為Cla、C2a、C2和Cl。由于各組分化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，慶大霉素各組分的毒副作用也各不相同，因此獲得單組分產(chǎn)生菌，一直是科學(xué)家苦苦追求的目標(biāo)。分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，為基因工程定向育種奠定了堅實基礎(chǔ)。2006年P(guān)iepersberg.W等公布了棘孢小單孢菌慶大霉素生物合成基因簇(GenBank accession N0.:AJ628149)，長達 84222bp，2012 年洪文榮等公布了絳紅色小單孢菌的慶大霉素生物合成基因簇(GenBank accession N0.:JQ975418), 44181bp,并于2012建立了系統(tǒng)的絳紅小單孢菌接合轉(zhuǎn)移體系，為獲得重要的氨基寡糖生物合成代謝中間體，奠定了堅實基礎(chǔ)。`
[0004]氨基糖寡糖類抗生素的生物合成過程有些相似，部分慶大霉素的生物合成步驟可以根據(jù)已知的其它同類抗生素的生物合成進行推測。文獻報道有關(guān)新霉素、丁酰苷菌素和卡那霉素的生物合成，由巴龍霉胺至新霉胺的催化酶(即6丨C位的氨基化)分別是NeoQ-NeoB、BtrQ-BtrB和KanQ-KanB。慶大霉素的生物合成沒有巴龍霉素至新霉胺這一轉(zhuǎn)化，但從慶大霉素X2至J1-20A和G418至J1-20B都是C6丨位的氨基化，通過生物信息學(xué)分析，慶大霉素生物合成基因簇中與同源，因此推測作用于6 '
C位的氨基化，可以通過破壞絳紅小單孢菌G1008中的供基因，來創(chuàng)造一株高產(chǎn)G418單組分的工程菌。
[0005]目前G418由原美國先令公司獨家壟斷生產(chǎn)，默克公司參與銷售。制備G418極其困難，需要層析分離，工藝復(fù)雜，因此，價格昂貴，國內(nèi)所需G-418全部依賴進口。因此構(gòu)建中國自己的G418工程菌，生產(chǎn)G418，具有重要的生物學(xué)意義和現(xiàn)實意義。本發(fā)明是前一專利(201110331534.9)的進一步延伸和深化，屬系列性專利。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)G418單組分的工程菌及其應(yīng)用，通過滅活供基因功能的方法，獲得能產(chǎn)生不同于親株組分，只產(chǎn)G418單組分的工程菌，命名為絳紅小單孢菌cromonospora purpurea GQ175),該菌株已于2013年12月6日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保蕆，保藏編號為CGMCC N0.8543。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
通過敲除絳紅小單孢菌中卿Q基因序列，喪失其功能，主要包括以下步驟:
A.genQ同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建；
B.同源重組質(zhì)粒導(dǎo)入絳紅色小單孢菌；
C.接合子的篩選；
D.工程菌組分的鑒定。[0008]基因置換的方法為PCR分別獲得供基因上下游分子量大約2000bp的兩個片段作為交換臂，將兩者同時連接到PKC1139中，得到同源重組質(zhì)粒pDB303。
[0009]轉(zhuǎn)化是以萬co7iET12657/pUZ8002介導(dǎo)的結(jié)合轉(zhuǎn)移方法。
[0010]所述的篩選為先篩選安普霉素抗性菌株，無抗性傳代后再從中篩選到安普霉素敏感菌株，再從中篩選到不產(chǎn)慶大霉素復(fù)合物單產(chǎn)G418的轉(zhuǎn)化子。
[0011]所述的鑒定為發(fā)酵濾液采用薄層層析TLC、新組分采用HPLC-ELSD分析和MS分析。
[0012]一種產(chǎn)G418單組分的工程菌在制備抗菌藥物和抗生素藥物中的應(yīng)用。
[0013]基因破壞的方法是:借助PCR擴增上下游序列各2000 bp左右的片段作為同源交換臂，兩個片段連接到穿梭載體PKC1139上，得到穿梭質(zhì)粒PQB303，載體pKC1139上的安普霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記。
[0014]轉(zhuǎn)化是借助萬.co7i ET12657(pUZ8002)介導(dǎo)的結(jié)合轉(zhuǎn)移法。首先，篩選含安普霉素抗性(AmK)菌株，松弛培養(yǎng)數(shù)代后，再從中篩選安普霉素敏感(Ams)菌株，通過PCR分析驗證，得到雙交換工程菌，再經(jīng)發(fā)酵，提取，精制，分析，確認其是產(chǎn)單組分菌株，命名為絳紅色小單孢菌GQ175。發(fā)酵代謝組分確認，采用(TLC)薄層層析和MS法(質(zhì)譜法)，確定其分子量，與G418同質(zhì)。
[0015]其中，基因職/70的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示和氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點在于:在國際上首次采用微生物分子遺傳學(xué)技術(shù)，通過基因敲除，闡明了慶大霉素生物合成基因簇上基因，與慶大霉素絳紅糖氨C6’的氨基化有關(guān)。顯然通過敲除該基因，預(yù)測可以阻斷慶大霉素中間產(chǎn)物的進一步修飾，生物合成停止在積累G418的位點上。該方法過程機制清楚，不存在后續(xù)回復(fù)突變問題。工程菌代謝組分單一，發(fā)酵控制簡單，提取精制方便，無需層析分離，達到了潔凈的生產(chǎn)境界，填補了國內(nèi)外研究空白，不僅對生物學(xué)研究具有理論意義，而且所得到的工程菌可以直接應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化，產(chǎn)生極大的經(jīng)濟效益和社會效益，因此，具有一舉多得的顯著效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1 G418的結(jié)構(gòu)圖。
[0018]圖2敲除供基因同源交換原理圖，其中，1:質(zhì)粒PQB303游離存在；I1:親株G1008染色體組；III:GQ175染色體組；P1/P2上游交換臂引物，P3/P4下游交換臂引物，P5/P6雙交換驗證引物。
[0019]圖3穿梭質(zhì)粒PQB303及其酶切驗證圖，其中，BI為genQ的上游同源交換臂，B2為genQ 的下游同源交換臂；1:pQB303 (.EcoR I /Xba I )酶切；2:pQB303 (.Hind III)酶切；3:PQB303 (Sac I )酶切.Μ..入 _EcoT14 I digest DNA Marker。
[0020]圖4工程菌GQ175基因失活變化驗證圖，其中，M:DL5000 ；1:GQ175/(PQ5/PQ6) ；2:GQ1/(PQ5/PQ6) ；3:G1008/(PQ5/PQ6)。
[0021]圖5工程菌代謝產(chǎn)物薄層層析(TLC)分析圖，其中1:親株G1008代謝產(chǎn)物；2:GQ175代謝產(chǎn)物；3:G418標(biāo)準(zhǔn)品。
【具體實施方式】
[0022]實施例1:
1.同源重組質(zhì)粒PQB303的構(gòu)建
根據(jù)2012年洪文榮等公布的絳紅色小單孢菌的慶大霉素生物合成基因簇(GenBankaccession N0.:JQ975418,4418lbp)和Piepersberg等公布的棘孢小單孢菌慶大霉素生物合成基因族(GenBank Accession Number AJ628149),以基因的上下游序列，設(shè)計框內(nèi)敲除方案(圖2)。兩對擴增交換臂引物分別為PQ1/PQ2和PQ3/PQ4。Pl (5'-GAATTC AGGAGGTGCTCACCGACG-3' ,EcoRl), P2(5 ; - AAGCTTAGAACCGGGTGTCCCTCG -3 ;，Η?η? III) ；P3 (5 ; - AAGCTT TTCCGTTCGAAGGCGACC-3 ; , Η?η? III), Ρ4 (5 ; - TCTAGAAACGGCTCGGTGAACTCGTG-3 ; ,Xba I )。
[0023]以絳紅小單孢菌G1008的基因組為模板，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性 5min，94°C變性 lmin,· 67.5°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，72°C保持 10min，4°C保存。采用Ex-TaqDNA聚合酶，擴增基因供的上游序列，作為同源重組的交換臂BI (1995bp)。經(jīng)電泳檢測，回收目標(biāo)DNA片段，并將其克隆至pMD19-T載體，得到中間質(zhì)粒，命名為pQB301(PMD19-T::QB1);以同樣的方法擴增下游交換臂B2，并克隆到pMD19-T載體，命名為pQB302(PMD19-T::QB2)。
[0024]質(zhì)粒pQB301經(jīng)(ffi/?dIII/&oR I )雙酶切，回收1995bp的BI片段；質(zhì)粒pQB302經(jīng)mnAlll/Xba I )雙酶切，回收1917bp的B2片段；與此同時，pKC1139經(jīng)(&oR I /Xba I )雙酶切，回收大片段，并與交換臂B1、B2三個片段連接，酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，挑取抗性菌落，轉(zhuǎn)接于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取得到重組質(zhì)粒，命名為PQB303(圖3)。重組質(zhì)粒PQB303的理論圖譜中存在6個fee I限制酶酶切位點，可以將質(zhì)粒切割成6214bp、1606bp、1217bp、751bp、531bp和82bp六個線性片段，因此采用Sac I酶切重組質(zhì)粒pQB303，電泳檢測結(jié)果見圖3，電泳條帶與理論預(yù)測吻合，經(jīng)DNA測序，結(jié)果一致，證明得到的最終質(zhì)粒PQB303構(gòu)建正確。
[0025]2.絳紅小單孢菌GQl接合子的制備
穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567/pUZ8002感受態(tài)細胞，在含有阿泊拉霉素、氯霉素、卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)過夜，挑取抗性菌落并對質(zhì)粒進行驗證，得到大腸桿菌ET12567/(pUZ8002,pQB303)供體菌。過夜培養(yǎng)的供體大腸桿菌ET12567 (pUZ8002,pQB303)轉(zhuǎn)接到含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)；當(dāng)0D600達到0.3^0.6時(約3h)，收集菌體，并用新鮮LB培養(yǎng)基洗滌2次備用；將絳紅色小單孢菌孢子懸浮于5mL pH8.0的0.05mol/L TES緩沖液中，60°C水浴熱激2min，待其冷卻至室溫后加入等體積預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基，37°C振蕩(250r/min)培養(yǎng)3h ;離心收集孢子并重懸于適量的無菌水中，在混合器上振蕩打散孢子，按IO8:108與大腸桿菌細胞等量混合，涂布于絳紅色小單孢菌平板培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)24h后，用ImL的無菌水(含阿泊拉霉素和萘啶酸)覆蓋，使兩種抗生素的終濃度分別為25 μ g/mL，37 °C繼續(xù)培養(yǎng)4_6天，長出轉(zhuǎn)化子，將所獲得的AmK轉(zhuǎn)化子在含有安普霉素(50 yg / mL)的斜面培養(yǎng)基上，繼續(xù)37°C培養(yǎng)，得到單交換整合子。隨機挑選一株命名為絳紅小單孢菌GQl。
[0026]3.雙交換工程菌GQ175的篩選
將AmK轉(zhuǎn)化子在無安普霉素平板上連續(xù)傳三代以上，挑取單菌落分別點種到無安普霉素和含安普霉素(50μ g/mL)平板上，從37株中篩選獲得10個Ams菌株。提取染色體，作為模板，設(shè)計雙交換驗證引物P5/P6 (5' - TACGACGACTCACGCCAGGTCA-3 ' ;5'-TGGATCCCTGGGTGAGCTACGA -3')，進行PCR擴增和電泳檢測，結(jié)果見圖4。擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA測序，與預(yù)測吻合。證明是雙交換工程菌，供基因已經(jīng)被破壞。所得雙交換工程菌，命名為絳紅小單孢菌GQ175。
[0027]4.工程菌 發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析
對該菌株進行發(fā)酵，過濾收集發(fā)酵液，濾液通過硅膠GF254薄層層析，該菌株代謝產(chǎn)物呈單組份，不再是慶大霉素C復(fù)合物(圖5)。
[0028]實施例2:工程菌GQ175代謝產(chǎn)物的制備
1.工程菌GQ175菌株的發(fā)酵培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基:葡萄糖0.1%，玉米淀粉1.0%，玉米粉1.5%，蛋白胨0.2%，黃豆餅粉1.0%，KNO3 0.05%, CaCO3 0.5%, ρΗ7.0。
[0029]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米淀粉6.0%，玉米粉1.0%，蛋白胨0.4%，黃豆餅粉2.0 %，KNO3
0.01%, (NH4)2SO4 0.1%，CaCO3 0.5%,淀粉酶 0.025%, ρΗ7.5。
[0030]實例I步驟3中獲得的絳紅色小單孢菌GQ175的發(fā)酵。發(fā)酵前先用稀釋平板法分離出產(chǎn)孢豐富的單菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)10天，挖塊接種于種子培養(yǎng)基(裝量為50mL / 250mL三角瓶)，37°C搖床培養(yǎng)36 h (轉(zhuǎn)速為250rpm)，深沉培養(yǎng)進入對數(shù)生長期時，按10%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基(裝量為50mL/250mL三角瓶)，37°C搖床發(fā)酵120 h (轉(zhuǎn)速為 250rpm)。
[0031]20000升發(fā)酵罐生產(chǎn)，攪拌轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘，通氣量1:0.5^1.0 (M3 /M3 *min)，培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度，接種量比例，發(fā)酵時間等，類似于搖瓶發(fā)酵。
[0032]2代謝產(chǎn)物提取精制 A、粗提
發(fā)酵液稀釋后分別酸化、堿化后，用732樹脂靜態(tài)吸附61小時。收集吸附飽和樹脂，用0.01M HCl溶液酸洗飽和樹脂,再用無離子水洗滌至中性,而后用0.01%氨水進行堿洗，當(dāng)流出液達PH 9.0以上時，串聯(lián)到等體積的711樹脂柱上，收集樹脫液。
[0033]B、精制、結(jié)晶
洗脫液經(jīng)薄膜濃縮到約300000ug/mL，用濃硫酸調(diào)至pH5.5飛.0，透光度達92%以上，在攪拌下，緩慢向濃縮液中滴加入95%以上乙醇，進行結(jié)晶，時間3—4小時，之后經(jīng)離心分離，85%乙醇溶液淋洗即得濕成品。濕品經(jīng)真空干燥(真空度500mmHg以上，溫度60°C，干燥6小時)，即得硫酸G418成品。
[0034]C、代謝產(chǎn)物檢測
薄層色譜分析:展開劑為氯仿:甲醇:氨水=1:1:1 (中國藥典2010版)，振蕩混合均勻，檢測結(jié)果見圖5，圖5中的I是慶大霉素C復(fù)合物，2是工程菌GQ175的代謝產(chǎn)物，3是G418標(biāo)準(zhǔn)品。從圖5可以看出，敲除基因后，工程菌不再合成慶大霉素C復(fù)合物，GQ175的組分與原始菌株G1008不同，而與G418位移相近。
[0035]D、代謝產(chǎn)物質(zhì)譜分析:工程菌GQ175的代謝產(chǎn)物經(jīng)安捷倫質(zhì)譜儀分析，結(jié)果中450.3，464.3和478.3的峰，對應(yīng)的組分依次是慶大霉素Cla, C2和Cl ；497.3的峰，對應(yīng)的是G418 ;峰322.2的是G418的碎片峰；249.1的峰對應(yīng)的是G418的雙電荷峰。因此，從質(zhì)譜圖分析結(jié)果可以確定，工程菌代謝產(chǎn)物是單組份G418，不再合成慶大霉素C復(fù)合物。
[0036]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng) 屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)G418單組分的工程菌，其特征在于:所述工程菌為絳紅色小單孢菌GQ175，該菌株已于2013年12月6日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保蕆，保藏編號為CGMCC N0.8543。
2.一種如權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)G418單組分的工程菌的制備方法，其特征在于:通過敲除絳紅小單孢菌中g(shù)enQ基因序列，喪失其功能，主要包括以下步驟: A.genQ同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建； B.同源重組質(zhì)粒導(dǎo)入絳紅色小單孢菌； C.接合子的篩選； D.工程菌組分的鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種產(chǎn)G418單組分的工程菌的制備方法，其特征在于:基因置換的方法為PCR分別獲得基因上下游分子量2000bp的兩個片段作為交換臂，將兩者同時連接到PKC1139中，得到同源重組質(zhì)粒pDB303。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種產(chǎn)G418單組分的工程菌的制備方法，其特征在于:轉(zhuǎn)化是以萬co7iET12657/pUZ8002介導(dǎo)的結(jié)合轉(zhuǎn)移方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種產(chǎn)G418單組分的工程菌的制備方法，其特征在于:所述的篩選為先篩選安普霉素抗性菌株，傳代后再從中篩選到安普霉素敏感菌株，再從中篩選到不產(chǎn)慶大霉素復(fù)合物而單產(chǎn)G418的轉(zhuǎn)化子。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種產(chǎn)G418單組分的工程菌的制備方法，其特征在于:所述的鑒定為發(fā)酵濾液采用薄層層析TLC、新組分采用HPLC-ELSD分析和MS分析。``
7.—種如權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)G418單組分的工程菌在制備抗菌藥物和抗生素藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12P19/50GK103865840SQ201410030139
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】洪文榮, 闕新橋, 胡育龍 申請人:福州大學(xué), 福州市鼓樓區(qū)榮德生物科技有限公司