一種提高魚腥藻中玉米黃質含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高魚腥藻中玉米黃質含量的方法，特點是具體步驟如下：從鹽生杜氏藻中克隆出玉米黃質合成的關鍵限速酶基因—β-胡蘿卜素羥化酶基因，并將基因構建到穿梭表達載體pRL25C中，通過三親接合方法轉到魚腥藻中，通過抗性篩選得到轉基因的魚腥藻，并經過16000Lx強光處理后，優(yōu)點是實現轉基因魚腥藻的玉米黃質的含量較野生型藻有較大幅度的提高，最大可提高3.8倍。
【專利說明】一種提高魚腥藻中玉米黃質含量的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，尤其是涉及一種通過在魚腥藻中表達鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素羥化酶基因以提高玉米黃質含量的方法。
【背景技術】
[0002]玉米黃質(3，3’_ 二羥基-β_胡蘿卜素)作為一種天然萜烯類不飽和類胡蘿卜素，可通過Wittig方法化學合成。但化學合成的玉米黃質不僅難被人體吸收，甚至對人體有害，目前只有從天然植物或藻類提取的玉米黃質才具有抗氧化等生物活性。天然玉米黃質主要存在于蔬菜(菠菜、羽衣甘藍、玉米、辣椒等)、花卉(金盞花、萬壽菊花等)和水果(枸杞、甜橙)中，禽蛋的蛋黃中也存在玉米黃質(雞蛋、鵪鶉蛋)，但含量較低。玉米黃質和其他的類胡蘿卜素一樣，存在共軛雙鍵結構，使得玉米黃質具備強抗氧化功效，可以阻斷自由基鏈式傳遞。玉米黃質可防止脂質過氧化，而細胞脂質的過氧化與腫瘤的發(fā)生具有一定關系，因此玉米黃質具有清除自由基的能力，可有效預防癌癥，科研人員對100名大腸癌和肺癌的患者血液進行檢查，患者血液中的玉米黃質含量比健康者低大約20%。此外玉米黃質作為重要的營養(yǎng)素，抑制心血腦血管的脂質過氧化以達到預防心血管疾病和中風。玉米黃質在保護眼睛視力方面也有著不可替代的作用。氧化、光損傷是造成老年性黃斑變性和白內障的主要原因。據估計有超過1700萬美國人有AMD癥狀，超過200萬人遭遇功能性失明，而在中國也有數以萬計的人遭遇白內障痛苦。玉米黃質在保護視力方面具有獨特的生理功能。一些臨床研究發(fā)現在飲食中提高膳食纖維或血清中玉米黃質和葉黃素的含量，可有效降低老年性黃斑變性和老年性白內障患病風險。
[0003]植物中合成類胡蘿卜素途徑表明，玉米黃質是通過一系列酶作用合成，其中β_胡蘿卜素羥化酶(chyb)是玉米黃質合成過程中一個關鍵限速酶，它能以β-胡蘿卜素為底物催化形成隱黃素，隱黃素可進一步生成雙羥基終產物玉米黃質。該酶是一種非血紅素雙鐵加氧酶，它可能是通過獲得光合電子傳遞鏈中鐵氧還蛋白的電子，在含鐵的酶活性中心利用活化的分子氧去打斷β -胡蘿卜素羥化酶C3 (C3’ )處的C-H鍵并形成羥基。植物能合成玉米黃質外，許多海洋微藻能在特定的條件下具有合成玉米黃質的能力，如藍藻中的集胞藻6803、北冰洋聚球藻；綠藻中的鹽生杜氏藻等，但是藍藻中的魚腥藻中玉米黃質的含量非常低。
[0004]魚腥藻7120作為模式藻類，自身含有多種氨基酸、藻藍蛋白及類胡蘿卜素，可以作為微藻飼料，并能高效固氮而提供生物氮源。魚腥藻7120于2001年繼集胞藻6803完成全基因組測序，已經成為很多實驗室研究工作中對象。隨著三親接合轉化體系的完善，魚腥藻7120目前已經成功表 達了多種外源基因，成為藍藻中可進行外源基因轉移模式藻。轉基因藍藻在生物工程上具有廣闊的應用前景，如藥物重組，生產具有生物活性物質(抗腫瘤藥物、疫苗)，進行污水處理等等，對環(huán)境保護和醫(yī)藥研發(fā)方面產生不可估量的效益。鹽生杜氏藻的顯著特性是其在逆境脅迫下可合成比其他生物高很多的β_胡蘿卜素來抵御不利環(huán)境，同時鹽生杜氏藻中還有另一種類胡蘿卜素一玉米黃質，因此，鹽生杜氏藻chyb基因序列對提高其他植物中玉米黃質的含量具有很大的潛在價值。但是，鹽生杜氏藻不易進行外源基因轉移，且會出現整合不易、表達不穩(wěn)、基因沉默等缺點，不利于采用代謝工程策略提高次生代謝產物含量或生產藥用物質。
[0005]目前國內外還沒有公開任何關于通過在魚腥藻中表達鹽生杜氏藻胡蘿卜素羥化酶基因以提高玉米黃質含量的方法的相關研究報道。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種能使魚腥藻在強光下大量積累玉米黃質的提高魚腥藻中玉米黃質含量的方法。
[0007]本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種提高魚腥藻中玉米黃質含量的方法，具體包括以下步驟:
(1)提取鹽生杜氏藻RNA,參照PrimeScript?RTMaster Mix試劑盒說明，以RNA作為合成逆轉錄模板；
(2)鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素羥化酶基因的獲得
根據鹽生杜氏藻β_胡蘿卜素羥化酶基因(登錄號:JN118489)開放閱讀框，設計上游引物 chyb-orf-F: CGGGATCCATGCAGGCGCTACCGCTCCAG 和下游引物 chyb-orf - R: CGGAATTCCTACACTCTTTGGACGCCACAGCT，PCR 反應體系為:dd H2O 9.5 μ I,Premix Ex Taq?Hot StartVersion 12.5 μ I, chyb-orf - F I μ I, chyb-orf-R I μ I,鹽生杜氏藻 cDNA I μL，反應程序為:94°C預變性5min，I個循環(huán)；94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，32個循環(huán)；72°C延伸lOmin，I個循環(huán)；4°C保存，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得chyb目的基因條帶，純化回收連接到PMD-19T克隆載體中，轉化萬.co7i DH5a感受態(tài)細胞中，得到重組質粒 pMD_19T_chyb ；
(3)穿梭表達載體pRL-25C-chyb構建
將重組質粒pMD-19T-chyb和穿梭表達載體pRL_25C同時進行及麗Y I和及^7? I雙酶切，回收大、小目的片段，連接回收的目的基因片段和線性載體片段，16°C連接過夜，轉化挑選陽性克隆，得到穿梭表達載體pRL-25C-chyb ；
(4)供體菌的獲得
將接合轉移質粒PRL-443，輔助質粒pRL-623，pRL-25C-chyb質粒轉化到感受態(tài)細胞HB101中，采用含有50 μ g/mL卡那抗生素，34 μ g/mL氯霉素和50 μ g/mL氨芐抗生素的三抗LB固體培養(yǎng)基篩選，挑選單菌落，得到供體菌；
(5)三親接合
取一定體積對數期魚腥藻，4000 rpm室溫離心5 min，用新鮮的BGll液體培養(yǎng)基洗滌重懸兩次，使其OD665達到0.3 (I個OD濃度約4.5 X 107cells/mL)，取一定體積的供體菌，4000 rpm室溫離心5 min后用LB液體培養(yǎng)基洗滌重懸兩次，調整濃度使其與魚腥藻細胞濃度一致，將同濃度魚腥藻與供體菌按3:1體積混勻后，光照培養(yǎng)24h ；
(6)轉基因魚腥藻篩選
將混有供體菌的魚腥藻涂至硝酸纖維素酯膜上，再將硝酸纖維素酯膜置于無抗BGll固體培養(yǎng)基，倒置光照培養(yǎng)3d，再逐步將硝酸纖維素酯膜分別移至含7.5 μ g/mL卡那抗生素的BGll固體培養(yǎng)基，含15 μ g/mL卡那抗生素的BGll固體培養(yǎng)基，含20 μ g/mL卡那抗生素的BGll固體培養(yǎng)基和含30 μ g/mL卡那抗生素的BGll固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選單藻落，移至含30 μ g/mL卡那抗生素的BGll液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，逐級擴大培養(yǎng)，獲得轉基因魚腥藻；
(7)轉基因魚腥藻檢測
提取轉基因魚腥藻DNA 作為模板，采用 chyb-RT-F:CCGCCTCGTCTCAGGAATG ；chyb-RT-R:ACCGAGCCCACATCTCCATT作為引物，以野生魚腥魚腥藻DNA和質粒pRL-25C_chyb分別作為空白對照和陽性對照，進行PCR擴增；
(8)轉基因魚腥藻強光處理
將步驟(7)中PCR擴增成功的轉基因魚腥藻在普通光照下培養(yǎng)3天使鹽藻處于對數生長期，然后在黑暗條件下饑餓培養(yǎng)16 h后，置于強光16000 Lx下培養(yǎng)7天，即獲得高玉米
黃質含量的魚腥藻。
[0008]步驟(7)中PCR擴增的體系和條件為:ddH2O 9.5 μ I,Premix Ex Taq?Hot StartVersion 12.5 μ I, chyb-orf - F I μ I, chyb-orf-R I μl, DNA 1 μ l,反應程序為:94°C預變性5min，1個循環(huán)；94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，32個循環(huán)；72°C延伸10min，l個循環(huán)；4°C保存，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測chyb目的基因的整合情況。
[0009]所述的BGll液體培養(yǎng)基的配置方法如下:在800 mL水中加入50 mL貯備液1、2mL貯備液2、2 mL貯備液3、2 1^貯備液4、1 mL貯備液5和0.61g Tris，混勻后將pH值調節(jié)至8.0,加水定容至1000 mL,高壓滅菌備用,其中各忙備液成分如下表所示，
【權利要求】
1.一種提高魚腥藻中玉米黃質含量的方法，其特征在于具體包括以下步驟: (1)提取鹽生杜氏藻RNA,參照PrimeScript?RTMaster Mix試劑盒說明，以RNA作為合成逆轉錄模板； (2)鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素羥化酶基因的獲得 根據鹽生杜氏藻β_胡蘿卜素羥化酶基因(登錄號:JN118489)開放閱讀框，設計上游引物 chyb-orf-F: CGGGATCCATGCAGGCGCTACCGCTCCAG 和下游引物 chyb-orf - R: CGGAATTCCTACACTCTTTGGACGCCACAGCT，PCR 反應體系為:dd H2O 9.5 μ I,Premix Ex Taq?Hot StartVersion 12.5 μ I, chyb-orf - F I μ I, chyb-orf-R I μ I,鹽生杜氏藻 cDNA I μL，反應程序為:94°C預變性5min，I個循環(huán)；94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，32個循環(huán)；72°C延伸lOmin，I個循環(huán)；4°C保存，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得chyb目的基因條帶，純化回收連接到PMD-19T克隆載體中，轉化萬.co7i DH5a感受態(tài)細胞中，得到重組質粒 pMD_19T_chyb ； (3)穿梭表達載體pRL-25C-chyb構建 將重組質粒pMD-19T-chyb和穿梭表達載體pRL_25C同時進行及麗Y I和及^7? I雙酶切，回收大、小目的片段，連接回收的目的基因片段和線性載體片段，16°C連接過夜，轉化挑選陽性克隆，得到穿梭表達載體pRL-25C-chyb ； (4)供體菌的獲得 將接合轉移質粒PRL-443，輔助質粒pRL-623，pRL-25C-chyb質粒轉化到感受態(tài)細胞HBlOl中，采用含有50 μ g/mL卡那抗生素，34 μ g/mL氯霉素和50 μ g/mL氨芐抗生素的三抗LB固體培養(yǎng)基篩選，挑選單菌落，得到供體菌； (5)三親接合 取一定體積對數期魚腥藻，4000 rpm室溫離心5 min，用新鮮的BGll液體培養(yǎng)基洗滌重懸兩次，使其OD665達到0.3 (I個OD濃度約4.5 X 107cells/mL),取一定體積的供體菌，4000 rpm室溫離心5 min后用LB液體培養(yǎng)基洗滌重懸兩次，調整濃度使其與魚腥藻細胞濃度一致，將同濃度魚腥藻與供體菌按3:1體積混勻后，光照培養(yǎng)24h ； (6)轉基因魚腥藻篩選 將混有供體菌的魚腥藻涂至硝酸纖維素酯膜上，再將硝酸纖維素酯膜置于無抗BGll固體培養(yǎng)基，倒置光照培養(yǎng)3d，再逐步將硝酸纖維素酯膜分別移至含7.5 μ g/mL卡那抗生素的BGll固體培養(yǎng)基，含15 μ g/mL卡那抗生素的BGll固體培養(yǎng)基，含20 μ g/mL卡那抗生素的BGll固體培養(yǎng)基和含30 μ g/mL卡那抗生素的BGll固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選單藻落，移至含30 μ g/mL卡那抗生素的BGll液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，逐級擴大培養(yǎng)，獲得轉基因魚腥藻； (7)轉基因魚腥藻檢測 提取轉基因魚腥藻DNA 作為模板，采用 chyb-RT-F:CCGCCTCGTCTCAGGAATG ；chyb-RT-R:ACCGAGCCCACATCTCCATT作為引物，以野生魚腥魚腥藻DNA和質粒pRL-25C_chyb分別作為空白對照和陽性對照，進行PCR擴增； (8)轉基因魚腥藻強光處理 將步驟(7)中PCR擴增成功的轉基因魚腥藻在普通光照下培養(yǎng)3天使鹽藻處于對數生長期，然后在黑暗條件下饑餓培養(yǎng)16 h后，置于強光16000 Lx下培養(yǎng)7天，即獲得高玉米黃質含量的魚腥藻。
2.根據權利要求1所述的一種提高魚腥藻中玉米黃質含量的方法，其特征在于:步驟(7)中 PCR 擴增的體系和條件為:dd H2O 9.5 μ I, Premix Ex Taq?Hot Start Version12.5 μ I, chyb-orf - F I μ I, chyb-orf-R I μ I,DNA I μ I,反應程序為:94°C預變性5min，I個循環(huán)；94°C變性45s, 55°C退火45s, 72°C延伸lmin，32個循環(huán)；72°C延伸lOmin，I個循環(huán)；4°C保存，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測chyb目的基因的整合情況。
3.根據權利要求2所述的一種提高魚腥藻中玉米黃質含量的方法，其特征在于:所述的BGll液體培養(yǎng)基的配置方法如下:在800 mL水中加入50 mL貯備液1、2 mL貯備液2、2mL貯備液3、2 mL貯備液4、I mL貯備液5和0.61g Tris,混勻后將pH值調節(jié)至8.0，加水定容至1000 mL，高壓滅菌備用，其中各貯備液成分如下表所示，
4.根據權利要求3所述的一種提高魚腥藻中玉米黃質含量的方法，其特征在于:所述的含7.5 μ g/mL卡那抗生素的BGll固體培養(yǎng)基配置方法分別如下:取BGll培養(yǎng)液1000mL，加8g瓊脂粉，高溫高壓滅菌，冷卻至60°C時，加入7.5 mg卡那抗生素，倒入培養(yǎng)皿中冷卻備用；所述的含20μ g/mL卡那抗生素的BGll固體培養(yǎng)基配置方法分別如下:取BGll培養(yǎng)液1000 mL，加8g瓊脂粉，高溫高壓滅菌，冷卻至60°C時，加入20 mg卡那抗生素，倒入培養(yǎng)皿中冷卻備用；所述的含30 μ g/mL卡那抗生素的BGll固體培養(yǎng)基配置方法分別如下:取BGll培養(yǎng)液1000 mL，加8g瓊脂粉，高溫高壓滅菌，冷卻至60°C時，加入30mg卡那抗生素，倒入培養(yǎng)皿中冷卻備用；所述的含30 μ g/mL卡那抗生素的BGlI液培養(yǎng)基配置方法分別如下:取BGll培養(yǎng)液1000 mL，加入30mg卡那抗生素，倒入培養(yǎng)皿中冷卻備用。
5.根據權利要求2所述的一種提高魚腥藻中玉米黃質含量的方法，其特征在于:所述的LB液體培養(yǎng)基的配置方法為:蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，H20 800 ml，調pH值到7.2，補充H2O到1000 ml，高壓滅菌。
6.根據權利要求5所述的一種提高魚腥藻中玉米黃質含量的方法，其特征在于:所述的含有50 μ g/mL卡那抗生素,34 μ g/mL氯霉素和50 μ g/mL氨節(jié)抗生素的三抗LB固體培養(yǎng)基的配置方法如下:1000 ml LB液體培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂粉，高壓滅菌，冷卻至60°C時，分別加入50 mg卡那 抗生素,34 mg氯霉素和50mg氨節(jié)抗生素,倒入培養(yǎng)皿中冷卻備用。
【文檔編號】C12N1/21GK103882048SQ201410025889
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權日:2014年1月21日
【發(fā)明者】伏建平, 龔一富, 章麗, 陳夢丹, 劉曉丹, 潘益芳 申請人:寧波大學