一個(gè)植物花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子的鑒定和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一個(gè)水稻花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子的分離和功能鑒定及應(yīng)用。本發(fā)明所公開的啟動(dòng)子在植物的花藥中特異表達(dá)，在植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一個(gè)植物花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子的鑒定和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)種領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及分離的DNA，其能夠指導(dǎo)可操作地連接在其下游的核酸在植物花藥中特異轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。另外，本發(fā)明還涉及包含該DNA的表達(dá)盒和植物等，并涉及該DNA的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]外源DNA序列通過(guò)連接到特定的啟動(dòng)子從而啟動(dòng)在植物宿主中的表達(dá)，啟動(dòng)子類型的選擇決定基因的表達(dá)時(shí)間和部位。目前在農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】廣泛應(yīng)用的主要是一些組成型的強(qiáng)啟動(dòng)子，比如CaMV35S啟動(dòng)子和玉米Ubiquitin-1啟動(dòng)子，然而在利用這些啟動(dòng)子誘導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)化水稻等作物以期改良作物的品質(zhì)時(shí)，往往會(huì)由于目的基因表達(dá)的時(shí)間(發(fā)育階段特異性)或空間(組織器官特異性)不能很好地控制而導(dǎo)致改良效果不明顯，或者由于這些組成型啟動(dòng)子誘導(dǎo)基因表達(dá)量太高而對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成影響，這些都是目前利用組成型強(qiáng)啟動(dòng)子結(jié)合功能基因來(lái)改良作物品質(zhì)時(shí)遇到的障礙。[0003]植物基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)。啟動(dòng)子是重要的順式作用元件，它是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)域調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地結(jié)合，確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起關(guān)鍵作用。根據(jù)其驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的不同特點(diǎn)，啟動(dòng)子分為組成型啟動(dòng)子和特異性啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子能在所有細(xì)胞或組織中，不分時(shí)間和空間地啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄；特異性啟動(dòng)子又可分為組織特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其中誘導(dǎo)型啟動(dòng)子平時(shí)不啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄活性很低，但在某些特定的逆境信號(hào)的刺激下，轉(zhuǎn)錄活性能夠顯著地提高。
[0004]此外，在研究某些代謝過(guò)程或調(diào)節(jié)途徑時(shí)，常常需要將同一途徑上的兩個(gè)以上的基因轉(zhuǎn)化到同一個(gè)株系中去，采用轉(zhuǎn)化其中一個(gè)基因得到轉(zhuǎn)基因植株后再轉(zhuǎn)化另外一個(gè)基因，或者兩個(gè)基因分別轉(zhuǎn)化完成后再進(jìn)行雜交，都需要等待較長(zhǎng)的時(shí)間，為了提高效率縮短多個(gè)基因轉(zhuǎn)化的時(shí)間，最近有報(bào)道可以利用新的載體同時(shí)進(jìn)行多個(gè)基因的轉(zhuǎn)化，但是在多基因轉(zhuǎn)化時(shí)如果重復(fù)使用同一個(gè)啟動(dòng)子，也會(huì)由于啟動(dòng)子序列的高同源性可能導(dǎo)致基因沉默。
[0005]本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)0SJFL2基因自翻譯起始位點(diǎn)ATG往上_2520bp的啟動(dòng)子片段P0SJFL2，呈現(xiàn)出很強(qiáng)的花藥特異表達(dá)特性，在p0SJFL2轉(zhuǎn)基因水稻中，其所驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因⑶S在轉(zhuǎn)基因水稻的花藥中表現(xiàn)出很強(qiáng)的表達(dá)水平，這些數(shù)據(jù)充分表明P0SJFL2是一個(gè)很強(qiáng)的花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種P0SJFL2啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子具有在花藥中特異表達(dá)的功能，相應(yīng)啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO:1所示。將SEQ ID NO:1與報(bào)告基因⑶S相連，轉(zhuǎn)化植物，檢測(cè)分析轉(zhuǎn)基因植株中的GUS表達(dá)活性和表達(dá)模式，通過(guò)在轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉和花中都進(jìn)行GUS染色分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P0SJFL2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因主要在水稻花藥中表達(dá)，更具體地在花藥發(fā)育的P6期特異性的高表達(dá)。說(shuō)明本發(fā)明所提供的SEQ ID NO:1是一個(gè)花藥特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0007]本發(fā)明所提供的植物花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子，含有序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或包含與SEQ ID NO:1中所列核苷酸序列具有90%以上相似性的核苷酸序列，或包含來(lái)源于SEQ ID NO:1序列上的100個(gè)及100以上連續(xù)的核苷酸片段，并且可以驅(qū)動(dòng)與該啟動(dòng)子操作性連接的核苷酸序列在植物花藥中的表達(dá)。含有上述序列的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系以及宿主菌等均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增本發(fā)明所公開的SEQ ID NO:1啟動(dòng)子的任一核苷酸片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0008]本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子核苷酸序列還可用于從水稻以外的其它植物中分離相應(yīng)序列，尤其是從其他單子葉植物中進(jìn)行同源克隆。根據(jù)這些相應(yīng)序列與本文所列啟動(dòng)子序列間的序列同源性，或與本啟動(dòng)子基因的同源性，使用如PCR、雜交等技術(shù)來(lái)鑒別分離這些相應(yīng)序列。因此，根據(jù)它們與本發(fā)明所列的SEQ ID NO:1啟動(dòng)子序列(或其片段)間的序列相似性而分離的相應(yīng)片段，也包括在實(shí)施方案中。
[0009]本發(fā)明所述的“啟動(dòng)子”是指一種DNA調(diào)控區(qū)域，其通常包含能指導(dǎo)RNA聚合酶II在特定編碼序列的合適轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起始RNA合成的TATA盒。啟動(dòng)子還可包含其它識(shí)別序列，這些識(shí)別序列通常位于TATA盒的上游或5’端，通常被稱為上游啟動(dòng)子元件，起調(diào)控轉(zhuǎn)錄效率的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知曉，雖然已經(jīng)鑒定了針對(duì)本發(fā)明公開的啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸序列，但是分離和鑒定處于本發(fā)明鑒定的特定啟動(dòng)子區(qū)域的TATA盒上游區(qū)域的其它調(diào)控元件也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本文公開的啟動(dòng)子區(qū)域通常被進(jìn)一步界定為包含上游調(diào)控元件，例如用于調(diào)控編碼序列的組織表達(dá)性和時(shí)間表達(dá)功能的那些元件、增強(qiáng)子等。以相同的方式，可以鑒定、分離出使得能在目標(biāo)組織(例如雄性組織)中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子元件，將其與其它核心啟動(dòng)子一起使用，以驗(yàn)證雄性組織優(yōu)先的表達(dá)。核心啟動(dòng)子指起始轉(zhuǎn)錄所需的最小限度的 序列，例如被稱為TATA盒的序列，這是編碼蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子通常都具有的。因此，可選地，P0SJFL2啟動(dòng)子可與其自身的或來(lái)自其它來(lái)源的核心啟動(dòng)子關(guān)聯(lián)使用。
[0010]核心啟動(dòng)子可以是任何一種已知的核心啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒35S或19S啟動(dòng)子(美國(guó)專利N0.5，352，605)、泛素啟動(dòng)子(美國(guó)專利N0.5，510，474)、IN2核心啟動(dòng)子(美國(guó)專利N0.5，364，780)或玄參花葉病毒啟動(dòng)子。
[0011]所述基因啟動(dòng)子的功能可以通過(guò)以下方法進(jìn)行分析:將啟動(dòng)子序列與報(bào)告基因可操作性連接，形成可轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體，再將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)入植株中，在獲得轉(zhuǎn)基因后代中，通過(guò)觀察報(bào)告基因在植物各個(gè)組織器官中的表達(dá)情況來(lái)確認(rèn)其表達(dá)特性；或者將上述構(gòu)建體亞克隆進(jìn)用于瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)的表達(dá)載體，通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)啟動(dòng)子或其調(diào)控區(qū)的功能
[0012]用來(lái)測(cè)試啟動(dòng)子或調(diào)控區(qū)域功能的適當(dāng)表達(dá)載體的選擇將取決于宿主和將該表達(dá)載體引入宿主的方法，這類方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。對(duì)于真核生物，在載體中的區(qū)域包括控制轉(zhuǎn)錄起始和控制加工的區(qū)域。這些區(qū)域被可操作地連接到報(bào)告基因，所述報(bào)告基因包括YFP、UidA、GUS基因或熒光素酶。包含位于基因組片段中的推定調(diào)控區(qū)的表達(dá)載體可以被引入完整的組織，例如階段性花藥，或引入愈傷組織，以進(jìn)行功能驗(yàn)證。
[0013]啟動(dòng)子的活性和強(qiáng)度可以根據(jù)其驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因的mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)量來(lái)測(cè)定。報(bào)告基因(importer gene)是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說(shuō)，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)確定目的基因的表達(dá)調(diào)控特性。常用的報(bào)告基因有葡萄糖苷酸酶基因GUS，和綠色熒光蛋白基因GFP。
[0014]本發(fā)明通過(guò)⑶S報(bào)告基因來(lái)檢測(cè)啟動(dòng)子的活性和表達(dá)特性。根據(jù)⑶S基因檢測(cè)所用的底物不同，有三種檢測(cè)方法:組織化學(xué)法、分光光度法和熒光法(靈敏度為分光光度檢測(cè)法最高)，其中最為常用的是組織化學(xué)法。組織化學(xué)法檢測(cè)以5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖苷酸(X-Gluc)作為反應(yīng)底物。將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡，若組織細(xì)胞轉(zhuǎn)入了 GUS基因，并表達(dá)出了 GUS酶蛋白，在適宜的條件下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍(lán)色產(chǎn)物，這是由其初始產(chǎn)物經(jīng)氧化二聚作用形成的靛藍(lán)染料，它使各組織細(xì)胞中有⑶S表達(dá)活性的部位或位點(diǎn)呈現(xiàn)藍(lán)色，用肉眼或在顯微鏡下可看到，且在一定程度下根據(jù)染色深淺可反映出GUS活性的強(qiáng)弱。因此利用該方法可觀察到外源基因在特定器官、組織，甚至單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。
[0015]此外，本發(fā)明的啟動(dòng)子可與并非0SJFL2基因的核苷酸序列相連，以表達(dá)其它異源核苷酸序列。本發(fā)明的啟動(dòng)子核苷酸序列及其片段和變體可與異源核苷酸序列一起組裝在一個(gè)表達(dá)盒中，用于在目的植株中表達(dá)，更具體地，在該植株的雄性器官中表達(dá)。所述表達(dá)盒有合適的限制性酶切位點(diǎn)，用于插入所述啟動(dòng)子和異源核苷酸序列。這些表達(dá)盒可用于對(duì)任何植株進(jìn)行遺傳操作 ，以獲得想要的相應(yīng)表型。
[0016]本發(fā)明所公開的p0SJFL2啟動(dòng)子，可用于驅(qū)動(dòng)下列異源核苷酸序列的表達(dá)，以使轉(zhuǎn)化的植株獲得雄性不育的表型。所述異源核苷酸序列可編碼促使碳水化合物降解的酶或修飾酶、淀粉酶、脫支酶和果膠酶，更具體的如a淀粉酶基因、生長(zhǎng)素(auXin)，rot B、細(xì)胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶、親和素，或者可選自原核調(diào)控系統(tǒng)，還可以是顯性的雄性不育基因。
[0017]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明中所提到的可操作地連接在本發(fā)明啟動(dòng)子下游的核酸，其中所述的“核酸”可以是操作性連接于本文所公開的啟動(dòng)子之上的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)芐基因、結(jié)構(gòu)基因的反義基因、調(diào)芐基因的反義基因或者能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA。
[0018]本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子序列可分離自任何植物，包括但不限于蕓苔屬、玉米、小麥、高粱、兩節(jié)薺屬、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亞麻子、大豆、擬南芥屬、菜豆屬、花生、苜蓿、燕麥、油菜籽、大麥、燕麥、黑麥(Rye)、粟、蜀黍、小黑麥、單粒小麥、斯佩爾特小麥(Spelt)、雙粒小麥、亞麻、格蘭馬草(Gra_a grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麥草、甘鹿、紅莓苔子、番木瓜、香蕉、紅花、油棕、香瓜、蘋果、黃瓜、石斛、劍蘭、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、蕓苔、甜菜、咖啡、觀賞植物和松類等。優(yōu)選地，植物包括玉米、大豆、紅花、芥菜、小麥、大麥、黑麥、稻、棉花和高粱。
[0019]本發(fā)明還包括含有p0SJFL2啟動(dòng)子的構(gòu)建體,所述構(gòu)建體包括通常所說(shuō)的載體或表達(dá)盒。上述構(gòu)建體中還可包括其它組分，這主要取決于載體構(gòu)建的目的和用途，例如可進(jìn)一步包括選擇標(biāo)記基因、靶向或調(diào)控序列、穩(wěn)定序列或引導(dǎo)序列、內(nèi)含子等。表達(dá)盒還將在目標(biāo)異源核苷酸序列的3’端包括在植物中具有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子。終止子可以是本發(fā)明所提供基因的終止子，也可以是來(lái)自外源的終止子。更具體地，上述終止子可以是胭脂氨酸合酶或章魚堿合酶終止區(qū)域。[0020]在希望將異源核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物引向特定細(xì)胞器，例如質(zhì)體、造粉體，或者引向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或在細(xì)胞表面或細(xì)胞外分泌的情況下，表達(dá)盒還可包含用于編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列。此類轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域所公知的，其包括但不限于Rubisc0的小亞基、植物EPSP合酶、玉米Brittle-1葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽等。
[0021]在制備表達(dá)盒的過(guò)程中，可對(duì)多種DNA片段加以操作，以提供處于合適方向，或是處于正確讀碼框中的DNA序列。為達(dá)到此目的，可使用銜接子或接頭，將DNA片段連起來(lái)，或者進(jìn)一步包括其它操作，以提供方便的限制性酶切位點(diǎn)等。
[0022]進(jìn)一步地，本發(fā)明所提供的構(gòu)建體中還可包括選擇標(biāo)記基因，用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。所述選擇標(biāo)記基因包括賦予抗生素抗性或?qū)Τ輨┛剐缘幕?。合適的選擇標(biāo)記基因包括但不限于:氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，鏈霉素抗性基因，奇霉素抗性基因，磺胺類抗性基因，草甘磷抗性基因，草丁嶙抗性基因。所述選擇標(biāo)記基因還可以是紅色熒光基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因、花青式pi等基因。
[0023]本發(fā)明所提供的表達(dá)盒或載體可被插入質(zhì)粒、粘粒、酵母人工染色體、細(xì)菌人工染色體或其他適合轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞中的任何載體中。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，尤其是用于克隆或儲(chǔ)存多核苷酸、或用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌、根瘤土壤桿菌和毛根土壤桿菌。當(dāng)宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞時(shí)，表達(dá)盒或載體可被插入被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的基因組中。插入可以是定位的或隨機(jī)的插入。優(yōu)選地，插入通過(guò)諸如同源重組來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，表達(dá)盒或載體可保持在染色體外。本發(fā)明的表達(dá)盒或載體可存在于植物細(xì)胞的核、葉綠體、線粒體和/或質(zhì)體中。優(yōu)選地，本發(fā)明的表達(dá)盒或載體被插入植物細(xì)胞核的染色體DNA中。
[0024]本發(fā)明還包括所公開的P0SJFL2啟動(dòng)子的應(yīng)用，在某些應(yīng)用的實(shí)施方式中，可以應(yīng)用本發(fā)明所提供的P 0SJFL2啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)一些育性相關(guān)基因突變所獲得的雄性不育系的繁殖和保持，所述育性相關(guān)基因包括但不限于Ms26、Ms45、MSCAl等。
[0025]本發(fā)明的所提供的花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子可用于外源基因在花藥中的特異性表達(dá)，從而避免該外源基因在植物其他組織中持續(xù)表達(dá)所帶來(lái)的不利影響，還可以用于植物花藥生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的功能分析和鑒定；可用于雄性不育系和恢復(fù)系的創(chuàng)建；并可應(yīng)用于花粉敗育實(shí)驗(yàn)中，從而避免由植物轉(zhuǎn)基因漂移或花粉逃逸所帶來(lái)的生物安全問(wèn)題，對(duì)植物雄性不育系和恢復(fù)系的創(chuàng)造具有重要意義。
[0026]本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物使用植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)人員已知的轉(zhuǎn)化方法制備。任何方法可被用于將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)植物細(xì)胞中，以產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)化方法可包括直接和間接的轉(zhuǎn)化方法。合適的直接方法包括聚乙二醇誘導(dǎo)的DNA攝入、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、使用基因槍導(dǎo)入、電穿孔、以及顯微注射，等。在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明使用了基于土壤桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)(可參見Horsch RB等(1985) Science225:1229 ;White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants,第 I 卷，Engineering and Utilization,Academic Press,1993,pp.15-38 ；Jenes B^.Techniquesfor Gene Transfer, Transgenic Plants,第 I 卷，Engineering and Utilization,AcademicPress，1993，pp.128-143，等)。土壤桿菌菌株(例如根瘤土壤桿菌或毛根土壤桿菌)包含質(zhì)粒(Ti或Ri質(zhì)粒)和T-DNA元件，所述質(zhì)粒和元件在用土壤桿菌轉(zhuǎn)染后被轉(zhuǎn)移至植物，而T-DNA被整合進(jìn)植物細(xì)胞的基因組中。T-DNA可位于R1-質(zhì)?；騎1-質(zhì)粒上，或獨(dú)立地包含在所謂的雙元載體中。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法描述于例如中。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化最適合雙子葉植物，但是也適合單子葉植物。土壤桿菌對(duì)植物的轉(zhuǎn)化描述于例如中。轉(zhuǎn)化可導(dǎo)致瞬時(shí)或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化和表達(dá)。盡管本發(fā)明的核苷酸序列可被插入落入這些廣泛種類中的任何植物和植物細(xì)胞中，但是其尤其適用于作物植物細(xì)胞。
[0027]下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】，結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1是0SJFL2基因在水稻中的Real-time PCR表達(dá)分析，根、莖、葉、種子、P3、P6和P8分別指取自該組織器官或時(shí)期的材料中0SJFL2基因的表達(dá)情況，其中P3、P6和P8分別指P3、P6和P8期的幼穗。
[0029]圖2是表達(dá)載體pHPG的T-DNA區(qū)圖譜。LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊界；hpt表不潮霉素抗性基因；Pnos表不nos基因的啟動(dòng)子；Tnos表不nos基因的終止子；⑶S表示gus蛋白(β -葡糖醒酸酶(β -glucuronidase))基因；T35s表示35s基因的終止子；BamHI和SalI分別表示限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI的酶切位點(diǎn)；花特異啟動(dòng)子即為本發(fā)明的分離的花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子。
[0030]圖3是p0SJFL2轉(zhuǎn)基因水稻的組織、器官的⑶S染色。其中，A為轉(zhuǎn)基因水稻苗根；B為轉(zhuǎn)基因水稻苗莖；C為轉(zhuǎn)基因水稻苗葉片；D為轉(zhuǎn)基因水稻苗P3期花；E為轉(zhuǎn)基因水稻苗P6期花；F為轉(zhuǎn)基因水稻苗P8期花。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用引物均由上海英駿生物技術(shù)公司合成，測(cè)序由北`京華大基因完成，PCR試劑盒、載體構(gòu)建過(guò)程中的核酸內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程有限公司，PEASY-Tl連接試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司，T4DNA連接酶購(gòu)自Promega公司，方法均參照試劑盒提供商推薦的方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中所用的載體PCAMBIA1303可購(gòu)自于CAMBIA公司。
[0032]實(shí)施例1.0SJFL2基因在水稻中的Real-time PCR表達(dá)分析
[0033]發(fā)明人在研究中偶然發(fā)現(xiàn)，水稻0SJFL2基因僅在花的P6期表達(dá)，對(duì)花的不同時(shí)期進(jìn)行了 Realtime-PCR表達(dá)分析。取水稻植株的根、莖、葉、種子和P3期、P6期和P8期的幼穗，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，以水稻ACTIN基因作為內(nèi)參照，分析0SJFL2基因在水稻中的表達(dá)情況。本發(fā)明中所述的P3期是指穎花原基分化期，P6期是指花粉減數(shù)分裂時(shí)期，P8期是指花粉成熟期。
[0034]RT-PCR的檢測(cè)弓丨物是:
[0035]引物1:5，-CCAACTTCCCCGTCAACCT-3，(SEQ ID N0:2);
[0036]引物2:5，-TGGTAGTGCCAGATGGTCATG-3，(SEQ ID NO:3);
[0037]引物3:5，-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’(SEQ ID NO:4);
[0038]引物4:5，-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’(SEQ ID NO:5);
[0039]其中，引物I和引物2是0SJFL2基因的檢測(cè)引物；引物3和引物4是水稻內(nèi)參基因ACTIN的檢測(cè)分析引物。PCR檢測(cè)體系和程序是:[0040]
10 Xbuffer2μ L
IOmM dNTP0.4μ L
10 mM引物I (對(duì)照分析使用10 mM引物3) 0.4μ L
[0041]
10 mM引物2 (對(duì)照分析使用10 mM引物4) 0.4μ L
Taq polymerase 0.4μ L
cDNAI μ L
ddH2015.4μ L
[0042]PCR反應(yīng)條件:95°C，預(yù)變性5分鐘；94°C，變性30秒；55°C，退火30秒；72°C，延伸25秒；40個(gè)循環(huán)，720C，10分鐘。
[0043]在Real-time PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，分析軟件輸出的數(shù)據(jù)，得到的Realtime-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，0SJFL2基因的表達(dá)集中在P6期幼穗階段，在P6期時(shí)該基因的表達(dá)最為明顯，量也最高。這表明，本發(fā)明的0SJFL2基因是花器官特異性表達(dá)基因。
[0044]實(shí)施例2.啟動(dòng)子p0SJFL2的分離和鑒定
[0045]設(shè)計(jì)如下克隆啟動(dòng)子P0`SJFL2所需引物:
[0046]引物5:5’ -CGggatccTTCTGACCAAAGAAGGGCG-3’ (SEQ ID NO:6);
[0047]引物6:5’ -GgtcgacTTTCGCCGGGCAAATTC-3’ (SEQ ID NO:7);
[0048]弓丨物5中序列g(shù)gatcc為BamHI的酶切位點(diǎn)，弓丨物6中序列g(shù)tcgac為SalI的酶切位點(diǎn)。
[0049]利用啟動(dòng)子的正反向引物(其中帶下劃線部分的序列為啟動(dòng)子序列)，以植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取的水稻(日本晴)基因組DNA作為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件是:95°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸2:30分鐘；30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收，產(chǎn)物連入PEASY-Tl載體，篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果表明，所擴(kuò)增序列為我們預(yù)期的P0SJFL2啟動(dòng)子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0050]實(shí)施例3.表達(dá)載體的構(gòu)建
[0051]將測(cè)序驗(yàn)證已經(jīng)插入p0SJFL2啟動(dòng)子序列的pEASY_Tl質(zhì)粒用BamHI和SalI雙酶切，連入同樣用BamHI和Sal I雙酶切的載體pHPG中，挑取菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，選取PCR結(jié)果為陽(yáng)性的菌落進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序驗(yàn)證正確后，提取相應(yīng)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，命名為pHPG-p0SJFL2。其中，菌落PCR檢測(cè)所需引物為pHPG載體上引物，位于所克隆的啟動(dòng)子片段兩側(cè)，擴(kuò)增片段約為啟動(dòng)子的長(zhǎng)度，以菌液為模板，擴(kuò)增檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸2:30分鐘；34個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。
[0052]所構(gòu)建的表達(dá)載體pHPG-p0SJFL2的T-DNA區(qū)的圖譜如圖2所示，其中:LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊界；hpt表不潮霉素抗性基因；Pnos表不nos基因的啟動(dòng)子；Tnos表示nos基因的終止子；(^US表示gus蛋白(β -葡糖醒酸酶(β -glucuronidase))基因；T35S表示35S基因的終止子；BamHI和SalI分別表示內(nèi)切BamHI和SalI的酶切位點(diǎn)；花特異啟動(dòng)子即為實(shí)施例2獲得的pOSJFL2啟動(dòng)子。
[0053]實(shí)施例4.植物轉(zhuǎn)化和功能鑒定
[0054]利用熱激法將質(zhì)粒pHPG_p0SJFL2轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGLO菌株，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)水稻進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。從轉(zhuǎn)基因植株中分離各組織器官，進(jìn)行⑶S活性檢測(cè)，將各組織器官置于含有⑶S染色緩沖液的離心管中，放于37°C溫箱溫育過(guò)夜，然后室溫條件下在無(wú)水乙醇中脫色保存。
[0055]4.1轉(zhuǎn)基因水稻苗的組織器官染色
[0056]將轉(zhuǎn)化p0SJFL2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻的組織器官，即根、莖、葉和P3期、P6期和P8期的幼穗分別進(jìn)行⑶S染色。結(jié)果分別如圖3A、圖3B、圖3C和圖3D、E、F所示，⑶S基因只在轉(zhuǎn)基因水稻的 P6期幼穗的花藥中有很強(qiáng)的表達(dá)，顯現(xiàn)出肉眼可明顯觀測(cè)到的很強(qiáng)的藍(lán)色；而在其它各器官(葉片、莖、和根)及花的其它時(shí)期中，基本沒有檢測(cè)到GUS基因的表達(dá)。這表明，本發(fā)明的啟動(dòng)子能夠在轉(zhuǎn)基因植株P(guān)6期的花藥中指導(dǎo)其下游的GUS蛋白表達(dá)，而且這種表達(dá)具有花藥組織表達(dá)特異性。
【權(quán)利要求】
1.一種啟動(dòng)子，具有花藥特異表達(dá)的特性，其特征在于所述啟動(dòng)子的核苷酸序列選自下列組的序列之一: Ca)具有SEQ ID NO:1所示的序列； (b)在嚴(yán)格條件下能夠與(a)所述序列的DNA雜交的DNA序列； (c)包含SEQID NO:1中至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的DNA序列；和 (d)與(a)- (c)之任一所述序列互補(bǔ)的DNA序列。
2.一種表達(dá)盒，其特征在于所述表達(dá)盒包含權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子序列。
3.—種表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體包含權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。
4.一種工程菌，其特征在于所述工程菌含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
5.一種在植物中表達(dá)目的核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物體導(dǎo)入DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體含有啟動(dòng)子及操作性連接于所述啟動(dòng)子的目的核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子的核苷酸序列選自下列組的序列之一: Ca)具有SEQ ID NO:1所示的序列； (b)在嚴(yán)格條件下能夠與(a)所述序列的DNA雜交的DNA序列； (c)包含SEQID NO:1中至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的DNA序列；和 (d)與(a)- (c)之任一所述序列互補(bǔ)的DNA序列。`
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的植物為單子葉植物。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的單子葉植物為禾本科植物。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的禾本科植物為水稻或小麥。
9.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的目的核苷酸序列對(duì)于植物宿主來(lái)說(shuō)可以是同源或是異源的。
10.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的目的核苷酸序列可以是結(jié)構(gòu)基因、調(diào)芐基因、結(jié)構(gòu)基因的反義基因、調(diào)芐基因的反義基因或者能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA，其在花粉發(fā)育晚期的特異性表達(dá)可以調(diào)節(jié)花粉的育性及花粉萌發(fā)。
11.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子在以下(a)至(d)中任一項(xiàng)中的應(yīng)用: (a)培育植物品種或品系； (b)培育授粉受精能力增強(qiáng)植物品種或品系； (c)培育授粉受精能力消弱的植物品種或品系； Cd)培育雄性不育植物品種或品系。
12.權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物為單子葉植物。
13.權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中所述的單子葉植物為禾本科植物。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的禾本科植物為水稻或小麥。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103820445SQ201410017794
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】唐曉艷, 鄧興旺, 陳竹鋒 申請(qǐng)人:深圳市作物分子設(shè)計(jì)育種研究院, 深圳興旺生物種業(yè)有限公司, 興旺投資有限公司