一種兩核苷酸實時合成測序圖譜鑒定微生物種群的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種微量微生物鑒定的方法。通過兩核苷酸同時加入到測序反應(yīng)中，得到一系列峰譜信息圖。在峰譜圖中，不同模板所需的測序反應(yīng)次數(shù)不同，且在不同的測序方式下得到的測序反應(yīng)峰譜信號強(qiáng)度不同。通過這一原理可實現(xiàn)微生物菌群的鑒定。該方法有效提高了微生物鑒定的靈敏度、縮短了操作時間，為微生物的分離和鑒定提供了一種可靠的選擇。
【專利說明】—種兩核苷酸實時合成測序圖譜鑒定微生物種群的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種實現(xiàn)微生物種群鑒定的方法，具體涉及一種兩核苷酸實時合成測序圖譜鑒定微生物種群的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物的鑒定在疾病預(yù)防和治療方面有廣泛的應(yīng)用?？焖佟?zhǔn)確地檢測微生物在疾病傳染和抗菌治療中有重要的作用，尤其是少量致病微生物的檢測。例如，近年來肺結(jié)核疾病治療中抗藥株給治療帶來很大的困難，需要對菌株進(jìn)行有效的鑒定，以便采取個體化用藥的針對性治療。常用的手段是將微生物系統(tǒng)分類發(fā)育標(biāo)記分子(Phylogeneticmarkers)可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析。目前，基于系統(tǒng)分類發(fā)育標(biāo)記分子的微生物鑒定方法普遍用于微生物的分離和鑒定。這些系統(tǒng)分類發(fā)育標(biāo)記分子有16s rRNA、18s rRNA、rnpB、ropB、gyrB基因等。這些系統(tǒng)分類發(fā)育標(biāo)記分子普遍存在于微生物中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它們適用于進(jìn)化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究?；赑CR擴(kuò)增系統(tǒng)分類發(fā)育標(biāo)記分子序列來鑒定微生物種群的方法主要有 Sanger 測序，焦憐酸測序，Real-TimePCR、PCR-DGGE (Denaturing Gradient GelElectrophoresis)>PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism)等。其中，最準(zhǔn)確的方法為Sanger測序、焦磷酸測序，即是將PCR產(chǎn)物的序列的堿基信息完全測定，然后與菌株的特征序列的堿基信息進(jìn)行比對來確定，這些將特征序列的堿基信息完全確認(rèn)的測序方法被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)。然而，Sanger測序受特定設(shè)備的限制，需要到指定的場所進(jìn)行測定，使得時間上受限。相對而言，焦磷酸測序需要的儀器價格便宜，簡易的焦測序儀甚至可以方便攜帶于現(xiàn)場進(jìn)行分析。傳統(tǒng)的焦磷酸測序方法通過每次加入一種核苷酸進(jìn)行實時合成測序。每次測序反應(yīng)都能得到堿基的具體信息。通過測序得到系統(tǒng)分類發(fā)育標(biāo)記分子的序列，然后與數(shù)據(jù)庫中的菌株序列比對，鑒定具體的菌株。但是，對于傳統(tǒng)的焦測序平臺用于這些特定PCR產(chǎn)物的序列分析而言，在DNA模板量少，以及老舊的傳統(tǒng)焦測序儀器上，要準(zhǔn)確獲取長度約為50bp的序列信息不僅費(fèi)時，而且往往很難。所以，需要提出一種有效分離和鑒定微量微生物種群的方法。
[0003]本實驗室提出一種基于兩核苷酸實時合成測序的方法(ZL201210128597.9)，該方法通過同時加入未標(biāo)記的兩種dNPTs實時測序，得到一組編碼。該方法中兩核苷酸測序方式可以有三種方式:AG/CT，AC/GT，AT/CG。采用該方法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，要么將PCR產(chǎn)物分為兩份，要么對PCR產(chǎn)物焦測序之后再進(jìn)行變性。前者，對PCR產(chǎn)物樣本的需求量大，不利于微量模板的檢測和鑒定。后者，產(chǎn)物變性會相應(yīng)的增加測序步驟和測序時間，降低測序效率。但是 ，通過兩核苷酸同時加入到測序反應(yīng)中，相同模板濃度的情況下，測序得到的峰譜信號比傳統(tǒng)焦測序的峰譜信號強(qiáng)，即峰高更高。這一特點(diǎn)有利于檢測微量樣本。另外，通過兩核苷酸同時加入到測序反應(yīng)中，模板所需的測序反應(yīng)次數(shù)會相應(yīng)的減少，且不同模板在不同的測序方式下得到的峰譜信息不同，以及每次反應(yīng)得到的峰譜信號強(qiáng)度也不同。所以，可以通過比較模板測序反應(yīng)次數(shù)以及每次反應(yīng)得到的峰譜信號強(qiáng)度來鑒定微生物。所以，我們提出一種基于兩核苷酸實時合成測序圖譜鑒定微生物的方法。
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種微量微生物鑒定的方法。通過兩核苷酸同時加入到測序反應(yīng)中，得到一系列峰譜信息圖。在峰譜圖中，不同模板所需的測序反應(yīng)次數(shù)不同，且在不同的測序方式下得到的測序反應(yīng)峰譜信號強(qiáng)度不同。通過這一原理可實現(xiàn)微生物菌群的鑒定。該方法能有效提高微生物鑒定的靈敏度、縮短操作時間、為微生物的分離和鑒定提供一種可靠的選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]技術(shù)問題:本發(fā)明的目的是提供一種兩核苷酸實時合成測序圖譜實現(xiàn)微生物種群鑒定的方法。本發(fā)明為微生物種群的分類和鑒定提供了一種可行的檢測方法，有助于簡化微生物種群的鑒定。
[0006]技術(shù)方案:一種兩核苷酸循環(huán)實時合成測序圖譜鑒定微生物種群的方法，通過對微生物特定可變區(qū)的待測核酸序列進(jìn)行兩核苷酸循環(huán)的測序反應(yīng)，由測序反應(yīng)所得到的測序圖譜確定微生物具體的菌株；所述的兩核苷酸為dATPaS、dCTP、dTTP、dGTP中的兩種不同的核苷酸，所述兩核苷酸循環(huán)測序反應(yīng)指根據(jù)微生物不同菌株的特定可變區(qū)的待測核酸序列具有特定的測序 圖譜，從(dATPaS+dCTP )/ (dGTP+dTTP )、(dATPaS+dGTP )/ (dCTP+dTTP )、(dATPaS+dTTP ) / (dCTP+dGTP )三組中任意選擇其中一組進(jìn)行的兩核苷酸循環(huán)測序反應(yīng)，其中，dATPa S (deoxyadenosine alfa-thio triphosphate)是 dATP 的替代物，因為 DNA 聚合酶對dATP a S的催化效率比對dATP的催化效率高。所述的測序反應(yīng)得到的測序圖譜包括參與合成反應(yīng)的核苷酸種類(峰的類型)，以及合成核苷酸的數(shù)目(峰的高度或者信號強(qiáng)度)。
[0007]進(jìn)一步地，所述的微生物特定可變區(qū)的待測核酸序列先通過PCR擴(kuò)增后再進(jìn)行兩核苷酸循環(huán)實時合成測序。所述測序圖譜的特征包括峰的類型、峰的高度，以及峰的排列形式構(gòu)成的全部信息。
[0008]進(jìn)一步地，dNTPs合成實時釋放相同的檢測分子，其檢測分子是化學(xué)發(fā)光檢測的焦磷酸鹽，電化學(xué)檢測的氫離子或者光學(xué)檢測的熒光信號。
[0009]進(jìn)一步地，微生物特定可變區(qū)在兩核苷酸組合測序方式(AG/CT，AT/CG和AC/GT)下，得到三組不同的測序峰譜信息。根據(jù)不同微生物種群的可變區(qū)需要進(jìn)行不同次數(shù)的兩核苷酸合成反應(yīng)，以及不是每次測序反應(yīng)都能得到相同的測序信號強(qiáng)度，我們即可鑒定出該序列所屬的菌株。
[0010]如果兩種菌株在一種測序方式下(AG/CT，AT/CG和AC/GT中的任意一種)得到的峰譜信息圖完全相同，則可以選擇其他兩種中任意一種測序方式進(jìn)行鑒定；如果兩種菌株的特定可變區(qū)在AG/CT，AT/CG和AC/GT的測序方式下，得到的菌株都相同(這種情況下可變區(qū)完全相同，傳統(tǒng)測序的方法也無法鑒定)，可以選擇其他可變區(qū)進(jìn)行測序。
[0011]有益效果:
[0012]本發(fā)明應(yīng)用兩核苷酸同時加入到測序反應(yīng)中，測定微生物菌群的特定可變區(qū)，根據(jù)不同微生物菌群特定的可變區(qū)需要不同數(shù)目的測序次數(shù)，以及不同微生物菌群特定的可變區(qū)得到不同測序峰譜信息的原理，不同種、不同屬的微生物都能準(zhǔn)確地鑒定出來。
[0013]1.本發(fā)明通過結(jié)合菌株測序所需的反應(yīng)次數(shù)以及每次測序所得的信號強(qiáng)度來進(jìn)一步鑒定微生物。[0014]2.本發(fā)明直接采用商品化、非標(biāo)記的天然核苷酸進(jìn)行合成測序，在提高測序長度的同時還降低了測序成本。
[0015]3.本發(fā)明的最大優(yōu)點(diǎn)是按照微生物種群測序所得到的峰譜信息鑒定微生物種群。
[0016]4.本發(fā)明與傳統(tǒng)測序方法分離鑒定微生物種群相比，不僅減少反應(yīng)次數(shù)，而且對少量樣本具有較高的靈敏性，可以用于微量樣本的種群鑒定。
[0017]5.本發(fā)明操作簡單。它可以在任何基于合成測序的測序平臺進(jìn)行，操作簡單、易行。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明兩核苷酸實時合成測序圖譜鑒定微生物種群的流程圖。選定待測菌群的可變區(qū)(a)作為測序靶點(diǎn)。例如，選擇rnpB (RNase P RNA)基因作為測序靶點(diǎn)。測序靶點(diǎn)的選擇要具備以下兩個條件:(I)普遍存在于微生物中；(2 )既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域。理論上根據(jù)各菌群的部分可變區(qū)核苷酸序列進(jìn)行兩核苷酸實時合成測序圖譜預(yù)測，得到各可變區(qū)焦測序后的峰譜信息圖。該峰譜信息圖包括參與反應(yīng)的堿基種類、個數(shù)以及測序峰高(即信號強(qiáng)度)。
[0019]提取菌群的DNA模板，在聚合酶作用下PCR擴(kuò)增部分可變區(qū)。PCR產(chǎn)物的5’端固定在載體上，測序引物與固定的PCR產(chǎn)物雜交進(jìn)行焦磷酸測序。測序方式從(((^1?0 5+(?^?)/ (dCTP+dTTP )、(dATP a S+dCTP ) / (dGTP+dTTP )、(dATP a S+dTTP ) / (dCTP+dGTP ))三種中任選一種。這里以(dATP a S+dGTP) / (dCTP+dTTP)的測序方式為例。首先，按照dATP a S/dGTP=l的比例將兩核苷酸加入，在聚合酶作用下反應(yīng)進(jìn)行焦磷酸測序。其次，再按照dCTP/dTTP=l的比例將兩核苷酸加入，在聚合酶作用下反應(yīng)進(jìn)行焦磷酸測序。不斷循環(huán)加入(dATP a S+dGTP)/ (dCTP+dTTP)`進(jìn)行焦磷酸測序，直到得到一組含有堿基種類、信號強(qiáng)度測序圖譜為止(b)。測序時通過對核苷酸合成后產(chǎn)生的特定分子濃度(如焦磷酸鹽，氫離子或者光學(xué)檢測的熒光分子等)通過轉(zhuǎn)化為光、電等信號進(jìn)行實時檢測，得到該次測序反應(yīng)測定的包含堿基種類、個數(shù)以及峰高信息的測序峰譜圖。
[0020]根據(jù)測序圖譜信息，比較待測菌群的測序反應(yīng)數(shù)目。首先，如果圖譜中測序反應(yīng)總次數(shù)相同(C)，則比較每次測序得到的信號強(qiáng)度。依次從第1次測序反應(yīng)的信號強(qiáng)度開始比較。如果第I~n次反應(yīng)所得的信號強(qiáng)度相同，則比較第n+1次測序反應(yīng)的信號強(qiáng)度，直到信號強(qiáng)度不同為止。然后，再與預(yù)測的峰譜信息作比較，由此可以依次確定不同菌株。如果測序反應(yīng)總次數(shù)不同(d)，則直接與預(yù)測得到的菌株測序峰譜信息比較，從第1次測序得到的峰譜信息開始比較，直到可以確定具體的菌株(e)。
[0021]如果某兩種菌株在特定測序方式下(AG/CT，AT/CG和AC/GT中的任意一種)得到的峰譜信息完全相同，則可以選擇其他兩種中的任意一種測序方式進(jìn)行鑒定；如果某兩種菌株的特定可變區(qū)在AG/CT、AT/CG和AC/GT三種測序方式下得到的菌株峰譜信息都相同(這種情況下可變區(qū)完全相同，傳統(tǒng)測序方法也無法鑒定)，可以選擇其他可變區(qū)進(jìn)行測序。
[0022]圖2是模擬兩核苷酸實時合成測序得出的13種分支桿菌(M.paratuberculosis、M.tuberculosis、M.gastr1、M.kansasi1、M.marinur、M.gordonae、M.malmoense、M.leprae、M.1ntracellular、M.xenop1、M.celatum、M.fortuitum、M.smegmatis)部分 rnpB 基因焦測序所得的峰譜信息預(yù)測圖。該圖模擬了循環(huán)加入(dATPa S+dTTP)以及(dGTP+dCTP)的混合物進(jìn)行兩種核苷酸實時合成焦測序得到的測序圖譜。圖譜中，橫坐標(biāo)表示每次測序反應(yīng)所加入的兩種核苷酸的種類為(dATPa S+dTTP)和(dGTP+dCTP)。AT代表加入dATP a S和dTTP的混合物進(jìn)行測序。同理，GT代表加入dGTP和dTTP的混合物進(jìn)行測序；縱坐標(biāo)表示每次測序反應(yīng)得到的峰譜信號強(qiáng)度(即峰的高度或者合成的堿基數(shù)目)。
[0023]圖3為M.paratuberculosis以及M.celaturn菌株的兩核苷酸實時焦測序所獲得的峰譜信息圖。該圖為循環(huán)加入(dATPa S+dCTPs)以及(dGTP+dTTP)兩核苷酸的混合物進(jìn)行實時焦磷酸測序。該圖中，橫坐標(biāo)為循環(huán)加入的測序方式為:AC/GT。其中，A代表加入dATP a S和dCTP的混合物進(jìn)行測序。同理，T代表加入dGTP和dTTP的混合物進(jìn)行測序?？v坐標(biāo)表示測序反應(yīng)的信號強(qiáng)度。峰譜上方的標(biāo)注表示峰的信號強(qiáng)度和加入反應(yīng)的兩核苷酸種類，如AC2表示加入dATP a S和dCTP的混合物進(jìn)行焦測序，且測序得到的信號強(qiáng)度是2 ；GT1表示加入dGTP和dTTP的混合物進(jìn)行焦磷酸測序，且測序得到的信號強(qiáng)度是I。
[0024]其中， 及反應(yīng)所需的酶購自凱杰生物技術(shù)(上海)有限公司(QIAGENChina(Shanghai)C0.，Ltd),實驗中所用的菌株來東南大學(xué)中大醫(yī)院結(jié)核病患者的臨床分離株。
【具體實施方式】
[0025]實施例一:兩核苷酸實時合成測序圖譜鑒定微生物種群的方法
[0026]1.13種分支桿菌(Mycobacteriumsp.) rnpB基因峰譜預(yù)測
[0027]以 13 種分支桿菌(M.paratuberculosis、M.tuberculosis、M.gastr1、M.kansasi1、M.marinur、M.gordonae、M.malmoense、M.leprae、M.1ntracellular、M.xenop1、M.celatum、M.fortuitum、M.smegmatis)為例，闡述兩核苷酸實時測序峰譜鑒定微生物種群的方法。該例中選取rnpB基因作為測序靶點(diǎn)。這13種分支桿菌的部分rnpB基因可變區(qū)的序列如表1所示。首先，根據(jù)菌株的基因序列預(yù)測這13種分支桿菌屬的部分rnpB基因可變區(qū)在兩核苷酸實時合成測序的情況下得到的峰譜信息。
[0028]表1各菌株部分可變區(qū)序列
[0029]
【權(quán)利要求】
1.一種兩核苷酸循環(huán)實時合成測序圖譜鑒定微生物種群的方法，其特征在于，通過對微生物特定可變區(qū)的待測核苷酸序列進(jìn)行兩核苷酸循環(huán)的測序反應(yīng)，由測序反應(yīng)所得到的測序圖譜確定微生物具體的菌株；所述的兩核苷酸為dATPaS、dCTP、dTTP、dGTP中的兩種不同的核苷酸，所述兩核苷酸循環(huán)測序反應(yīng)指從(dATPaS+dCTP) / (dGTP+dTTP)、(dATPaS+dGTP) / (dCTP+dTTP)、(dATPaS+dTTP) / (dCTP+dGTP)三組中選擇其中一組進(jìn)行兩核苷酸循環(huán)測序反應(yīng)，所述的測序反應(yīng)得到的測序圖譜包括參與合成反應(yīng)的核苷酸種類(峰的類型)，以及合成核苷酸的數(shù)目(峰的高度或者信號強(qiáng)度)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兩核苷酸循環(huán)實時合成測序圖譜鑒定微生物種群的方法，其特征在于，所述的微生物特定可變區(qū)的待測核酸序列先通過PCR擴(kuò)增后再進(jìn)行兩核苷酸循環(huán)實時合成測序。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兩核苷酸循環(huán)實時合成測序圖譜鑒定微生物種群的方法，其特征在于，所述測序圖譜的特征包括峰的類型、峰的高度，以及峰的排列形式構(gòu)成的全部信息。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兩核苷酸循環(huán)實時合成測序圖譜鑒定微生物種群的方法，其特征在于，dNTPs合成實時釋放相同的檢測分子，其檢測分子是化學(xué)發(fā)光檢測的焦磷酸鹽，電化學(xué)檢測的氫離子或者光學(xué)檢測的熒光信號。
【文檔編號】C12Q1/68GK103740824SQ201410009116
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】肖鵬峰, 浦丹 申請人:東南大學(xué)