優(yōu)化episomal技術(shù)建立人ips的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種優(yōu)化episomal技術(shù)建立人ips的方法，本發(fā)明是建立在無插入的episomal技術(shù)上，通過對reprogramming培養(yǎng)中的氧含量降低為5%，外周血培養(yǎng)液為紅系培養(yǎng)液，單核細(xì)胞在體外培養(yǎng)8天電轉(zhuǎn)，誘導(dǎo)后建系時換為無feeder的E8培養(yǎng)液，使iPS效率又有顯著提高，并且iPS細(xì)胞系的建立和擴(kuò)增效率也有明顯提高。為建立人iPS細(xì)胞庫的提供可行性。
【專利說明】優(yōu)化episomal技術(shù)建立人ips的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種建立人ips的方法,特別涉及一種優(yōu)化episomal技術(shù)建立人ips的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]2006年，日本科學(xué)家Yamanaka的研究組將4種轉(zhuǎn)錄因子(0ct4/Sox2/Klf4/c-Myc)導(dǎo)入小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，獲得了類似于胚胎干細(xì)胞的多能性干細(xì)胞，稱之為“誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞”(induced pluripotent stem cells, iPS 細(xì)胞)[1]。2007 年,Yamanaka 博士 [2]和美國Thomson博士研究組[3]分別用特定的因子誘導(dǎo)人類成纖維細(xì)胞，也使之成為了 iPS細(xì)胞。iPS細(xì)胞的分離培養(yǎng)成功是干細(xì)胞研究乃至生命科學(xué)領(lǐng)域的里程碑，它首次證明:可以用已知的幾種因子在體外逆轉(zhuǎn)已經(jīng)分化的細(xì)胞，使之成為全新的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞，這項技術(shù)避免了干細(xì)胞研究領(lǐng)域的免疫排斥和倫理道德問題。 [0003]盡管近年來iPS技術(shù)不斷取得發(fā)展，各種改良技術(shù)時有出現(xiàn)。然而重編程效率低下一直都是科學(xué)家們頭疼的問題，成為了 iPS臨床轉(zhuǎn)化的重要障礙之一。經(jīng)典的利用病毒為載體將轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入分化細(xì)胞的方法，很可能導(dǎo)致外源基因插入細(xì)胞的基因組中，引起插入突變，存在很大的弊端，iPS細(xì)胞的致瘤性影響其在再生醫(yī)學(xué)和臨床細(xì)胞治療中的應(yīng)用[4]。轉(zhuǎn)錄因子c-Myc本身就是一種原癌基因。解析體細(xì)胞重編程過程中的分子調(diào)控機(jī)制，開發(fā)出高效安全的iPS技術(shù)成為了近年來干細(xì)胞領(lǐng)域研究人員的熱點。
[0004]供體細(xì)胞類型影響iPS細(xì)胞的形成效率和安全性。2008年，Yamanaka博士的研究組嘗試?yán)眯∈笪负透蔚募?xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)由胃和肝細(xì)胞產(chǎn)生的iPS細(xì)胞的成瘤性明顯低于皮膚成纖維細(xì)胞來源的iPS細(xì)胞[5]。采集皮膚細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞需要六七十天時間，而從血液采集細(xì)胞制備iPS細(xì)胞只需3周左右，而且人外周血細(xì)胞來源豐富，采集方法便利，創(chuàng)傷性小，安全性好。人外周血細(xì)胞是當(dāng)前最理想的供體細(xì)胞之一，具有安全、方便、數(shù)量多等優(yōu)勢[6]。
[0005]使用病毒載體轉(zhuǎn)染外源基因制備iPS細(xì)胞不僅操作過程復(fù)雜、對實驗室設(shè)備和管理要求嚴(yán)格，而且細(xì)胞有可能引發(fā)腫瘤的形成，這就阻礙了 iPS細(xì)胞技術(shù)的普及和在臨床應(yīng)用的推廣。當(dāng)前應(yīng)用基因非整合方法建立iPS細(xì)胞主要有以下幾個方面I)腺病毒載體，2)質(zhì)?；蛘適inicircle DNA，3)蛋白直接導(dǎo)入，但是這三種方法重建效率均非常低，難以滿足基礎(chǔ)實驗需要和臨床應(yīng)用研究。仙臺病毒m及改良mRNA方法M建立非整合iPS細(xì)胞的效率很高，但是費(fèi)用相當(dāng)高，不適用于大規(guī)模臨床治療的開展。Episomal Vectors是目前最高效最經(jīng)濟(jì)的基因非整合建立iPS細(xì)胞的方法[9]。
[0006]2013年5月張孝兵教授[1°]應(yīng)用改良的表達(dá)0ct4/Sox2/Klf4/c_Myc的EV成功地將人外周血單個核細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，重編程效率顯著高于以往實驗報導(dǎo)。我們在此基礎(chǔ)上，我們通過改善培養(yǎng)中的氧含量，培養(yǎng)液，和iPS培養(yǎng)條件使iPS效率又有顯著提高，并且iPS細(xì)胞系的建立和擴(kuò)增效率也有明顯提高。
[0007]應(yīng)用EV基因非整合方法將人外周血細(xì)胞重編程，建立更安全高效的iPS細(xì)胞技術(shù):有利于下一步建立特異的針對嚴(yán)重危害我國人民身體健康的各種神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心臟和肝臟疾病以及艾滋病的iPS細(xì)胞系；有利于發(fā)展疾病特異性iPS細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的技術(shù)，從而利用這些細(xì)胞模型深入研究疾病的發(fā)病機(jī)制和發(fā)生規(guī)律；有利于建立iPS細(xì)胞和定向分化模型進(jìn)行藥物評價和篩選；有利于建立iPS細(xì)胞庫，為再生醫(yī)學(xué)實現(xiàn)個體化治療。
[0008][I] Takahashi K，Yamanaka S.1nduction of pluripotent stem cellsfrom mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell.2006;126:663-76.[0009][2]Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.1nduction of pluripotent stemcells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell.2007;131:861-72.[0010][3] Yu Jj Vodyanik MAj Smuga-Otto K，et al.1nduced pluripotent stem celllines derived from human somatic cells.Science.2007;318:1917-20.[0011][4]Okita Kj Yamakawa T，Matsumura Y，et al.An efficient nonviral method togenerate integration-free human-1nduced pluripotent stem cells from cord bloodand peripheral blood cells.Stem Cells.2013;31:458-66.[0012][5]Aoi T，Yae Kj Nakagawa M，et al.Generation of pluripotent stem cellsfrom adult mouse liver and stomach cells.Science.2008;321:699-702.[0013][6] Loh YHj Agarwal S，Park IHj et al.Generation of induced pluripotentstem cells from human blood.Blood.2009;113:5476—9.[0014][7]Seki T，Yuasa S，F(xiàn)ukuda K.Generation of induced pluripotent stem cellsfrom a small amount of human peripheral blood using a combination of activatedT cells and Sendai virus.Nat Protoc.2012;7:718-28.[0015][8] Lin T，Ambasudhan R，Yuan X，et al.A chemical platform for improvedinduction of human iPSCs.Nat Methods.2009;6:805-8.[0016][9] Yu J，Hu K，Smuga-Otto K，et al.Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.Science.2009;324:797-801.[0017][10] Su RJj Bay I ink DJ，Neises A，et al.Efficient Generation ofIntegration-Free iPS Cells from Human Adult Peripheral Blood Using BCL-XLTogether with Yamanaka Factors.PLoS One.2013;8:e64496.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:通過對培養(yǎng)條件(單核細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)時間,質(zhì)粒選擇，reprogramming中氧含量，iPS單克隆培養(yǎng)換為Feeder free E8培養(yǎng)基)等改良，使episomal這種重編程效率很低的技術(shù)獲得新生，效率有非常明顯的提高，完全可以用5ml人外周血就可以獲得iPS細(xì)胞系的技術(shù)。
[0019]本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0020]一種優(yōu)化episomal技術(shù)建立人ips的方法,包括如下步驟:
[0021]利用ficoll梯度離心技術(shù)分離外周血單核細(xì)胞，利用紅系培養(yǎng)體系，即使用紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)單核細(xì)胞，體外培養(yǎng)8天,利用Amaxa細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀電轉(zhuǎn)episomal的pEVSFFV-OS (OS)，pEV SFFV-MK (MK)，pEV SFFV-B⑶三個質(zhì)粒，放在feeder上，電轉(zhuǎn)后到利用機(jī)械手段建立iPS細(xì)胞系之前在低氧條件下培養(yǎng)；低氧條件:5%02，5%C02，90%N2的混合氣體，利用紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)I天，再應(yīng)用紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基和hESC培養(yǎng)基(質(zhì)量比1:1)培養(yǎng)，而后逐漸換成人ES培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天換為CM (條件培養(yǎng)基:培養(yǎng)新鮮feeder —天的ES培養(yǎng)液)。培養(yǎng)12-15天看到人iPS細(xì)胞克隆，20天左右將每個克隆挑出培養(yǎng)在24孔板中，利用feeder-free培養(yǎng)液E8培養(yǎng)液培養(yǎng)。傳代10代后檢測ES特性，合格的為iPS細(xì)胞系。
[0022]進(jìn)一步，電轉(zhuǎn)后第2天開始在培養(yǎng)基中加入0.25mM NaB提高重編程效率，第10天停止。
[0023]所述的紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在SFM的基礎(chǔ)上進(jìn)一步添加如下組分:SCF終濃度100ng/ml, IL-3終濃度10ng/ml，EPO終濃度2U/ml，IGF-1終濃度40ng/ml，地塞米松終濃度I μ M，轉(zhuǎn)鐵蛋白終濃度100 μ g/ml。
[0024]其中Serum free medium (SFM)組成為:
[0025]
IMDi (Invifrogen, cat.n0.21056023)50%
Ham’ s F-12 (Mediatech, cat.n0.10-080-CV)50%
[0026]Bovine serum albumin (BSA) (Sigma, A9418)5 mg/ml
Ascorhic acid (Sigma, cat.no, Λ8960) 50 tig/ml
1-Thio?!yc<'rol, 98? (Sigma, cat, no, \16M5) 200 μ \1
l.-G Iutiimi nc (Invitrogenf cut.n0.21051021) 100X
ITS-X (Invitrogcn, c.at, no, 51500^03(1) 100X
synthetic lipids (Invitrogen, cat.no, 11905031) 100X ?
[0027]更具體地,該優(yōu)化episomal技術(shù)建立人ips的方法,包括如下步驟:
[0028]利用ficoll梯度離心技術(shù)分離外周血單核細(xì)胞，利用紅系培養(yǎng)體系培養(yǎng)單核細(xì)胞，體外培養(yǎng)8天，利用Amaxa細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀進(jìn)行細(xì)胞核轉(zhuǎn)染，IxlO6細(xì)胞加入100 μ I配置好的電轉(zhuǎn)緩沖液(包含質(zhì)粒 pEV SFFV-OS (OS) +pEV SFFV-MK (MK) +pEV SFFV-B (B))，混合均勻后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯，放到電轉(zhuǎn)槽內(nèi)，利用U-008轉(zhuǎn)染程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)。放在feeder上，電轉(zhuǎn)后到利用機(jī)械手段建立iPS細(xì)胞系之前在低氧條件下培養(yǎng)；用低氧培養(yǎng)箱或低氧培養(yǎng)盒，在密閉的培養(yǎng)盒或培養(yǎng)箱內(nèi)沖入5%02，5%C02，90%N2的混合氣體，每天換液時換氣；利用紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)I天，應(yīng)用`紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基和hESC培養(yǎng)基(質(zhì)量比1:1)培養(yǎng)，而后逐漸換成人ES培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天換為CM，即條件培養(yǎng)基:培養(yǎng)新鮮feeder —天的ES培養(yǎng)液。電轉(zhuǎn)后第2天開始在培養(yǎng)基中加入0.25mM NaB提高重編程效率，第10天停止，培養(yǎng)12-15天可以看到人iPS細(xì)胞克隆，20天左右將每個克隆挑出培養(yǎng)在24孔板中，利用feeder-free培養(yǎng)液E8培養(yǎng)液培養(yǎng)，傳代10代后檢測ES特性，合格的為iPS細(xì)胞系。
[0029]進(jìn)一步，所述的hESC培養(yǎng)基組成為:
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種優(yōu)化episomal技術(shù)建立人ips的方法，其特征在于:包括如下步驟:利用ficoll梯度離心技術(shù)分離外周血單核細(xì)胞，利用紅系培養(yǎng)體系，即使用紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)單核細(xì)胞，體外培養(yǎng)8天，利用Amaxa細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀電轉(zhuǎn)episomal的pEVSFFV-OS (OS)，pEV SFFV-MK (MK)，pEV SFFV-B⑶三個質(zhì)粒，放在feeder上，電轉(zhuǎn)后到利用機(jī)械手段建立iPS細(xì)胞系之前在低氧條件下培養(yǎng)；低氧條件:5%02，5%C02，90%N2的混合氣體，利用紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)I天，再應(yīng)用紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基和hESC培養(yǎng)基(質(zhì)量比1:1)培養(yǎng)，而后逐漸換成人ES培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天換為CM (條件培養(yǎng)基:培養(yǎng)新鮮feeder —天的ES培養(yǎng)液)，培養(yǎng)12-15天看到人iPS細(xì)胞克隆，20天左右將每個克隆挑出培養(yǎng)在24孔板中，利用E8培養(yǎng)液培養(yǎng)，傳代10代后檢測ES特性，合格的為iPS細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在SFM的基礎(chǔ)上進(jìn)一步添加如下組分:SCF終濃度100ng/ml，IL-3終濃度10ng/ml，EPO終濃度2U/ml，IGF-1終濃度40ng/ml，地塞米松終濃度I μ Μ，轉(zhuǎn)鐵蛋白終濃度100 μ g/ml ； 其中SFM組成為: IMDi50% Hanf s P-1250%Bovine.serum albimin (HSA)5 mg/mlAscorb ?; acid50 ug/ml1-Thio?IyccroI, 98 ?200 pi 1.-C Iutiiini nc100 X ITS-XIOOXsynthetic lipids100Xo
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法,其特征在于:該優(yōu)化episomal技術(shù)建立人ips的方法，包括如下步驟:利用ficoll梯度離心技術(shù)分離外周血單核細(xì)胞，利用紅系培養(yǎng)體系培養(yǎng)單核細(xì)胞，體外培養(yǎng)8天，利用Amaxa細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀進(jìn)行細(xì)胞核轉(zhuǎn)染，IxlO6細(xì)胞加入100 μ I配置好的電轉(zhuǎn)緩沖液(包含質(zhì)粒pEV SFFV-OS(OS) +pEV SFFV-MK(MK)+pEVSFFV-B (B))，混合均勻后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯，放到電轉(zhuǎn)槽內(nèi)，利用U-008轉(zhuǎn)染程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)。放在feeder上，電轉(zhuǎn)后到利用機(jī)械手段建立iPS細(xì)胞系之前在低氧條件下培養(yǎng)；用低氧培養(yǎng)箱或低氧培養(yǎng)盒，在密閉的培養(yǎng)盒或培養(yǎng)箱內(nèi)沖入5%02，5%C02,90%N2的混合氣體，每天換液時換氣；利用紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)I天，應(yīng)用紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)基和hESC培養(yǎng)基(質(zhì)量比1:1)培養(yǎng)，而后逐漸換成人ES培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天換為CM，即條件培養(yǎng)基:培養(yǎng)新鮮feeder —天的ES培養(yǎng)液。電轉(zhuǎn)后第2天開始在培養(yǎng)基中加入0.25mM NaB提高重編程效率，第10天停止，培養(yǎng)12-15天可以看到人iPS細(xì)胞克隆，20天左右將每個克隆挑出培養(yǎng)在24孔板中，利用E8培養(yǎng)液培養(yǎng)，傳代10代后檢測ES特性，合格的為iPS細(xì)胞系。
【文檔編號】C12N5/10GK103756970SQ201410008523
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月2日
【發(fā)明者】程濤, 李彥欣, 顧海慧, 劉淑萍, 許靜, 袁衛(wèi)平, 張孝兵 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所）