除草劑耐受性棉花事件pDAB4468.18.07.1的制作方法
【專利摘要】棉花事件pDAB4468.18.07.1包括編碼AAD-12和PAT的基因，該事件為含有該事件的棉花作物提供了除草劑耐受性，并為作物保護(hù)方法提供了可能。ATCC PTA-1245620120123
【專利說(shuō)明】除草劑耐受性棉花事件PDAB4468. 18. 07. 1
[0001] 優(yōu)先權(quán)聲明
[0002] 本專利申請(qǐng)要求獲得于2012年1月23日提交的題為"除草劑耐受性棉花事件 PDAB4468. 18.07. 1"(HERBICIDE TOLERANT COTTON EVENT pDAB4468. 18.07. 1)美國(guó)臨時(shí)專 利申請(qǐng)系列號(hào)61/589,602的申請(qǐng)日的利益。
[0003] 背景
[0004] 當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時(shí)，編碼AAD_12(芳氧基鏈烷酸酯（aryloxyalkanoate)雙 加氧酶-12)的基因能夠引入針對(duì)苯氧基乙酸類除草劑2, 4-D和MCPA、和吡啶基氧基乙酸 除草劑綠草定和氟草煙的產(chǎn)業(yè)水平的耐受性。當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時(shí)，編碼PAT (草銨膦 乙酰轉(zhuǎn)移酶（phosphinothricin acetyltransferase))的基因能夠引入針對(duì)除草劑草銨膦 (草胺膦）的耐受性。PAT已經(jīng)成功地在棉花中表達(dá)，用作生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因作物的選擇標(biāo)志物并 用于在轉(zhuǎn)基因植物中引入針對(duì)除草劑草胺膦的產(chǎn)業(yè)水平的耐受性。
[0005] 已知轉(zhuǎn)基因在植物中的表達(dá)受到其在植物基因組中定位的影響，這可能是由于靠 近整合位點(diǎn)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)（例如異染色質(zhì)）或者近鄰轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件（例如增強(qiáng)子）所致 (Weising et al.，Ann. Rev. Genet. 22:421-477, 1988)。與此同時(shí)，轉(zhuǎn)基因在基因組的不同 位點(diǎn)中的存在會(huì)以不同的方式影響植物的整體表型。由于這個(gè)原因，經(jīng)常需要篩選大量的 轉(zhuǎn)基因事件，以便鑒定以所導(dǎo)入感興趣的基因的最佳表達(dá)為特征的特定轉(zhuǎn)基因事件。例如， 已經(jīng)在植物和其它生物中觀察到，在不同事件中導(dǎo)入基因的表達(dá)水平可能發(fā)生很寬泛的變 化。也可能存在空間或時(shí)間表達(dá)模式的差異,例如,轉(zhuǎn)基因在各種植物組織中的相對(duì)表達(dá)的 差異，這可能與根據(jù)存在于所導(dǎo)入基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件所預(yù)期的模式不對(duì)應(yīng)。由于 這個(gè)原因，往往要產(chǎn)生數(shù)百至數(shù)千個(gè)不同的事件并對(duì)這些事件進(jìn)行篩選，以便獲得具有對(duì) 商業(yè)目的而言符合期望的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和模式的單一事件。具有期望的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水 平或模式的事件可用于使用傳統(tǒng)的育種方法通過(guò)有性異交（outcrossing)將轉(zhuǎn)基因滲入 (introgressing)到其它遺傳背景中。這種雜交的后代保持原有轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特征。 這一策略在許多已經(jīng)良好適應(yīng)局部生長(zhǎng)條件的品種中被用于確?？煽康幕虮磉_(dá)。
[0006] 理想的是，能夠檢測(cè)特定事件的存在，以便確定有性雜交的后代中是否含有感興 趣的轉(zhuǎn)基因或感興趣的轉(zhuǎn)基因群。此外，用于檢測(cè)特定事件的方法將有助于遵從，例如，要 求上市前審批（pre-market approval)和對(duì)從重組作物衍生的食品或纖維進(jìn)行標(biāo)注的法 規(guī)，或者有助于進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)田間作物的性狀，或者監(jiān)測(cè)從作物的收獲品衍生的產(chǎn) 品，以及用于確保相關(guān)方遵從有關(guān)法規(guī)或合同條款。
[0007] 有可能通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的核酸檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因事件的存在，包括但不 僅限于，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)或使用核酸探針的DNA雜交。這些檢測(cè)方法一般聚焦于頻繁 使用的遺傳元件，例如啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)志物基因等，因?yàn)閷?duì)于許多DNA構(gòu)建體，編碼區(qū)是 可以互換的。其結(jié)果是，這些方法并不能用于區(qū)分不同的事件，特別是那些使用相同的DNA 構(gòu)建體或非常相似的構(gòu)建體產(chǎn)生的事件，除非鄰近所插入異源DNA的側(cè)翼DNA的DNA序列 是已知的。例如，美國(guó)專利申請(qǐng)2006/0070139中描述了一種關(guān)于玉米事件DAS-59122-7的 事件特異性PCR測(cè)定法。建立一種用于鑒定棉花事件PDAB4468. 18. 07. 1的簡(jiǎn)單而有判別 力的方法是令人期待的。
[0008] 發(fā)明公開(kāi)
[0009] 本發(fā)明的實(shí)施方案涉及一種新的抗除草劑的轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化事件，其被命名為棉 花事件PDAB4468. 18. 07. 1，其包括插入到棉花細(xì)胞基因組內(nèi)的特定位點(diǎn)的如本文所述的 aad-12和pat。代表性的棉花種子已保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)，其登錄號(hào)在 第[0032]段中示明。包含該事件的棉花植物的DNA包括本文中所述的、表征插入DNA在 棉花基因組內(nèi)的位置的接點(diǎn)/側(cè)翼序列。SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2能鑒別棉花事件 PDAB4468. 18. 07. 1。更具體地，SEQ ID NO: 1 的 bp 2885/2886 處的接點(diǎn)和 SEQ ID NO: 2 的 bp 147/148處的接點(diǎn)的周?chē)蛄心荑b別棉花事件pDAB4468. 18.07. 1。下面的段落[0012] 描述了包含這些接點(diǎn)的序列的實(shí)例，這些接點(diǎn)是含有棉花事件PDAB4468. 18.07. 1的棉花 植物的DNA的特征。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抗苯氧基乙酸類除草劑如2, 4-D和MCPA的 棉花植物或其部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抗吡啶基氧基乙酸除草劑如 綠草定和氟草煙的棉花植物或其部分。在一個(gè)額外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種在基 因組中包含選自下組的一個(gè)或多個(gè)序列的棉花植物：SEQ ID N0:1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 48-247;和 SEQ ID N0:2的bp 1-297,和其互補(bǔ)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了此類植物的種子。 [0011] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了耐受如下化合物的棉花植物或其部分，該化 合物被轉(zhuǎn)化成苯氧乙酸生長(zhǎng)素除草劑如2, 4-D和MCPA (例如2, 4-DB、MCPB等）。在進(jìn)一步 的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了耐受如下化合物的棉花植物或其部分，該化合物可以被轉(zhuǎn)化 成吡啶基氧基乙酸除草劑如綠草定和氟草煙（例如綠草定B、氟草煙B等）。苯氧乙酸生 長(zhǎng)素和吡啶基氧基乙酸除草劑中存在的丁酸部分可以通過(guò)P-氧化被轉(zhuǎn)變成除草劑的植 物毒素形式。丁酸形式的除草劑本身是無(wú)除草活性的（nonherbicidal)。它們?cè)谝赘兄参?(例如棉花植物）內(nèi)通過(guò)￠-氧化被轉(zhuǎn)變成其各自的酸形式，正是乙酸形式的除草劑有植 物毒性。不能夠進(jìn)行快速3-氧化的植物不會(huì)受到丁酸除草劑的傷害。然而，能夠進(jìn)行快 速氧化并能夠?qū)⒍∷岢輨┺D(zhuǎn)變成乙酸形式的植物可以隨后被AAD-12保護(hù)。因此，本 發(fā)明提供了具有包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的基因組的棉花植物：SEQ ID N0:1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的 bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的 bp 98-197 ;SEQ ID N0:2 的 bp 48-247;和SEQ ID N0:2的bp 1-297,和其互補(bǔ)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這 類植物的種子。
[0012] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于控制棉花作物中雜草的方法，包括向棉 花作物施用苯氧乙酸除草劑例如2, 4-D和MCPA，其中該棉花作物包括在基因組中含有一 個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的棉花植物：SEQ ID NO: 1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: UAbp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO: 2 的 bp 1-297,和其互補(bǔ)物，它們能鑒別棉花事件pDAB4468. 18. 07. I的存在。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，本發(fā)明提供了用于控制棉花作物中雜草的方法，包括向棉花作物施用吡啶基氧基乙酸 除草劑如綠草定和氟草煙，其中該棉花作物包括在基因組中含有一個(gè)或多個(gè)選自下組的序 列的棉花植物：SEQ ID N0:1 的bp 2867-2906;SEQ ID N0:1 的bp 2837-2936;SEQ ID N0:1 的bp 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO:2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297,和其互補(bǔ)物，它們 能鑒別棉花事件PDAB4468. 18. 07. I的存在。棉花事件pDAB4468. 18. 07. I中存在的aad-12 基因賦予對(duì)苯氧乙酸除草劑和吡啶基氧基乙酸除草劑的耐受性。
[0013] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于控制棉花作物中雜草的方法，包括向棉 花作物施用草胺膦除草劑，所述棉花作物包括具有包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的基因 組的棉花植物：SEQ ID N0:1 的bp 2867-2906;SEQ ID N0:1 的bp 2837-2936;SEQ ID N0:1 的bp 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO:2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297,和其互補(bǔ)物，它們 能鑒別棉花事件PDAB4468. 18. 07. I的存在。棉花事件pDAB4468. 18. 07. I中存在的pat基 因引入對(duì)草胺膦除草劑的耐受性。
[0014] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在含有棉花DNA的樣品中檢測(cè)棉花事件 PDAB4468. 18. 07. 1的方法，所述方法包括：
[0015] (a)使所述樣品與第一引物和第二引物接觸，第一引物的長(zhǎng)度為至少I(mǎi)Obp并且 選擇性結(jié)合SEQ ID NO: 1的bp 1-2885內(nèi)的側(cè)翼序列或其互補(bǔ)物，第二引物的長(zhǎng)度為至少 IObp并且選擇性結(jié)合SEQ ID NO: 1的bp 2886-3205內(nèi)的插入序列或其互補(bǔ)物；和
[0016] 對(duì)所述引物之間產(chǎn)生的擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)定；或
[0017] (b)使所述樣品與第一引物和第二引物接觸，第一引物的長(zhǎng)度為至少I(mǎi)Obp并且選 擇性結(jié)合SEQ ID N0:2的bp 1-147內(nèi)的插入序列或其互補(bǔ)物，第二引物的長(zhǎng)度為至少I(mǎi)Obp 并且選擇性結(jié)合SEQ ID N0:2的bpl48-1049內(nèi)的側(cè)翼序列或其互補(bǔ)物；和
[0018] (C)對(duì)所述引物之間產(chǎn)生的擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)定。
[0019] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測(cè)棉花事件PDAB4468. 18. 07. 1的方法，包 括：
[0020] (a)使所述樣品與第一引物和第二引物接觸，第一引物與選自下組的側(cè)翼序列選 擇性結(jié)合：SEQ ID NO: 1的bp 1-2885和SEQ ID NO:2的bpl48-1049,和其互補(bǔ)物，第二引 物與SEQ ID NO:3或其互補(bǔ)物選擇性結(jié)合；
[0021] (b)使所述樣品進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；和
[0022] (C)對(duì)所述引物之間產(chǎn)生的擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)定。
[0023] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種棉花植物育種的方法，包括：將第一植物 與第二棉花植物雜交產(chǎn)生第三棉花植物，所述第一植物包含如下的DNA，該DNA含有一個(gè)或 多個(gè)選自下組的序列：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO: 2 的 bp 1-297,和其互補(bǔ) 物；對(duì)所述第三棉花植物測(cè)定包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的DNA的存在：SEQ ID NO: I 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的 bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO:2 的 bp 48-247 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297,和其互補(bǔ)物。
[0024] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種分離的DNA分子，其能鑒別棉花事件 PDAB4468. 18. 07. 1。除了 SEQ ID N0S:1和2之外，這些分子還包括長(zhǎng)度至少為40bp，并包 括跨越SEQ ID NO: 1的bp 2885/2886接點(diǎn)的多核苷酸序列的分子，和長(zhǎng)度至少為40bp， 并包括跨越SEQ ID N0:2的bp 147/148接點(diǎn)的多核苷酸序列的分子。實(shí)例包括：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: I 的bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO:2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297,和其互補(bǔ)物。
[0025] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了棉花纖維、顆粒（grain)、種子、種子油或種子 柏，在所述棉花纖維、顆粒、種子、種子油或種子柏中含有棉花事件PDAB4468. 18.07. 1，表現(xiàn) 為該棉花纖維、顆粒、種子、種子油或種子柏的DNA中含有一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列：SEQ ID NO:1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2787-2986 ; SEQ ID N0:1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的 bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的 bp 98-197; SEQ ID NO:2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297,和其互補(bǔ)物。
[0026] 本發(fā)明的實(shí)施方案還包括含有棉花事件pDAB4468. 18. 07. I的棉花植物細(xì)胞和植 物部分，包括但不僅限于，花粉、胚珠、花、芽（shoot)、根和葉，以及營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核、花粉 細(xì)胞、種子、種子油和種子柏、及卵細(xì)胞（egg cell)。
[0027] 在一些實(shí)施方案中，棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1可以和其它性狀組合，其他性 狀包括例如其它除草劑耐受基因和/或昆蟲(chóng)抑制蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列（例如RNA干擾、 dsRNA、轉(zhuǎn)錄因子等）。額外的性狀可以通過(guò)植物育種、對(duì)含有棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1 的轉(zhuǎn)基因植物的再次轉(zhuǎn)化、或同源重組介導(dǎo)的靶向整合添加新性狀，而疊加到植物基因組 內(nèi)。
[0028] 其它實(shí)施方案包括切離包含棉花事件PDAB4468. 18. 07. 1的多核苷酸序列，包括 例如pat基因表達(dá)盒。一旦切離多核苷酸序列，經(jīng)過(guò)修飾的事件可以被重新靶定到特定的 染色體位點(diǎn)，在該位點(diǎn)中額外的多核苷酸序列與棉花事件PDAB4468. 18. 07. 1疊加。
[0029] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋棉花染色體靶位點(diǎn)，其位于D亞基因組26號(hào)的染 色體上SEQ ID NOS: 1和2中表示的側(cè)翼序列之間。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括制作轉(zhuǎn)基因棉花植物的方法，包括將異源核酸插 入在D亞基因組26號(hào)染色體上SEQ ID NO: 1和2中表示的基因組序列之間的位置，即SEQ ID NO: 1 的 bp 1-2885 和 SEQ ID NO:2 的 bp 148-1049 之間的位置。
[0031] 此外，本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了用于檢測(cè)樣品（例如棉花纖維的樣品）中主題 事件之存在的測(cè)定法。該測(cè)定法可以基于插入到棉花基因組中的重組構(gòu)建體的DNA序列， 并基于插入位點(diǎn)側(cè)翼的基因組序列。還提供了可用于實(shí)施該測(cè)定法的試劑盒和條件。
[0032] 本發(fā)明的實(shí)施方案還部分地涉及對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花品系中由于插入來(lái)自PDAB4468的 T-DNA而產(chǎn)生的邊界區(qū)域的DNA序列的克隆和分析。這些序列是唯一的?；诓迦胄蛄泻?接點(diǎn)序列，可以生成且實(shí)際生成了事件特異性引物。PCR分析表明，這些事件可以通過(guò)分析 用這些事件特異性引物組所產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增子來(lái)加以辨識(shí)。因此，這些和其他相關(guān)的程序 可以用于唯一地辨識(shí)包含本發(fā)明事件的棉花品系。
[0033] -個(gè)實(shí)施方案提供了一種控制棉花作物中雜草的方法，包括向棉花作物施用苯氧 乙酸除草劑，所述棉花作物包括含有如下所述的DNA的棉花植物，所述DNA包含選自下組 的序列：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: I 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO: 2 的 bp 1-297。在本方法進(jìn)一步的方面 中，苯氧乙酸除草劑是2, 4-D。在本方法進(jìn)一步的方面中，苯氧乙酸除草劑是MCPA。
[0034] 一個(gè)實(shí)施方案提供了一種控制棉花作物中雜草的方法，包括向棉花作物施用吡啶 氧基乙酸除草劑，所述棉花作物包括含有如下所述的DNA的棉花植物，所述DNA包含選自下 組的序列：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的 bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的 bp 98-197 ;SEQ ID N0:2 的 bp 48-247;和 SEQ ID N0:2 的 bp 1-297。在本方法進(jìn)一步 的方面中，吡啶氧基乙酸除草劑是綠草定。在本方法進(jìn)一步的方面中，苯氧乙酸除草劑是氟 草煙。
[0035] -個(gè)實(shí)施方案提供了一種控制棉花作物中雜草的方法，包括向棉花作物施用草胺 膦除草劑，所述棉花作物包括含有如下所述的DNA的棉花植物，所述DNA包含選自下組的 序列：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的bp 98-197 ;SEQ ID N0:2 的 bp 48-247 ;和 SEQ ID N0:2 的 bp 1-297。
[0036] -個(gè)實(shí)施方案提供了一種分離的DNA序列，其包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序 列：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的bp 98-197 ;SEQ ID NO:2 的 bp 48-247 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297。
[0037] -個(gè)實(shí)施方案提供了一種棉花植物育種的方法，包括：將第一植物與第二棉花植 物雜交產(chǎn)生第三棉花植物，所述第一植物包含含有一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的DNA :SEQ ID NO:1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2787-2986 ; SEQ ID N0:1 的bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的bp 98-197 ;SEQ ID NO:2的bp 48-247;和SEQ ID NO:2的bp 1-297,和其互補(bǔ)物；以及對(duì)所述第三棉花植 物測(cè)定包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的DNA的存在：SEQ ID NO: 1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO:1 的 bp 2737-3036 ; SEQ ID N0:2 的bp 128-167;SEQ ID N0:2 的bp 98-197;SEQ ID N0:2 的bp 48-247;和SEQ ID N0:2的bp 1-297,和其互補(bǔ)物。
[0038] -個(gè)實(shí)施方案提供了一種分離的DNA分子，其包含接點(diǎn)序列，所述接點(diǎn)序列包含 至少一個(gè)選自下組的序列：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ; SEQ ID N0:1的bp 2787-2986;SEQ ID N0:1的bp 2737-3036;SEQ ID N0:2的bp 128-167; SEQ ID NO: 2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO: 2 的 bp 1-297,和其 互補(bǔ)物。
[0039] -個(gè)實(shí)施方案提供了一種棉花種子，其在基因組中包含選自下組的DNA序列： SEQ ID NO: 1 的殘基 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的殘基 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的殘 基 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的殘基 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的殘基 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的殘基 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的殘基 48-247 ;SEQ ID NO: 2 的殘基 1-297,和其互補(bǔ) 物。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了一種棉花種子，其在基因組中包含AAD-12/PAT棉花事件 PDAB4468. 18.07. 1，并且其代表性棉花種子被保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，登錄號(hào) 為No. PTA-12456。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了一種通過(guò)種植這兩個(gè)實(shí)施方案中任一個(gè)的 棉花種子產(chǎn)生的棉花植物。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了通過(guò)該棉花植物生產(chǎn)的棉花種子， 其中所述種子在其基因組中含有AAD-12/PAT棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1，其與以登錄 號(hào)No. PTA-12456保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的棉花種子中存在的AAD-12/PAT棉花 事件PDAB4468. 18. 07. 1相同。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了該棉花植物的部分，其中所述部 分選自下組：花粉、胚珠、花、棉鈴、芽、根和葉，并且所述部分包含AAD-12/PAT棉花事件 PDAB4468. 18.07. 1。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了從棉花植物或其部分衍生的組合物，其中所 述組合物是選自下組的商業(yè)產(chǎn)品：棉柏、棉纖維和棉籽油。
[0040] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，棉花植物包含與SEQ ID NO: 17的殘基2, 886-9, 253具有 至少95%的序列同一性的DNA序列。一個(gè)實(shí)施方案提供了上述實(shí)施方案植物的后代棉花植 物，其中所述植物對(duì)苯氧基乙酸、吡啶基氧基乙酸和草胺膦除草劑顯示耐受性，并且所述耐 受性是由于所述事件或所述基因組中編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)導(dǎo)致的。
[0041] 進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了一種棉花種子，包含含有如下所述的DNA序列的基因 組，所述DNA序列與SEQ ID N0:17具有至少95%的序列同一性。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了 通過(guò)種植該棉花種子產(chǎn)生的植物。
[0042] 一個(gè)實(shí)施方案提供了一種含有棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的轉(zhuǎn)基因棉花植物或 其部分，其中包含棉花事件PDAB4468. 18.07. 1的代表性棉花種子已經(jīng)被保藏在美國(guó)典型 培養(yǎng)物保藏中心，登錄號(hào)為No. PTA-12456。
[0043] 種子保藏
[0044] 作為本公開(kāi)的一部分，至少2500粒含有棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的 棉花品系的種子被保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC) (10801University Boulevard, Manassas, VA, 20110)，公眾可以無(wú)限制地獲得（但是受專利權(quán)保護(hù)）。該保藏 被指定為ATCC登錄號(hào)PTA-12456,是以陶氏益農(nóng)公司（Dow AgroSciences LLC)的名義于 2012年1月23日保藏的。該保藏的實(shí)施和維持遵照布達(dá)佩斯條約關(guān)于專利程序目的的種 子保藏條款。
[0045] 序列簡(jiǎn)述
[0046] SEQ ID NO: 1是用于棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的Y DNA側(cè)翼邊界序列。核苷 酸1-2885是基因組序列。核苷酸2886-3205是插入序列。
[0047] SEQ ID NO: 2是用于棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的:V DNA側(cè)翼邊界序列。核苷 酸1-147是插入序列。核苷酸148-1049是基因組序列。
[0048] SEQ ID NO: 3是pDAB4468的T-鏈DNA序列，其在下面的表1中有注釋。
[0049] SEQ ID N0:4是用于確認(rèn)3'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物3endGl。
[0050] SEQ ID N0:5是用于確認(rèn)3'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物3endG2。
[0051] SEQ ID N0:6是用于確認(rèn)3'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物3endG3。
[0052] SEQ ID N0:7是用于確認(rèn)5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5endGl。
[0053] SEQ ID N0:8是用于確認(rèn)5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5endG2。
[0054] SEQ ID N0:9是用于確認(rèn)5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5endG3。
[0055] SEQ ID NO: 10是用于確認(rèn)5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5endG4。
[0056] SEQ ID NO: 11是用于確認(rèn)5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5endTl。
[0057] SEQ ID NO: 12是用于確認(rèn)Y邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5endT2。
[0058] SEQ ID NO: 13是用于確認(rèn)5'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5endT3。
[0059] SEQ ID NO: 14是用于確認(rèn):V邊界基因組DNA的寡核苷酸引物3endTl。
[0060] SEQ ID NO: 15是用于確認(rèn)3'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物3endT2。
[0061] SEQ ID NO: 16是用于確認(rèn)3'邊界基因組DNA的寡核苷酸引物3endT3。
[0062] SEQ ID N0:17是棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的預(yù)期序列，包括5'基因組側(cè)翼序 列、PDAB4468T-鏈插入、和3'基因組側(cè)翼序列。
[0063] 附圖簡(jiǎn)述
[0064] 圖1是含有aad-12和pat基因表達(dá)盒的pDAB4468的質(zhì)粒圖。
[0065] 圖2描繪了用于確認(rèn)棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的5'和3'邊界序列的引物位 置。
[0066] 實(shí)施本發(fā)明的模式
[0067] 棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1插入的兩端均已被測(cè)序和表征。事件特異性測(cè)定法 已經(jīng)得以開(kāi)發(fā)。該事件已被定位（mapped)到棉花基因組中（D亞基因組的26號(hào)染色體）。 可以令該事件滲入到更多的優(yōu)良品系中。
[0068] 如在上文"背景"部分提到的，將轉(zhuǎn)基因引入并整合到植物基因組中涉及到一些隨 機(jī)事件（故而將得到表達(dá)的給定插入命名為"事件"）。也就是說(shuō)，由于轉(zhuǎn)化技術(shù)眾多，諸如 土壤桿菌轉(zhuǎn)化、基因槍轉(zhuǎn)化（即基因槍）和碳化硅介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（即WHISKERS)等，無(wú)法預(yù)測(cè) 轉(zhuǎn)基因?qū)?huì)插入在基因組中的何處。因此，鑒定插入物兩側(cè)的側(cè)翼植物基因組DNA對(duì)于辨 識(shí)具有給定插入事件的植物而言是重要的。例如，可設(shè)計(jì)PCR引物使其產(chǎn)生跨越插入物和 宿主基因組的接點(diǎn)區(qū)的PCR擴(kuò)增子。該P(yáng)CR擴(kuò)增子可用于鑒定插入事件的獨(dú)特或不同的類 型。
[0069] 本文提供了定義和實(shí)施例，用以幫助描述本發(fā)明的實(shí)施方案，并指導(dǎo)本領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員實(shí)踐這些實(shí)施方案。除非另有說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)可以被相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 根據(jù)常規(guī)的用法來(lái)理解。DNA堿基的命名根據(jù)37CFR § 1. 822所述。
[0070] 如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)"后代"是指包含棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的任何一代 親本植物的后代。
[0071] 轉(zhuǎn)基因"事件"是通過(guò)用異源DNA，即包含感興趣的轉(zhuǎn)基因的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物 細(xì)胞，再生由于轉(zhuǎn)基因插入到植物的基因組中而產(chǎn)生的植物群體，且選擇特定基因組位置 中的插入為特征的特定植物而產(chǎn)生的。術(shù)語(yǔ)"事件"是指包含異源DNA的原始轉(zhuǎn)化體以及 該轉(zhuǎn)化體的后代。術(shù)語(yǔ)"事件"也指通過(guò)轉(zhuǎn)化體與另一含有基因組/轉(zhuǎn)基因DNA的品種之 間的有性異交產(chǎn)生的后代。即使經(jīng)過(guò)與輪回親本進(jìn)行多次回交，插入的轉(zhuǎn)基因DNA和來(lái)自 被轉(zhuǎn)化親本的側(cè)翼基因組DNA (基因組/轉(zhuǎn)基因DNA)仍存在于雜交后代的同一染色體位置 處。術(shù)語(yǔ)"事件"還指來(lái)自原始轉(zhuǎn)化體和其后代的、包含插入的DNA和與插入的DNA緊鄰的 側(cè)翼基因組序列的DNA，該DNA預(yù)期會(huì)被轉(zhuǎn)移給由于一個(gè)包含插入DNA的親本品系（例如原 始轉(zhuǎn)化體和通過(guò)自交產(chǎn)生的后代）與一個(gè)不包含插入DNA的親本品系之間的有性雜交，而 接受包括感興趣的轉(zhuǎn)基因在內(nèi)的插入DNA的后代。
[0072] "接點(diǎn)序列"或"邊界序列"跨越下述二者的連接點(diǎn)：插入到基因組內(nèi)的DNA ;和來(lái) 自位于該插入點(diǎn)側(cè)翼的棉花天然基因組的DNA。鑒定或檢測(cè)植物遺傳材料中的任一接點(diǎn)序 列（one or the other junction sequences)足以用來(lái)鑒別該事件?？缭奖疚闹忻枋龅拿?花事件中的插入點(diǎn)、和相似長(zhǎng)度的側(cè)翼DNA的DNA序列被包括在內(nèi)。本文中提供了這樣的 鑒別性序列的具體實(shí)例；然而，其它與各插入物的接點(diǎn)、或各插入物與基因組序列的接點(diǎn)重 疊的序列，也能鑒別，并且可以根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案加以使用。
[0073] 本發(fā)明的實(shí)施方案部分地涉及使用這些側(cè)翼、接點(diǎn)和插入序列進(jìn)行事件鑒定。相 關(guān)的PCR引物和擴(kuò)增子也包含在本發(fā)明的實(shí)施方案中。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，可以利用 使用跨越所插入的DNA和其邊界的擴(kuò)增子的PCR分析方法檢測(cè)或鑒定從本專有權(quán)轉(zhuǎn)基因棉 花品系衍生的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因棉花品系或品種。
[0074] 側(cè)翼/接點(diǎn)序列能鑒別棉花事件PDAB4468. 18. 07. 1。基于這些序列，生成了事件 特異性的引物。PCR分析表明，通過(guò)分析用這些事件特異性引物組產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增子，可以 在不同棉花基因型中鑒定這些棉花品系。因此，這些和其他相關(guān)的程序可用于唯一地鑒定 這些棉花品系。本文中鑒定的序列是唯一的。
[0075] 本發(fā)明實(shí)施方案的檢測(cè)技術(shù)可特別用于和植物育種相結(jié)合，用來(lái)在為了向后代中 引入一個(gè)或多個(gè)額外的感興趣的性狀而將包含感興趣的事件的親本植物與另一種植物品 系雜交之后，確定哪個(gè)后代植物包含給定的事件。這些PCR分析方法有利于棉花育種計(jì)劃， 以及品質(zhì)控制，尤其是對(duì)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因棉花種子。現(xiàn)在還可以制作和使用用于這些轉(zhuǎn)基 因棉花品系的PCR檢測(cè)試劑盒。這也有利于產(chǎn)品注冊(cè)和產(chǎn)品管理。
[0076] 進(jìn)一步地，側(cè)翼棉花/基因組序列可用于具體鑒定每一個(gè)插入物的基因組位置。 這個(gè)信息可用于制作特異針對(duì)每個(gè)事件的分子標(biāo)志系統(tǒng)。這些可用于快速育種策略和建立 連鎖數(shù)據(jù)。
[0077] 更進(jìn)一步地，側(cè)翼序列信息可用于研究和表征轉(zhuǎn)基因整合過(guò)程、基因組整合位點(diǎn) 特征、事件分選（sorting)、轉(zhuǎn)基因及其側(cè)翼序列的穩(wěn)定性、和基因表達(dá)（尤其是涉及基因 沉默、轉(zhuǎn)基因的甲基化模式、位置效應(yīng)、以及潛在的表達(dá)相關(guān)元件如MARS [基質(zhì)結(jié)合區(qū)]，等 等）。
[0078] 根據(jù)本公開(kāi)的所有內(nèi)容，應(yīng)該明確，本發(fā)明的實(shí)施方案包括基于在段落[0032]中 示明的ATCC登錄號(hào)可獲得的種子。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括以在段落[0032]中示明的 ATCC登錄號(hào)保藏的種子所種植出的除草劑耐受性棉花植物。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括所述 植物的部分，例如葉、組織樣品、由所述植物產(chǎn)生的種子、花粉等（其中植物的這些部分包 括 aad-12 和 pat，和 SEQ ID NO: 1 和 2)。
[0079] 更進(jìn)一步，本發(fā)明的實(shí)施方案還包括從所保藏種子種植出的植物的子代和/或后 代植物，優(yōu)選地是抗除草劑棉花植物，其中所述植物具有包含如本文中所述的可檢測(cè)接點(diǎn)/ 側(cè)翼序列的基因組。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"棉花"是指陸地棉（Gossypium hirsutum)，包括 其能夠用棉花植物育種而得的所有品種。
[0080] 本發(fā)明實(shí)施方案的除草劑耐受性棉花植物可以通過(guò)如下所述育種：首先使第一親 本棉花植物與第二親本棉花植物進(jìn)行第一次有性雜交，其中第一親本棉花植物由本文中提 到的任何一種品系的種子長(zhǎng)成的棉花植物構(gòu)成，從而產(chǎn)生多個(gè)第一子代植物；然后選擇抗 草胺膦的第一子代植物；使該第一子代植物自交，從而產(chǎn)生多個(gè)第二子代植物；然后從這 些第二子代植物中選出抗草胺膦的植物。這些步驟可以進(jìn)一步包括使所述第一子代植物或 所述第二子代植物與所述第二親本棉花植物或第三親本棉花植物回交。然后可以種植包含 本發(fā)明實(shí)施方案的棉花種子、或其后代的棉花作物。
[0081] 還應(yīng)當(dāng)理解，兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因植物也可以交配而產(chǎn)生含有兩個(gè)獨(dú)立分離 (segregating)、加合的外源基因的后代。合適子代的自交可以產(chǎn)生對(duì)兩個(gè)加合的外源基因 均為純合的植物。還構(gòu)想了與親本植物的回交和與非轉(zhuǎn)基因植物的異交，以及無(wú)性繁殖。其 他通常用于不同性狀和作物的育種方法是本領(lǐng)域已知的?；亟挥N已經(jīng)被用于基因轉(zhuǎn)移， 以將簡(jiǎn)單遺傳的、高度可遺傳的性狀引入到作為輪回親本的期望純合栽培品種中。待轉(zhuǎn)移 性狀的來(lái)源被稱為供體親本。得到的植物可望具有輪回親本（例如栽培種）的屬性和從供 體親本轉(zhuǎn)移而來(lái)的期望性狀。最初的雜交之后，選擇具有供體親本表型的個(gè)體，并與輪回親 本反復(fù)雜交（回交）。得到的植物可望具有輪回親本（例如栽培種）的屬性和從供體親本 轉(zhuǎn)移而來(lái)的期望性狀。
[0082] 類似地，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的除草劑耐受性棉花植物可以使用本領(lǐng)域已知的方 法用額外的轉(zhuǎn)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化技術(shù)如土壤桿菌轉(zhuǎn)化、基因槍轉(zhuǎn)化（即基因槍）、和碳化 硅介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（即WHISKERS)，可用于將額外的轉(zhuǎn)基因?qū)氲矫藁ㄊ录DAB4468. 18. 07. 1 的基因組中。可以進(jìn)行對(duì)含有新插入的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物的選擇和表征，以鑒定含有除 本發(fā)明實(shí)施方案aad-12和pat基因之外的其他新型轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定整合體的植物。
[0083] 本發(fā)明實(shí)施方案的DNA分子可以用作分子標(biāo)志輔助育種（MB)方法中的分子標(biāo) 志。本發(fā)明實(shí)施方案的DNA分子可以在用于鑒定遺傳連鎖農(nóng)藝有用性狀的方法（例如AFLP 標(biāo)志、RFLP標(biāo)志、RAH)標(biāo)志、SNP和SSR)中使用，如本領(lǐng)域已知的?？梢允褂肕AB方法在與 本發(fā)明實(shí)施方案的棉花植物（或其后代和任何其他棉花栽培品種或變種）的雜交后代中跟 蹤除草劑耐受性特性。這些DNA分子是此性狀的標(biāo)志，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的MB方 法在棉花植物--本發(fā)明實(shí)施方案的至少一種棉花品系或其后代在這些植物中是親本或 祖先--中跟蹤耐除草劑性狀。本發(fā)明實(shí)施方案的方法可以用于鑒定具有主題事件的任何 棉花品種。
[0084] 本發(fā)明實(shí)施方案的方法包括產(chǎn)生抗除草劑的棉花植物的方法，其中所述方法包括 用根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的植物育種。更具體地，所述方法可以包括使兩個(gè)本發(fā)明實(shí) 施方案的植物雜交，或者使一個(gè)本發(fā)明實(shí)施方案的植物與任何其它植物雜交。優(yōu)選的方 法進(jìn)一步包括通過(guò)分析所該雜交的子代中可以根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案檢測(cè)到的事件和有利 的品種性能（例如產(chǎn)量），來(lái)篩選所述雜交的后代。例如，本發(fā)明的實(shí)施方案可用于通過(guò) 使用包含其它期望性狀（如農(nóng)藝性狀、疾病耐受性或抵抗性、線蟲(chóng)耐受或抵抗性和成熟日 期）的植物進(jìn)行育種循環(huán)對(duì)主題事件進(jìn)行跟蹤。包含主題事件和期望性狀的植物可以得 到檢測(cè)、鑒定、篩選和快速利用，例如在更多輪的育種中利用。主題事件/性狀也可以通過(guò) 育種與其他的抗昆蟲(chóng)性狀和/或與其他的抗除草劑性狀結(jié)合，并根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案 的方法進(jìn)行跟蹤。后者的實(shí)施方案是包含與crylF和crylAc基因組合、或與具有編碼對(duì) 除草劑麥草畏耐受性的基因組合的主題事件的植物，crylF和cryIAc基因賦予對(duì)豆夜蛾 (Pseudoplusia includens)(大豆尺蠖）、Anticarsia gemmatalis (絨毛豆毛蟲(chóng)）、Epinotia aporema、Omoides indicatus、Rachiplusia NU,草地夜蛾（Spodoptera frugiperda)、斜紋 夜蛾（Spodoptera cosmoides)、亞熱帶粘蟲(chóng)（Spodoptera eridania)、煙芽夜蛾（Heliothis virescens)、美洲棉鈴蟲(chóng)（Heliocoverpa zea)、黃色燈蛾蟲(chóng)（Spilosoma virginica)和南美 玉米苗斑螟（Elasmopalpus lignosellus)的耐受性。
[0085] 因此，本方面的實(shí)施方案可以與編碼下述抗性的性狀組合：草甘膦抗性（例如抗 性植物或細(xì)菌的EPSPS，GOX，GAT)、草胺膦抗性（例如dsm-2, bar)，乙酰乳酸合酶（ALS)抑 制性除草劑（例如咪唑啉酮[如咪草煙]、磺酰脲類、三唑嘧啶磺苯胺類、嘧啶硫代苯甲酸 類&71'1111(1；[11711：11；[(^61^03丨68)，和其它化學(xué)品[081'1，511^等])抗性、溴苯腈抗性（例如 Bxn)、HPH) (4-羥苯基-丙酮酸-雙加氧酶）酶抑制劑抗性、八氫番茄紅素去飽和酶（PDS) 抑制劑抗性、光系統(tǒng)II型除草劑抗性（例如psbA)、光系統(tǒng)I型除草劑抗性、原卟啉原氧化 酶IX(PPO)抑制型除草劑抗性（例如PP0-1)、苯脲除草劑抗性（例如CYP76B1)、麥草畏降 解酶（見(jiàn)例如US 20030135879)，和其它可以被單獨(dú)疊加或多重組合的性狀，從而提供有效 控制或阻止雜草遷移和/或?qū)θ魏吻笆鲱愋偷某輨┑目剐缘哪芰Α?br> [0086] 此外，棉花事件pDAB4468. 18.07. 1可以和一種或多種額外的輸入（例如昆蟲(chóng)抗 性、病原體抗性或脅迫耐受性等）或輸出（例如增加的產(chǎn)量、改善的油譜、提高的纖維品質(zhì) 等）性狀組合。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案可用于提供一套完整的改良作物品質(zhì)農(nóng)藝包，其能 夠靈活而成本高效地控制任意數(shù)量的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)。
[0087] 通過(guò)同源重組將多核苷酸序列整合在植物細(xì)胞中的特定染色體位點(diǎn)上的方法，在 本領(lǐng)域中已有描述。例如，如在美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No. 2009/0111188 Al中描述的位點(diǎn)特 異性整合描述了利用重組酶或整合酶介導(dǎo)將供體多核苷酸序列引入到染色體靶中。此外， 國(guó)際專利申請(qǐng)No. WO 2008/021207描述了鋅指介導(dǎo)的同源重組，用于將一個(gè)或多個(gè)供體多 核苷酸序列整合到基因組的特定位置?？梢允褂弥亟M酶，例如在美國(guó)專利No. 6720475中 描述的FLP/FRT或在美國(guó)專利No. 5, 658, 772中描述的CRE/L0X，將多核苷酸序列整合到特 定的染色體位點(diǎn)上。最后，使用大范圍核酸酶將供體多核苷酸靶定到特定的染色體位置，在 Puchta et al.，PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060 中有描述。
[0088] 其它用于在植物細(xì)胞中進(jìn)行位點(diǎn)特異性整合的方法通常是已知的并且是適用的 (Kumar et al.，Trends in Plant Sci. 6 (4) (2001) pp. 155-159)。進(jìn)一步，已經(jīng)在多種原 核和低等真核微生物中鑒定的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)可以應(yīng)用于植物中。這種系統(tǒng)的實(shí)例 包括，但不限于，來(lái)自魯氏酵母PSRl質(zhì)粒的R/RS重組酶系統(tǒng)（Araki et al. (1985)J.Mol. Biol. 182:191-203)和噬菌體 Mu 的 Gin/gix 系統(tǒng)（Maeser and Kahlmann(1991)Mol. Gen. Genet. 230:170-176)。
[0089] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，理想的是，在現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因事件的附近整合或疊加新 的轉(zhuǎn)基因。基于獨(dú)特的特征（例如單插入位點(diǎn)、正常的孟德?tīng)柗蛛x和穩(wěn)定的表達(dá)）和卓越 的功效組合（包括除草劑耐受性以及多種環(huán)境場(chǎng)所之內(nèi)或跨越多種環(huán)境場(chǎng)所的農(nóng)藝性能） 而選擇的轉(zhuǎn)基因事件，可以認(rèn)為是優(yōu)選的基因組位點(diǎn)。新整合的轉(zhuǎn)基因應(yīng)當(dāng)保持現(xiàn)有的轉(zhuǎn) 化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特征。而且，由于基因組側(cè)翼序列和新整合事件的染色體位置已經(jīng)被確 定，開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)和確認(rèn)新整合事件的測(cè)定法將不是問(wèn)題。最后，新的轉(zhuǎn)基因整合到與現(xiàn)有 轉(zhuǎn)基因連鎖的特定染色體位置中，將加快通過(guò)使用常規(guī)育種方法的有性異交將轉(zhuǎn)基因向其 它遺傳背景的基因滲入。
[0090] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，理想的是從轉(zhuǎn)基因事件切出多核苷酸序列。例如，如 在美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No. 2011/0191877中所述的轉(zhuǎn)基因切出，采用鋅指核酸酶從染色體整 合的轉(zhuǎn)基因事件中除去由基因表達(dá)盒構(gòu)成的多核苷酸序列。被去除的多核苷酸序列可以是 可選擇標(biāo)志。一旦切出并去除多核苷酸序列，可以通過(guò)插入多核苷酸序列來(lái)重新靶定該經(jīng) 過(guò)修飾的轉(zhuǎn)基因事件。多核苷酸序列的切出和后續(xù)經(jīng)修飾轉(zhuǎn)基因事件的重靶定可以提供許 多好處，例如重復(fù)使用可選擇標(biāo)志物、或能夠克服由于特定基因的表達(dá)導(dǎo)致的對(duì)植物轉(zhuǎn)錄 組的意外改變。
[0091] 本文公開(kāi)了棉花基因組中D亞基因組的26號(hào)染色體上的特定位點(diǎn)，其對(duì)于異源核 酸的插入是極為理想的。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了將感興趣的異源核酸導(dǎo)入到該預(yù) 先建立的目標(biāo)位點(diǎn)或該目標(biāo)位點(diǎn)附近的方法。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括一種棉花種子和/ 或棉花植物，其包含插入在所公開(kāi)的目標(biāo)位點(diǎn)中或該位點(diǎn)附近的任何異源核苷酸序列。實(shí) 現(xiàn)這種靶向整合的一個(gè)選項(xiàng)是，切出本文中示例的pat表達(dá)盒和/或用不同的插入物代替 之。在此可以根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案使用例如靶向同源重組，但不局限于此。
[0092] 如本文中所使用的，基因、事件或特征"疊加"是指將期望的性狀組合到一個(gè)轉(zhuǎn)基 因品系中。植物育種者通過(guò)將各自具有期望性狀的親本進(jìn)行雜交，然后鑒定同時(shí)具有這些 期望性狀的后代，來(lái)疊加轉(zhuǎn)基因性狀。另一種疊加基因的方式是在轉(zhuǎn)化期間同時(shí)向植物的 細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移兩個(gè)或多個(gè)基因。另一種疊加基因的方式是用另一個(gè)感興趣的基因再次轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)基因植物。例如，基因疊加可用于組合兩種或更多種不同的特征，包括例如，兩種或更多 種不同的昆蟲(chóng)性狀、昆蟲(chóng)抗性性狀和疾病抗性性狀，兩種或更多種除草劑抗性性狀，和/或 昆蟲(chóng)抗性性狀和除草劑抗性性狀。在感興趣的基因的基礎(chǔ)上使用可選擇標(biāo)志物也可以視為 基因置加。
[0093] "同源重組"是指任何在相應(yīng)位置處含有相似核苷酸序列的一對(duì)核苷酸序列之間 的反應(yīng)，通過(guò)該反應(yīng)，這兩個(gè)核苷酸序列能夠相互作用（重組）形成一個(gè)新的重組DNA序 列。相似核苷酸序列的位點(diǎn)在本文中分別稱為"同源序列"。一般來(lái)說(shuō)，同源重組的頻率隨 著同源序列長(zhǎng)度的增加而增大。因此，盡管同源重組可以在兩個(gè)不完全相同的核苷酸序列 之間發(fā)生，但是重組的頻率（或效率）隨著兩個(gè)序列之間差異性的增加而降低。重組可以 用每個(gè)供體上的一個(gè)同源序列和靶分子實(shí)現(xiàn)，從而產(chǎn)生"單交換"重組產(chǎn)物。或者，可將兩 個(gè)同源序列放置在每個(gè)靶標(biāo)和供體核苷酸序列上。供體上的兩個(gè)同源序列與靶標(biāo)上的兩個(gè) 同源序列之間的重組會(huì)產(chǎn)生"雙交換"重組產(chǎn)物。如果供體分子上的同源序列位于待操作 序列（例如感興趣的序列）的兩側(cè)，則與靶分子的雙交換重組將產(chǎn)生這樣的重組產(chǎn)物，其中 感興趣的序列代替了原本位于靶分子上的同源序列之間的DNA序列。通過(guò)雙交換重組事件 實(shí)現(xiàn)的靶標(biāo)與供體之間的DNA序列交換被稱為"序列替代。"
[0094] 本發(fā)明實(shí)施方案的優(yōu)選植物或種子在其基因組中含有如本文所鑒定的起作用的 aad-12和pat核苷酸序列，以及如本文所鑒定的位于該插入物兩側(cè)的至少20-500個(gè)或更多 個(gè)毗鄰的側(cè)翼核苷酸。除非另有說(shuō)明，否則提到"側(cè)翼序列"是指相對(duì)于SEQ ID N0:1和2 鑒定的那些。這些側(cè)翼序列的全部或一部分可以預(yù)期被轉(zhuǎn)移給由于含有該事件的親本品系 的有性雜交而接收被插入的DNA的后代。
[0095] 本發(fā)明的實(shí)施方案包括本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的植物的可再生細(xì)胞的組織培養(yǎng)物。 此外，還包含從這種組織培養(yǎng)物再生的植物，特別是當(dāng)所述植物能夠表達(dá)一個(gè)示范品種的 所有形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征時(shí)。本發(fā)明實(shí)施方案的優(yōu)選植物具有從所述保藏種子種植的植物 的所有生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征。本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)一步包括這種種子的后代和具有感興趣 的品質(zhì)性狀的種子的后代。
[0096] 如這里所使用的，"品系"是指?jìng)€(gè)體之間就至少一個(gè)性狀而言顯示很小或沒(méi)有遺傳 變異的一群植物。這些品系可以通過(guò)數(shù)代的自花授粉和選擇，或者通過(guò)使用組織或細(xì)胞培 養(yǎng)技術(shù)從單個(gè)親本無(wú)性繁殖而獲得。
[0097] 如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)"栽培種"和"品種"是同義的，是指用于商業(yè)生產(chǎn)的品系。 [0098] "穩(wěn)定性"或"穩(wěn)定的"是指，相對(duì)于給定的組分，該組分在代與代之間得以保持，優(yōu) 選為至少三代。
[0099] "商業(yè)效用"被定義為具有良好的植物活力和高生育力，使得作物能夠被農(nóng)民用 傳統(tǒng)的種植設(shè)備生產(chǎn)，并且能夠使用常規(guī)的破碎和提取設(shè)備從種子中提取具有所述組分的 油。
[0100] "農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良"是指某個(gè)品系除了由主題事件導(dǎo)致的除草劑耐受性之外，還具有理 想的農(nóng)藝性狀，如產(chǎn)量、成熟度、抗病性等。這些農(nóng)藝學(xué)特性和數(shù)據(jù)點(diǎn)中的任何一個(gè)或全部 均可用于辨識(shí)這樣的植物，無(wú)論是作為一個(gè)點(diǎn)還是位于用于限定此類植物的特征范圍的任 一端或兩端。
[0101] 本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容會(huì)想到，檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案例如可以包 括針對(duì)和/或包含"接點(diǎn)序列"或"過(guò)渡序列"（棉花基因組側(cè)翼序列在此處與插入序列相 接）的探針和/或引物。例如，這包括被設(shè)計(jì)用于鑒定一個(gè)或全部?jī)蓚€(gè)接點(diǎn)序列（插入物 在此處與側(cè)翼序列相接）的多核苷酸探針、引物、和/或擴(kuò)增子。一種常見(jiàn)的設(shè)計(jì)是，一個(gè) 引物與側(cè)翼區(qū)雜交，一個(gè)引物與插入物雜交。這些引物的長(zhǎng)度通常是每個(gè)約至少?15個(gè)殘 基。利用這種設(shè)置，可以利用引物生成/擴(kuò)增可檢測(cè)的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子指示本發(fā)明實(shí)施方 案的事件的存在。這些引物可用于產(chǎn)生跨越（并包括）如上文所指出的接點(diǎn)序列的擴(kuò)增子。
[0102] 在側(cè)翼序列中"觸地（touching down) "的引物通常不被設(shè)計(jì)為在超出接點(diǎn)多于大 約1200個(gè)堿基之處雜交。因此，典型的側(cè)翼引物將被設(shè)計(jì)為包括任一鏈上從插入物起點(diǎn)開(kāi) 始向側(cè)翼序列中延伸1200個(gè)堿基以內(nèi)的至少15個(gè)殘基。也就是說(shuō)，包含來(lái)自（或者雜交 于）SEQ ID NO: 1的堿基對(duì)2000-3205和/或SEQ ID NO: 2的堿基對(duì)1-1049的大小合適的 序列的引物，在本發(fā)明實(shí)施方案的范圍之內(nèi)。插入物的引物可以類似地設(shè)計(jì)于插入物上的 任何地方，但SEQ ID NO:3的堿基對(duì)1-6368可以非排他性地用于例如此類引物的設(shè)計(jì)。
[0103] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將會(huì)認(rèn)識(shí)到，引物和探針可被設(shè)計(jì)成在一定范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)雜 交和/或PCR條件下進(jìn)行雜交，其中引物或探針與示例序列不是完美互補(bǔ)。也就是說(shuō)，某種 程度的錯(cuò)配或簡(jiǎn)并是可以容忍的。例如，對(duì)于約20個(gè)核苷酸的引物，通常一個(gè)或兩個(gè)左右 的核苷酸不需要與相反鏈結(jié)合，如果錯(cuò)配的堿基在內(nèi)部或者在引物的相對(duì)于擴(kuò)增子的末端 的話。下面提供了各種合適的雜交條件。合成的核苷酸類似物，如肌苷，也可以用在探針中。 肽核酸（PM)探針、以及DNA和RNA探針，也可以使用。重要的是，這些探針和引物能鑒別 (能夠唯一地鑒定和區(qū)分）本發(fā)明實(shí)施方案的事件的存在。
[0104] 應(yīng)當(dāng)注意的是，PCR擴(kuò)增可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤，這可能導(dǎo)致例如輕微的測(cè)序錯(cuò)誤。也就 是說(shuō)，除非另有說(shuō)明，本文中所列出的序列是通過(guò)從棉花基因組DNA生成長(zhǎng)擴(kuò)增子，然后對(duì) 擴(kuò)增子進(jìn)行克隆和測(cè)序而確定的。這種方式產(chǎn)生和確定的多個(gè)序列中發(fā)現(xiàn)細(xì)微的不同和 次要的差異并非罕事，考慮到需要多輪擴(kuò)增才能從基因組DNA產(chǎn)生足夠的用于測(cè)序的擴(kuò)增 子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)會(huì)意識(shí)到并且注意到，由于這些類型的常見(jiàn)測(cè)序錯(cuò)誤或差異而 需要進(jìn)行的任何調(diào)整都在本發(fā)明實(shí)施方案的范圍之內(nèi)。
[0105] 還應(yīng)當(dāng)注意，某些基因組序列被刪除并不罕見(jiàn)，例如當(dāng)創(chuàng)建事件的過(guò)程中插入某 一序列時(shí)。因此，本主題側(cè)翼序列與例如GENBANK中列出的基因組序列之間也可能出現(xiàn)一 些差異。
[0106] 附圖中列舉了 DNA序列"插入物"的組分，并在下面的實(shí)施例中進(jìn)行了更詳細(xì)的討 論。這些組分或其片段的DNA多核苷酸序列可以用作本發(fā)明實(shí)施方案的方法的DNA引物或 探針。
[0107] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供了用于檢測(cè)植物和種子等中來(lái)自棉花植物的轉(zhuǎn) 基因/基因組插入?yún)^(qū)的存在的組合物和方法。提供了這樣的DNA序列，它們包括本文中提 供的主題5'轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域接點(diǎn)序列（SEQ ID NO: 1的堿基對(duì)2885/2886之間）、 其區(qū)段、和示例序列和其任意區(qū)段的互補(bǔ)物。提供了這樣的DNA序列，其包括本文中提供的 主題3'轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域接點(diǎn)序列（SEQ ID NO:2的堿基對(duì)147/148之間）、、其區(qū) 段、和示例序列和其任意區(qū)段的互補(bǔ)物。插入?yún)^(qū)接點(diǎn)序列跨越下述二者之間的接點(diǎn)：插入到 基因組中的異源DNA，和來(lái)自棉花細(xì)胞的位于插入位點(diǎn)側(cè)翼的DNA。這些序列可能能夠鑒別 給定的事件。
[0108] 根據(jù)這些插入物和邊界序列，可以生成事件特異性的引物。PCR分析表明，可以通 過(guò)分析用這些事件特異性的引物組所產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增子，可以在不同棉花基因型中鑒定出 本發(fā)明實(shí)施方案的棉花品系。這些和其他相關(guān)程序可用于唯一地鑒定這些棉花品系。因此， 從這樣的引物對(duì)衍生的PCR擴(kuò)增子是唯一的，并可用于鑒定這些棉花品系。
[0109] 在一些實(shí)施方案中，包含新的轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域的毗鄰片段的DNA序列是 本發(fā)明的一個(gè)方面。包括這樣的DNA序列，其包含一段足夠長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)基因插入序列的多核 苷酸和一段足夠長(zhǎng)度的來(lái)自一個(gè)或多個(gè)前述棉花植物的棉花基因組序列的多核苷酸，和/ 或這樣的序列，它們可用作引物序列，用來(lái)產(chǎn)生能鑒別一種或多種這些棉花植物的擴(kuò)增子 產(chǎn)物。
[0110] 相關(guān)實(shí)施方案涉及如下的DNA序列，其包含在本文中鑒定的DNA序列的轉(zhuǎn)基因部 分（例如 SEQ ID NO: 1 及其區(qū)段）的至少 10,11，12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 21，22, 23， 24, 25或更多個(gè)毗鄰核苷酸，或其互補(bǔ)物，和類似長(zhǎng)度的來(lái)自這些序列的側(cè)翼棉花DNA序 列，或其互補(bǔ)物。這些序列可以在DNA擴(kuò)增方法中用作DNA引物。使用這些引物產(chǎn)生的擴(kuò) 增子能鑒別本文中提到的任何棉花事件。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案還包括由這樣的DNA引 物產(chǎn)生的擴(kuò)增子。
[0111] 本發(fā)明的實(shí)施方案還包括用于檢測(cè)樣品中對(duì)應(yīng)于本文中提到的棉花事件的DNA 的存在的方法。這些方法可以包括：（a)使包含DNA的樣品與引物組接觸，該引物組當(dāng)被用 于在使用來(lái)自這些棉花事件中的至少一個(gè)的DNA進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中時(shí)，產(chǎn)生能鑒別該 事件的擴(kuò)增子；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生擴(kuò)增子；和（c)檢測(cè)該擴(kuò)增子。
[0112] 本發(fā)明實(shí)施方案進(jìn)一步的檢測(cè)方法包括檢測(cè)樣品中對(duì)應(yīng)于所述事件的DNA的存 在的方法，其中所述方法包括：(a)使包含DNA的樣品與探針接觸，該探針在嚴(yán)格雜交條件 下會(huì)與來(lái)自所述棉花事件的DNA雜交，并且在嚴(yán)格雜交條件下不會(huì)與對(duì)照棉花植物（非感 興趣的事件DNA)雜交；(b)將該樣品和該探針置于嚴(yán)格的雜交條件下；和（c)檢測(cè)該探針 與所述DNA的雜交。
[0113] 在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括產(chǎn)生包含本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的棉花事 件PDAB4468. 18. 07. 1的棉花植物的方法，其中所述方法包括如下的步驟：（a)將第一親本 棉花品系（包含本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的表達(dá)盒，該表達(dá)盒賦予所述品系的植物對(duì)2, 4-D 和草胺膦的耐受性）和第二親本棉花品系（其缺少上述除草劑耐受性性狀）有性雜交，從 而產(chǎn)生多個(gè)后代植物；和（b)通過(guò)使用分子標(biāo)志物對(duì)所述后代植物進(jìn)行選擇。這些方法可 以任選地包括使所述后代植物與第二親本棉花品系回交，從而產(chǎn)生包含抗除草劑性狀的純 育（true-breeding)棉花植物的額外步驟。
[0114] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于確定與所述事件的雜交的后代的合子型 (zygosity)的方法。所述方法可以包括使包含棉花DNA的樣品與本發(fā)明實(shí)施方案的引物組 接觸。所述的引物當(dāng)被用于與來(lái)自所述棉花事件的基因組DNA進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，可產(chǎn) 生能鑒別所述棉花事件的第一擴(kuò)增子。這些方法進(jìn)一步包括進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生 所述第一擴(kuò)增子；檢測(cè)所述第一擴(kuò)增子；和使包含棉花DNA的樣品與第二引物組接觸（所 述第二引物組當(dāng)被用于與來(lái)自棉花植物的基因組DNA進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，可產(chǎn)生第二 擴(kuò)增子，該第二擴(kuò)增子含有天然棉花基因組的內(nèi)源序列，且不含有所述事件的多核苷酸序 列）；和進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生所述第二擴(kuò)增子。該方法還包括檢測(cè)第二擴(kuò)增子，并 比較樣品中的第一和第二擴(kuò)增子，其中兩個(gè)擴(kuò)增子的存在表明轉(zhuǎn)基因插入的合子型。
[0115] 可以使用本文公開(kāi)的組合物和DNA檢測(cè)領(lǐng)域公知的方法開(kāi)發(fā)DNA檢測(cè)試劑盒。該 試劑盒可用于鑒定樣品中的主題棉花事件，并可應(yīng)用于含有該DNA的棉花植物的育種方 法。該試劑盒含有與例如本文所公開(kāi)的擴(kuò)增子互補(bǔ)的DNA序列，或者含有與和主題事件的 轉(zhuǎn)基因遺傳元件中所含有的DNA互補(bǔ)的DNA序列互補(bǔ)的DNA序列。這些DNA序列可以用于 DNA擴(kuò)增反應(yīng)或者作為DNA雜交方法中的探針。該試劑盒還可以含有實(shí)施該檢測(cè)方法必需 的試劑和材料。
[0116] "探針"是一種分離的核酸分子，其附接有常規(guī)的可檢測(cè)標(biāo)記物或報(bào)告分子（例如 放射性同位素、配體、化學(xué)發(fā)光劑或酶）。這種探針能夠與靶核酸的鏈雜交，在本發(fā)明實(shí)施 方案的情況下，能夠與來(lái)自所述棉花事件之一（不管是來(lái)自棉花植物還是來(lái)自含有該事件 DNA的樣品）的基因組DNA的鏈雜交。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的探針不僅包括脫氧核糖核酸 或核糖核酸，還包括特異結(jié)合靶DNA序列并能夠用于檢測(cè)該靶DNA序列之存在的聚酰胺和 其它探針材料。
[0117] "引物"是分離的/合成的核酸，其通過(guò)核酸雜交與靶DNA鏈退火，從而形成引物和 靶DNA鏈之間的雜交體，然后在聚合酶，例如DNA聚合酶的作用下沿著靶DNA鏈延伸。本發(fā) 明實(shí)施方案的引物對(duì)，是指它們用于擴(kuò)增靶核酸序列，例如通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)或 其它常規(guī)的核酸擴(kuò)增方法對(duì)擴(kuò)增靶核酸序列的用途。
[0118] 探針和引物的長(zhǎng)度通常為 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21，2 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31，32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41，42, 43, 44, 45, 46, 47， 48, 49, 50, 51，52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61，62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71，72, 73 ，74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81，82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91，92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 9 9, 100, 101，102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111，112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 ，119, 120, 121，122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131，132, 133, 134, 135, 136, 137， 138, 139, 140, 141，142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151，152, 153, 154, 155, 156, 1 57, 158, 159, 160, 161，162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171，172, 173, 174, 175, 17 6, 177, 178, 179, 180, 181，182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191，192, 193, 194, 195 ，196, 197, 198, 199, 200, 201，202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211，212, 213, 214， 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221，222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231，232, 233, 2 34, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241，242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251，252, 25 3, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261，262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271，272 ，273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281，282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291， 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301，302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 3 11，312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321，322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 33 0, 331，332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341，342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349 ，350, 351，352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361，362, 363, 364, 365, 366, 367, 368， 369, 370, 371，372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381，382, 383, 384, 385, 386, 387, 3 88, 389, 390, 391，392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401，402, 403, 404, 405, 406, 40 7, 408, 409, 410, 411，412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421，422, 423, 424, 425, 426 ，427, 428, 429, 430, 431，432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441，442, 443, 444, 445， 446, 447, 448, 449, 450, 451，452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461，462, 463, 464, 4 65, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 48 4,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499,500,或 1000,或 2000,或5000個(gè)多核苷酸或者更長(zhǎng)。這些探針和引物在嚴(yán)格雜交條件下特異性雜交于靶序 列。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的探針和引物與靶序列具有完全的序列相似性，盡管通過(guò) 常規(guī)方法也可以設(shè)計(jì)出與靶序列不同但保持與靶序列雜交的能力的探針。
[0119] 用于制備和使用探針和引物的方法在例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，第 1-3 卷，Sambrook 等編輯，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989中有描述。PCR引物對(duì)可以使用例如用于該目的的 計(jì)算機(jī)程序從已知的序列產(chǎn)生。
[0120] 基于本文中公開(kāi)的側(cè)翼DNA和插入序列的引物和探針可用于通過(guò)常規(guī)方法確認(rèn) (并且，如果需要的話，修正）公開(kāi)的序列，例如，通過(guò)對(duì)這些序列進(jìn)行重克隆和測(cè)序。
[0121] 本發(fā)明實(shí)施方案的核酸探針和引物在嚴(yán)格條件下與靶DNA序列雜交。任何常規(guī)的 核酸雜交或擴(kuò)增方法均可用于鑒定樣品中來(lái)自轉(zhuǎn)基因事件的DNA的存在。在特定情況下， 核酸分子或其片段能夠與其他的核酸分子特異性雜交。如本文所使用的，如果兩個(gè)分子能 夠形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，則可以說(shuō)這兩個(gè)核酸分子能夠彼此特異性雜交。如果兩個(gè) 核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱一個(gè)核酸分子是另一個(gè)核酸分子的"互補(bǔ)物"。如本文 所使用的，當(dāng)一個(gè)分子的每一個(gè)核苷酸都與另一個(gè)分子的核苷酸互補(bǔ)時(shí)，則可以說(shuō)分子表 現(xiàn)出"完全互補(bǔ)性"。顯示完全互補(bǔ)性的分子通常會(huì)以足夠的穩(wěn)定性彼此雜交，穩(wěn)定性足以 允許它們?cè)诔Ｒ?guī)的"高嚴(yán)格性"條件下保持彼此退火。常規(guī)的高嚴(yán)格性條件如Sambrook et al.，1989 所述。
[0122] 如果兩個(gè)分子能夠彼此雜交并且在至少常規(guī)的"低嚴(yán)格性"條件具有足夠的穩(wěn)定 性以允許它們保持彼此退火，則稱兩個(gè)分子顯示"最小互補(bǔ)性"。常規(guī)的低嚴(yán)格性條件如 Sambrook et al.，1989所述。核酸分子只需要表現(xiàn)出序列的最小互補(bǔ)性，以便能夠在所用 的特定溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，就能夠用作引物或探針。
[0123] 術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格條件"或"嚴(yán)格性條件"是關(guān)于核酸探針與靶核酸雜交（即，與感興趣 的特定核酸序列雜交）的功能性定義，該雜交通過(guò)Sambrook et al.，1989在9. 52-9. 55中 討論的特定雜交程序?qū)嵤?。另外?jiàn)Sambrook et al.，1989的9. 47-9. 52和9. 56-9. 58。
[0124] 取決于預(yù)期的應(yīng)用，可以使用不同條件的嚴(yán)格條件或探針或引物的多核苷酸序列 簡(jiǎn)并性，以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶序列不同程度的雜交選擇性。對(duì)于要求高選擇性的應(yīng)用，通常會(huì)采用相 對(duì)嚴(yán)格的條件來(lái)雜交一個(gè)多核苷酸序列與第二個(gè)多核苷酸序列，例如，會(huì)選擇相對(duì)低鹽和/ 或高溫條件，例如大約〇. 02M-大約0. 15M NaCl和大約50°C -大約70°C的溫度。嚴(yán)格條件， 例如，可能涉及用高嚴(yán)格性清洗緩沖液（0. 2 X SSC，0. 1% SDS，65°C )至少清洗雜交濾膜兩 次。促進(jìn)DNA雜交的合適嚴(yán)格條件，例如，6. OX檸檬酸鈉/氯化銨（SSC)，大約45°C，隨后 用50°C的2. OXSSC清洗，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，在清洗步驟中的鹽濃度可以從約 2. OX SSC，50°C的低嚴(yán)格性到大約0. 2X SSC，50°C的高嚴(yán)格性中進(jìn)行選擇。另外，清洗步驟 中的溫度可以從低嚴(yán)格條件的室溫、大約約22°C增加到高嚴(yán)格條件的大約65°C?？梢宰兓?溫度和鹽二者，或者可以保持溫度或鹽濃度恒定，而改變另一個(gè)變量。這種選擇條件可容忍 探針與模板或靶鏈之間的很小的（如果有的話）錯(cuò)配。通過(guò)雜交檢測(cè)DNA序列是本領(lǐng)域技 術(shù)人員眾所周知的，美國(guó)專利Nos. 4, 965, 188和5, 176, 995的教導(dǎo)是雜交分析方法的實(shí)例。
[0125] 在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的核酸會(huì)在高嚴(yán)格度條件下 與一個(gè)或多個(gè)本文舉例或建議的引物（或擴(kuò)增子或其他序列），包括其互補(bǔ)物或片段，特異 性雜交。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的標(biāo)志物核酸分子具有本文在一個(gè) 或多個(gè)示例序列中表示的核酸序列，或其互補(bǔ)物和/或片段。
[0126] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的標(biāo)志物核酸分子與這樣的核酸 序列具有80% -100%或90%和100%的序列同一性。在本發(fā)明進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明一 個(gè)實(shí)施方案的標(biāo)記核酸分子與這樣的序列具有95% -100%的序列同一'丨生。這樣的序列可 以在植物育種方法中用作標(biāo)志物，以鑒定遺傳雜交的后代。探針與靶DNA分子的雜交可以 通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法中的任一種進(jìn)行檢測(cè)；包括但不限于，熒光標(biāo)簽、放射 性標(biāo)簽、基于抗體的標(biāo)簽和化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽。
[0127] 關(guān)于使用特定擴(kuò)增引物對(duì)的靶核酸序列的擴(kuò)增（例如通過(guò)PCR)，"嚴(yán)格條件"是允 許引物對(duì)僅與這樣的靶核酸序列雜交的條件：具有相應(yīng)野生型序列（或其互補(bǔ)物）的引物 會(huì)與該靶核酸序列結(jié)合，并優(yōu)選地產(chǎn)生獨(dú)特的擴(kuò)增產(chǎn)物--擴(kuò)增子。
[0128] 術(shù)語(yǔ)"對(duì)…（靶序列）特異性"是指，探針或引物在嚴(yán)格雜交條件下僅與包含靶序 列的樣品中的靶序列雜交。
[0129] 如本文中所使用的，"擴(kuò)增的DNA"或"擴(kuò)增子"是指，作為核酸模板一部分的靶核酸 序列的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，為了確定由于有性雜交而產(chǎn)生的棉花植物是否含有來(lái)自本發(fā) 明實(shí)施方案的棉花植物的轉(zhuǎn)基因事件基因組DNA，可以對(duì)從棉花植物組織樣品提取的DNA 進(jìn)行核酸擴(kuò)增方法，其使用的引物對(duì)包括來(lái)自植物基因組中與所插入異源DNA的插入位點(diǎn) 相鄰的側(cè)翼序列的引物，和來(lái)自所插入異源DNA的第二引物，從而產(chǎn)生能鑒別該事件DNA的 存在的擴(kuò)增子。擴(kuò)增子的長(zhǎng)度及其具有的序列也能鑒別該事件。擴(kuò)增子的長(zhǎng)度可以改變， 從長(zhǎng)度等于引物對(duì)的總長(zhǎng)加一個(gè)核苷酸堿基對(duì)，到長(zhǎng)度等于引物對(duì)的總長(zhǎng)加上大約2, 3, 4， 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21，22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31，3 2, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41，42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51，52, 53, 54, 55, 56, 57， 58, 59, 60, 61，62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71，72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81，82, 83 ，84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91，92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101，102, 103, 104, 105, 106， 107, 108, 109, 110, 111，112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121，122, 123, 124, 125, I 26, 127, 128, 129, 130, 131，132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141，142, 143, 144, 14 5, 146, 147, 148, 149, 150, 151，152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161，162, 163, 164 ，165, 166, 167, 168, 169, 170, 171，172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181，182, 183， 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191，192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201，202, 2 03, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211，212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221，22 2, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231，232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 ，242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251，252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260， 261，262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271，272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 2 80, 281，282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291，292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 29 9, 300, 301，302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311，312, 313, 314, 315, 316, 317, 318 ，319, 320, 321，322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331，332, 333, 334, 335, 336, 337， 338, 339, 340, 341，342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351，352, 353, 354, 355, 356, 3 57, 358, 359, 360, 361，362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371，372, 373, 374, 375, 37 6, 377, 378, 379, 380, 381，382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391，392, 393, 394, 395 ，396, 397, 398, 399, 400, 401，402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411，412, 413, 414， 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421，422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431，432, 433, 4 34, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441，442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451，452, 45 3, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461，462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471，472 ，473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481，482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491， 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, or 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 或更多個(gè)核 苷酸堿基對(duì)（加上或減去任意上述列舉的增量）?；蛘撸飳?duì)可以來(lái)自于插入DNA兩側(cè)的 側(cè)翼序列，從而產(chǎn)生一個(gè)包含整個(gè)插入核苷酸序列的擴(kuò)增子。從植物基因組序列衍生的引 物對(duì)的成員可能位于與插入的DNA序列有一定距離之處。這個(gè)距離的范圍可以從1個(gè)核苷 酸堿基對(duì)到大約兩萬(wàn)個(gè)核苷酸堿基對(duì)。使用的"擴(kuò)增子"一詞，明確排除可能在DNA熱擴(kuò)增 反應(yīng)中形成的引物二聚體。
[0130] 核酸擴(kuò)增可以通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的各種核酸擴(kuò)增方法實(shí)現(xiàn)，包括聚合酶鏈反 應(yīng)（PCR)。多種擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域已知的，并且特別在美國(guó)專利No. 4683195和美國(guó)專利 No. 4, 683, 202中有描述。PCR擴(kuò)增方法已經(jīng)被發(fā)展用來(lái)擴(kuò)增高達(dá)22kb的基因組DNA。這些 方法以及DNA擴(kuò)增領(lǐng)域中已知的其它方法可用于本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)施。來(lái)自主題棉花事 件的異源轉(zhuǎn)基因DNA插入物的序列或側(cè)翼基因組序列可以如下進(jìn)行驗(yàn)證（以及，如果有必 要，校正）：使用從本文提供的序列衍生的引物從該事件擴(kuò)增此類序列，隨后對(duì)PCR擴(kuò)增子 或克隆的DNA進(jìn)彳丁標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序。
[0131] 通過(guò)這些方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子可以通過(guò)多種技術(shù)來(lái)檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳和溴化 乙錠染色是檢測(cè)DNA擴(kuò)增子的公知方法。另一種這樣的方法是遺傳位分析（Genetic Bit Analysis)，其中設(shè)計(jì)一個(gè)與相鄰的側(cè)翼基因組DNA序列和插入的DNA序列均重疊的DNA寡 核苷酸。將該寡核苷酸固定在微孔板的孔中。對(duì)感興趣的區(qū)域進(jìn)行PCR(使用插入序列中 的一個(gè)引物和相鄰側(cè)翼基因組序列中的一個(gè)引物）之后，單鏈PCR產(chǎn)物可以和該固定的寡 核苷酸雜交，并作為模板，使用DNA聚合酶和特異針對(duì)所預(yù)期的下一個(gè)堿基的標(biāo)記ddNTP進(jìn) 行單堿基延伸反應(yīng)。通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的量進(jìn)行定量，可以完成對(duì)結(jié)合產(chǎn)物的分析。熒光信 號(hào)指示由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸造成的插入/側(cè)翼序列的存在。
[0132] 另一種方法是焦磷酸測(cè)序技術(shù)，如 Winge(Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000) 所述。在該方法中，設(shè)計(jì)與相鄰的基因組DNA和插入DNA的接點(diǎn)重疊的寡核苷酸。該寡核 苷酸被設(shè)計(jì)成與來(lái)自感興趣的區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物雜交（一個(gè)引物位于插入序列中，一個(gè) 引物位于側(cè)翼基因組序列中），并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷 酸酶（apyrase)、腺苷5'磷酰硫酸和熒光素的存在下進(jìn)行溫育。分別添加dNTP，摻入導(dǎo)致 光信號(hào)，光信號(hào)被測(cè)量。光信號(hào)指示由于成功的擴(kuò)增、雜交和單或多堿基延伸造成的轉(zhuǎn)基因 插入/側(cè)翼序列的存在。
[0133] 熒光偏振是另一種可用于檢測(cè)本發(fā)明的實(shí)施方案的擴(kuò)增子的方法。根據(jù)這種方 法，設(shè)計(jì)成與基因組側(cè)翼和插入DNA接點(diǎn)重疊的寡核苷酸。該寡核苷酸與來(lái)自感興趣的區(qū) 域的單鏈PCR產(chǎn)物雜交（一個(gè)引物位于插入DNA中，一個(gè)引物位于側(cè)翼基因組序列中），并 在DNA聚合酶和熒光標(biāo)記的ddNTP的存在下進(jìn)行溫育。單堿基延伸導(dǎo)致ddNTP的摻入。熒 光標(biāo)記的ddNTP的摻入可以作為偏振變化用熒光儀加以測(cè)量。偏振的變化指示由于成功的 擴(kuò)增、雜交、和單堿基延伸造成的轉(zhuǎn)基因插入/側(cè)翼序列的存在。
[0134] TaqMan? (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.)是檢測(cè)和定量DNA序 列的存在的方法。簡(jiǎn)要地說(shuō)，設(shè)計(jì)與基因組側(cè)翼和插入DNA接點(diǎn)重疊的FRET寡核苷酸探針。 將FRET探針和PCR引物（一個(gè)引物位于插入DNA序列中，一個(gè)位于側(cè)翼基因組序列中）在 熱穩(wěn)定的聚合酶和dNTP的存在下循環(huán)。在特定的擴(kuò)增期間，Taq DNA聚合酶的校對(duì)機(jī)構(gòu)從 FRET探針的淬滅部分上釋放出熒光部分。熒光信號(hào)指示由于成功的擴(kuò)增和雜交造成的側(cè)翼 /轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。
[0135] 分子信標(biāo)（Molecular Beacon)已經(jīng)被描述用于多核苷酸序列的檢測(cè)。簡(jiǎn)要地說(shuō)， 設(shè)計(jì)與側(cè)翼基因組和插入DNA接點(diǎn)重疊的FRET寡核苷酸探針。FRET探針的獨(dú)特結(jié)構(gòu)導(dǎo)致 其含有二級(jí)結(jié)構(gòu)，該二級(jí)結(jié)構(gòu)保持熒光部分和淬滅部分緊密接近。將FRET探針和PCR引物 (一個(gè)引物位于插入DNA序列中，一個(gè)位于側(cè)翼基因組序列中）在熱穩(wěn)定的聚合酶和dNTP 的存在下進(jìn)行循環(huán)。在成功的PCR擴(kuò)增之后，F(xiàn)RET探針與靶序列的雜交導(dǎo)致探針二級(jí)結(jié)構(gòu) 的除去和熒光部分和淬滅部分在空間上的分離。結(jié)果產(chǎn)生熒光信號(hào)。熒光信號(hào)指示由于成 功的擴(kuò)增和雜交造成的側(cè)翼基因組/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。
[0136] 在公開(kāi)了棉花基因組中的一個(gè)非常適于插入的位置的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的實(shí)施方案 還包括在該基因組位置附近的區(qū)域內(nèi)含有至少一個(gè)非棉花事件PDAB4468. 18. 07. 1插入物 的棉花種子和/或棉花植物。一個(gè)選擇是用其他不同的插入物代替來(lái)自本文例舉的棉花事 件PDAB4468. 18.07. 1的插入物。一般情況下，在特定的實(shí)施方案中采用，例如，靶向同源 重組。此類技術(shù)是，例如，WO 03/080809A2及相應(yīng)公布的美國(guó)申請(qǐng)（US20030232410)的主 題。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案包括如下的植物和植物細(xì)胞，其含有異源插入物（代替或連同 aad-12或pat基因的多個(gè)拷貝），異源插入物的兩側(cè)是本文所鑒定的全部側(cè)翼序列的或可 識(shí)別的部分（SEQ ID NO: 1 的 bp 1-2885 和 SEQ ID NO: 2 的 bp 148-1049)。aad-12 或 pat 基因的一個(gè)額外拷貝（或多個(gè)額外拷貝）也可以通過(guò)這種/這些方式作為插入用的靶標(biāo)。
[0137] 下面的實(shí)施例被包括用于舉例說(shuō)明用于實(shí)施本發(fā)明實(shí)施方案的程序，和證明本發(fā) 明的某些優(yōu)選實(shí)施方案。這些實(shí)施例不應(yīng)被理解為具有限制意義。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 意識(shí)到，下面實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)只是代表用于例證其實(shí)踐的優(yōu)選模式的特定方法。然而， 本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)，根據(jù)本公開(kāi)，認(rèn)識(shí)到，在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下，可以 對(duì)這些具體實(shí)施方案進(jìn)行許多變化，而仍然能夠獲得相同或類似的結(jié)果。除非另有說(shuō)明，否 則所有的百分比都是按重量計(jì)，所有溶劑混合物的比例均為體積比。
[0138] 下面的實(shí)施例被包括用于舉例說(shuō)明用于實(shí)施本發(fā)明實(shí)施方案的程序，和證明本發(fā) 明的某些優(yōu)選實(shí)施方案。這些實(shí)施例不應(yīng)被理解為具有限制意義。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 意識(shí)到，下面實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)只是代表用于例證其實(shí)踐的優(yōu)選模式的特定方法。然而， 本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)，根據(jù)本公開(kāi)，認(rèn)識(shí)到，在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下，可以 對(duì)這些具體實(shí)施方案進(jìn)行許多變化，而仍然能夠獲得相同或類似的結(jié)果。除非另有說(shuō)明，否 則所有的百分比都是按重量計(jì)，所有溶劑混合物的比例均為體積比。
[0139] 除非另有說(shuō)明，使用如下的縮寫(xiě)。
[0140] bp 堿基對(duì)
[0141] V 攝氏度
[0142] DNA 脫氧核糖核酸
[0143] EDTA 乙二胺四乙酸
[0144] kb 千堿基
[0145] u g 微克
[0146] u L 微升
[0147] mL 毫升
[0148] M 摩爾量（molar mass)
[0149] PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
[0150] PTU 植物轉(zhuǎn)錄單元或表達(dá)盒
[0151] SDS 十_燒基硫酸納
[0152] SSC 含有氯化鈉和檸檬酸鈉混合物的緩沖溶液，pH 7. 0
[0153] TBE 含有Tirs堿、硼酸和EDTA混合物的緩沖溶液，pH 8. 3 實(shí)施例
[0154] 實(shí)施例I :aad_12和Dat棉花事件DDAB4468. 18. 07. 1的轉(zhuǎn)化和篩詵
[0155] 通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、并使用含有草胺膦的培養(yǎng)基進(jìn)行選擇，產(chǎn)生含有棉 花事件pDAB4468. 18. 07. 1的轉(zhuǎn)基因棉花（陸地棉Gossypium hirsutum)。使用去甲 (disarmed) 土壤桿菌菌株EHAlOl (Hood et al.，1993)啟動(dòng)棉花植物品種Coker 310的轉(zhuǎn) 化，上述菌株攜帶雙元載體PDAB4468 (圖1)，該載體在T-鏈DNA區(qū)中含有可選擇標(biāo)志物pat 和感興趣的基因aad-12。pDAB4468的DNA T-鏈序列在SEQ ID N0:3中示出，且在下面表 1中有注釋。
[0156] 表1 :位于pDAB4468上的基因元件
[0157]
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的DNA序列，包括一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列：SEQ ID N0:1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 48-247 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297。
2. -種棉花植物育種方法，包括： 使第一植物與第二棉花植物雜交產(chǎn)生第三棉花植物，所述第一植物包含這樣的DNA， 其包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列：SEQ ID NO: 1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1的bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 48-247;和 SEQ ID NO: 2 的 bp 1-297,及其互補(bǔ)物；和對(duì)所述第三棉花植物測(cè)定包含一個(gè)或多個(gè)選自下組的序列的DNA的 存在：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID N0:1 的bp 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的bp 128-167 ;SEQ ID N0:2 的bp 98-197 ;SEQ ID NO:2 的 bp 48-247 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297,和其互補(bǔ)物。
3. -種分離的DNA分子，其包含接點(diǎn)序列，所述接點(diǎn)序列包含至少一個(gè)選自下組的 序列：SEQ ID NO: 1 的 bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的bp 98-197 ;SEQ ID N0:2 的 bp 48-247;和 SEQ ID N0:2 的 bp 1-297,和其互補(bǔ)物。
4. 一種棉花種子，該種子在其基因組中含有選自下組的DNA序列：SEQ ID N0:1的殘基 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的殘基2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 殘基 2737-3036 ;SEQ ID N0:2 的殘基 128-167 ;SEQ ID N0:2 的殘基 98-197 ;SEQ ID N0:2 的殘基48-247 ;和SEQ ID NO: 2的殘基1-297,和其互補(bǔ)物。
5. -種棉花種子，該種子在其基因組中含有AAD-12/PAT棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1， 且其代表性的棉花種子以登錄號(hào)PTA-12456保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
6. -種通過(guò)種植權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的種子產(chǎn)生的棉花植物。
7. -種由權(quán)利要求6的植物產(chǎn)生的棉花種子，其中所述種子在其基因組中含有 AAD-12/PAT棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1，該事件也存在于以登錄號(hào)PTA-12456保藏在美國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心的棉花種子中。
8. -種權(quán)利要求6的棉花植物的部分，其中所述部分選自下組：花粉、胚珠、花、棉鈴、 芽、根和葉，并且所述部分包含所述事件。
9. 一種從權(quán)利要求6的棉花植物或權(quán)利要求8的部分衍生的組合物，其中所述組合物 是選自下組的商業(yè)產(chǎn)品：棉柏、棉纖維和棉籽油。
10. 權(quán)利要求6的植物的后代棉花植物，其中所述植物對(duì)苯氧基乙酸、吡啶氧基乙酸和 草胺膦除草劑顯示耐受性，并且所述耐受性是由于在所述事件或所述基因組中編碼的蛋白 質(zhì)的表達(dá)導(dǎo)致的。
11. 權(quán)利要求6的棉花植物，其中所述棉花植物包含與SEQ ID N0:17的殘基 2, 886-9, 253具有至少95 %序列同一性的DNA序列。
12. -種棉花種子，其包含含有與SEQ ID NO: 17具有至少95%的序列同一性的DNA序 列的基因組。
13. 通過(guò)種植權(quán)利要求12的種子產(chǎn)生的植物。
14. 一種包含棉花事件pDAB4468. 18. 07. 1的轉(zhuǎn)基因棉花植物或其部分，其中包含棉花 事件PDAB4468. 18.07. 1的代表性棉花種子已被保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，登錄號(hào) 為 PTA-12456。
15. -種控制棉花作物中的雜草的方法，包括向棉花作物施用苯氧乙酸除草劑，所述棉 花作物包括含有如下所述DNA的棉花植物，該DNA包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2737-3036 ;SEQ ID NO: 2 的bp 128-167 ;SEQ ID NO: 2 的 bp 98-197 ;SEQ ID NO: 2 的bp 48-247 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述苯氧乙酸除草劑是2, 4-D。
17. 權(quán)利要求15的方法，其中所述苯氧乙酸除草劑是MCPA。
18. -種控制棉花作物中的雜草的方法，包括向棉花作物施用吡啶氧基乙酸除草劑，所 述棉花作物包括含有如下DNA的棉花植物，該DNA包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2737-3036;SEQ ID N0:2 的bp 128-167;SEQ ID N0:2 的bp 98-197;SEQ ID N0:2 的bp 48-247 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述吡啶氧基乙酸除草劑是綠草定。
20. 權(quán)利要求18的方法，其中所述吡啶氧基乙酸除草劑是氟草煙。
21. -種控制棉花作物中的雜草的方法，包括向棉花作物施用草胺膦除草劑，所述棉 花作物包括含有如下DNA的棉花植物，該DNA包含選自下組的序列：SEQ ID NO: 1的bp 2867-2906 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2837-2936 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2787-2986 ;SEQ ID NO: 1 的 bp 2737-3036;SEQ ID N0:2 的bp 128-167;SEQ ID N0:2 的bp 98-197;SEQ ID N0:2 的bp 48-247 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp 1-297。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK104427862SQ201380016010
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月23日
【發(fā)明者】Y·C·崔, R·金, T·M·凱澤, A·E·魯賓遜, D·佩爾迪, S·G·托萊多, L·B·布拉克斯頓, D·M·安德森 申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司