阿茲海默癥基因檢測裝置制造方法
【專利摘要】本實用新型提供一種阿茲海默癥基因檢測裝置，其包含一基板、一樣品墊、一結(jié)合墊、一薄膜墊以及一吸附墊，其中樣品墊、結(jié)合墊、薄膜墊依序排列設(shè)置于基板的一表面上并且彼此相互連接；薄膜墊設(shè)有一第一SNP檢測區(qū)，第一SNP檢測區(qū)包括一第一檢測線以及一第二檢測線。第一檢測線、第二檢測線分別固定不同的APOE等位基因的核苷酸探針，而第一檢測線與第二檢測線的探針存有一核苷酸的差異。本實用新型藉由將多個涵蓋APOE等位基因的單核苷酸多態(tài)性位點的探針并配合預(yù)定的側(cè)向流方向配置于薄膜墊上形成所述的第一檢測線以及第二檢測線，達(dá)到有效且專一于單一步驟中測定APOE基因型的目的，以作為阿茲海默癥的預(yù)防與治療的依據(jù)。
【專利說明】阿茲海默癥基因檢測裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型是關(guān)于一種快速篩檢基因的裝置，尤指配置有適當(dāng)檢測部件而可供用于快速且精確的篩檢APOE等位基因型的檢測試片。
【背景技術(shù)】
[0002]阿茲海默癥初期最常見的癥狀是難以記住最近發(fā)生的事，隨著疾病進(jìn)展，癥狀將會包括譫妄、易怒、具攻擊性、情緒起伏不定、喪失長期記憶等。病患通常因為無法發(fā)揮正常功能，而退出家庭和社會的社交關(guān)系，并隨著身體功能逐漸喪失，終致死亡。初步懷疑罹患阿茲海默癥時，通常藉由行為評估以及認(rèn)知測試(Cognitive test)來確認(rèn)診斷，進(jìn)階的診斷為神經(jīng)影像檢查輔助診斷。
[0003]阿茲海默癥的癥狀可分為早期、中期以及晚期，各時期反應(yīng)在行為與認(rèn)知能力損害程度有所不同。此外，依據(jù)發(fā)作的時間早晚又分為主要發(fā)生于65歲以前的早發(fā)型與發(fā)生于65歲以后的晚發(fā)型阿茲海默癥，其中10%的患者屬于早發(fā)型阿茲海默癥，與家族病史強烈相關(guān)；而90%的患者屬于晚發(fā)型阿茲海默癥，與家族病史較無直接關(guān)系。早發(fā)型阿茲海默癥可分為第一型阿茲海默癥(Alzheimer disease type 1，ADI)、第三型阿茲海默癥(Alzheimer disease type 3, AD3)以及第四型阿茲海默癥(Alzheimer disease type4，AD4)，晚發(fā)型阿茲海默癥即第二型阿茲海默癥(Alzheimer disease type 2，AD2)。就兩者的變異類型而言，相較于早發(fā)型阿茲海默癥通常為APP、PSENU PSEN2基因突變所造成，晚發(fā)型阿茲海默癥通常與單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)相關(guān)，例如與特定(APOE)的單核苷酸多態(tài)性有高度相關(guān)性，例如AP0E-rs7412以及AP0E-rs429358o
[0004]研究顯示與晚發(fā)型阿茲海默癥相關(guān)的基因型可依據(jù)SNP分為ApoE ε 2,ApoE ε 3、ApoE ε 4, ApoE ε 2 是指 SNP rs429358 與 rs7412 皆為胸苷(thymidine, Τ)，注記為 Ε2 型，為保護(hù)性基因型；ΑροΕ ε 3是指SNP rs429358與rs7412分別為T與胞苷(cytidine, C)，注記為E3型，為低風(fēng)險性基因型；ApoE ε 4是指SNP rs429358與rs7412皆C，注記為E4型，為高風(fēng)險性基因型。具有所述的保護(hù)性基因型、低風(fēng)險性基因型與高風(fēng)險性基因型的攜帶者(carrier)摧患阿茲海默癥的風(fēng)險依序由低至高。研究人員發(fā)現(xiàn)APOE等位基因皆為高風(fēng)險性基因型的個體，注記為E4/E4，確實較為容易罹患晚發(fā)型阿茲海默癥；相對的，APOE等位基因皆為保護(hù)性基因型的個體，注記為E2/E2，罹患晚發(fā)型阿茲海默癥的風(fēng)險相對最低(Influence of apolipoprotein E genotype on the transmission ofAlzheimer disease in a community-based sample.G.Jarvik, Ε.B.Larson, K.Goddard, G.D.Schellenberg, Ε.M.Wijsman.Am J Hum Genet.1996 January;58(I):191 - 200.)?
[0005]為了檢測不同個體或者不同細(xì)胞的基因表達(dá)(gene expression)或者等位基因型(allele genotype),過去已經(jīng)發(fā)展出多種檢測基因的方法,其中北方墨點(NorthernBlot)分析或者南方墨點(Southern blot)分析,其原理為令經(jīng)標(biāo)定的特定核苷酸探針(nucleotide probe)與經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)染而得的含有標(biāo)的RNA或DNA的薄膜進(jìn)行雜交反應(yīng)(hybridization),進(jìn)而通過經(jīng)標(biāo)定的探針的訊號以偵測目標(biāo)RNA或DNA存在。此外,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)配合定序分析，鑒定等位基因型亦為常見手段，但由于此類方法操作上的限制，并不利于使用者在家自行篩檢，必須自始至終于專業(yè)的實驗室經(jīng)由特定的儀器進(jìn)行反應(yīng)。一般而言，對于一般APOE基因的SNP的檢測，仍必須通過核酸分離與定序的程序予以確認(rèn)。
[0006]中國臺灣第1352738號專利案提供一種偵測阿茲海默癥的方法，其是針對ABCA2基因的rs908832變異基因的次要等位基因型進(jìn)行檢測，而可供用于測定白種人族群個體罹患早發(fā)型阿茲海默癥的風(fēng)險。該專利案并未提供檢測晚發(fā)型阿茲海默癥的技術(shù)，且此檢測方法必須先萃取病人的DNA并經(jīng)繁復(fù)的步驟以分別鑒定ABCA2等位基因的各種基因型，并未提供利用側(cè)向流分析核苷酸樣品的檢測裝置，無法于一步驟試驗中辨別特定基因的等位基因型。該專利案無法解決現(xiàn)有技術(shù)仍需要自始至終于專業(yè)實驗室經(jīng)由特定的儀器進(jìn)行反應(yīng)而需繁瑣步驟進(jìn)行檢測的缺點。
[0007]基于上述可知，現(xiàn)有技術(shù)缺乏一種快速篩檢阿茲海默癥的檢測裝置，并藉由篩檢的結(jié)果以幫助個體預(yù)防或治療阿茲海默癥。
實用新型內(nèi)容
[0008]有鑒于現(xiàn)有技術(shù)仍需多步驟純化檢體、制備樣品、分析樣品，藉以確認(rèn)阿茲海默癥相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性基因型(single nucleotide polymorphism genotyping),本實用新型的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)需要重復(fù)進(jìn)行不同等位基因的SNP分析的問題，提供一種阿茲海默癥基因檢測裝置，其可同時針對APOE等位基因的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism, SNP)位點進(jìn)行偵測，達(dá)到有效且專一的測定APOE基因型的目的。此外，現(xiàn)有技術(shù)缺乏針對晚發(fā)型阿茲海默癥的快速篩檢方法，故本實用新型亦提供針對晚發(fā)型阿茲海默癥的檢測技術(shù)。
[0009]因此，本實用新型提供了一種阿茲海默癥基因檢測裝置，該阿茲海默癥基因檢測裝置包含一基板、一樣品墊、一結(jié)合墊、一薄膜墊以及一吸附墊，其中樣品墊、結(jié)合墊、薄膜墊依序排列設(shè)置于基板的一表面上并且彼此相互連接；薄膜墊設(shè)有一第一 SNP檢測區(qū)以及一控制線，其中第一 SNP檢測區(qū)包括一第一檢測線以及一第二檢測線。
[0010]進(jìn)一步的，所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中，第一檢測線、第二檢測線分別具有APOE等位基因的核苷酸探針，其中第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有一核苷酸的差異(第一檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針與第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針彼此之間具有一核苷酸差異，即，第一檢測線、第二檢測線具有不同的APOE等位基因的核苷酸探針)。
[0011]進(jìn)一步的，所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中，APOE等位基因的核苷酸探針選自于涵蓋APOE的SNP rs429358或rs7412位點的APOE基因序列片段。
[0012]進(jìn)一步的，所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中，第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針涵蓋APOE的rs429358 SNP位點。
[0013]進(jìn)一步的，所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，薄膜墊還設(shè)有一第二 SNP檢測區(qū)，第二 SNP檢測區(qū)包括一第三檢測線以及一第四檢測線，第三檢測線以及第四檢測線分別具有APOE等位基因的核苷酸探針，其中第三檢測線、第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有一核苷酸的差異。所述的第二 SNP檢測區(qū)是用以偵測與第一 SNP檢測區(qū)不同的SNP位點，其中第三檢測線以及第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針與第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針?biāo)w的APOE的SNP位點不同。
[0014]進(jìn)一步的，所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中，第三檢測線、第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針涵蓋APOE的rs7412 SNP位點。
[0015]進(jìn)一步的，所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中，第一檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.3所示序列，而第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.4所示序列。
[0016]進(jìn)一步的，所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中，第三檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.7所示序列，而第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.8所示序列。
[0017]進(jìn)一步的，所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中，APOE等位基因的核苷酸探針的大小介于16至25核苷酸，其熔點溫度為50°C至65°C。
[0018]進(jìn)一步的，所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中，第一 SNP檢測區(qū)還包括一第五檢測線、一第六檢測線，以及第二 SNP檢測區(qū)更包括一第七檢測線、一第八檢測線。
[0019]進(jìn)一步的，所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中，第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線、第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針分別具有SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.7 及 SEQ ID N0.8 所示序列。
[0020]進(jìn)一步的，所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中，第一檢測區(qū)的第一檢測線、第二檢測線、第五檢測線、第六檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針是選自于SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.4所示序列的核苷酸探針；而第二檢測區(qū)的第三檢測線、第四檢測線、第七檢測線、第八檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針是選自于SEQ ID N0.5至SEQ ID N0.8所示序列的核苷酸探針。
[0021]本實用新型的阿茲海默癥基因檢測裝置于使用時將樣品溶液施用于樣品墊上，令樣品溶液的標(biāo)的核酸分子通過一側(cè)向流(lateral flow)朝向吸附墊方向移動,標(biāo)的核酸分子通過結(jié)合墊而與結(jié)合墊內(nèi)的標(biāo)定物結(jié)合后，繼而進(jìn)入薄膜墊，而與所述檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針專一性的結(jié)合，依據(jù)偵測第一檢測區(qū)、第二檢測區(qū)的第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線以及第四檢測線的訊號可以判定標(biāo)的核酸分子的APOE等位基因型，而無須再加以定序，依據(jù)本實用新型的手段可以直接簡化現(xiàn)有技術(shù)的檢測流程，于一步驟中即可測定待測對象的APOE的多種等位基因型。
[0022]依據(jù)本實用新型，所述的樣品溶液是由一待測對象的核酸檢體所制備而得，其含有經(jīng)標(biāo)定的APOE基因片段的溶液；較佳的，樣品溶液中含有待測對象的核酸檢體，其是利用經(jīng)標(biāo)定的引物所擴增出APOE基因片段，諸如于一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中以經(jīng)標(biāo)定的APOE引物對擴增而得的APOE基因片段。
[0023]所述的“ΑΡ0Ε等位基因的核苷酸探針”可為已知的任何APOE等位基因的序列所設(shè)計出，較佳的選自于涵蓋APOE的SNP rs429358或rs7412位點的APOE基因序列片段，其中SNP rs429358為胸苷(thymidine, T)與rs7412為胞苷(cytidine, C)，即野生型正義探針；SNP rs429358為胞苷與rs7412為胸苷，即突變型正義探針；更佳的，APOE等位基因的核苷酸探針具有與E2、E3、E4型基因序列片段互補的序列，即野生型或突變型負(fù)義探針。
[0024]依據(jù)本實用新型，所述的“ΑΡ0Ε等位基因的核苷酸探針”的大小介于16至25核苷酸，其熔點溫度(melting point temperature, Tm)為 50°C至 65°C。
[0025]較佳的，所述的“ΑΡ0Ε等位基因的核苷酸探針”的大小介于16至22核苷酸，其熔點溫度(melting point temperature, Tm)為 5CTC至 6CTC。
[0026]依據(jù)本實用新型，所述的第一 SNP檢測區(qū)與第二 SNP檢測區(qū)可依照需求予以設(shè)置于薄膜墊選定的位置，而不限于第一 SNP檢測區(qū)介于結(jié)合墊與第二 SNP檢測區(qū)之間。另可選擇的，第二 SNP檢測區(qū)介于結(jié)合墊與第一 SNP檢測區(qū)之間。
[0027]依據(jù)本實用新型，所述的第一 SNP檢測區(qū)還可包含一第五檢測線和/或第六檢測線，而第二 SNP檢測區(qū)還可包含一第七檢測線和/或第八檢測線，其中與第一檢測線、二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針為突變型負(fù)義探針以及野生型負(fù)義探針相對應(yīng)的第五檢測線、第六檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針為野生型正義探針與突變型正義探針。類似的情形適用于第三檢測線、第四檢測線、第七檢測線、第八檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針。
[0028]較佳的，所述的“ΑΡ0Ε等位基因的核苷酸探針”具有SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.8任一所示序列。第一檢測區(qū)與第二檢測區(qū)的第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線以及第四檢測線的相對排列位置，可依據(jù)需求選擇具有特定序列的APOE等位基因的核苷酸探針，達(dá)到避免噪聲產(chǎn)生或避免非所欲的因素影響結(jié)果。
[0029]較佳的，所述的第一 SNP檢測區(qū)的第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針，它們涵蓋同一 APOE的SNP位點，亦即第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針的序列只有一個核苷酸的差異。例如，但不限于:所述的差異對應(yīng)于APOErs429358的SNP位點，第一檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.1所示序列，其涵蓋的rs429358位點為C，而第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ IDN0.2所示序列，其涵蓋的rs429358位點為T。類似的，第一檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針亦可具有SEQ ID N0.3所示序列，而第二檢測線所具APOE等位基因的核苷酸探針為SEQ ID N0.4所示序列。
[0030]承上所述，與第一檢測線、第二檢測線不同，第二 SNP檢測區(qū)的第三檢測線、第四檢測線為涵蓋另一 APOE的SNP位點的APOE等位基因的核苷酸探針。較佳的，所述的第二SNP檢測區(qū)所涵蓋的APOE的SNP位點為APOE rs7412。例如，第三檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.5所示序列，其涵蓋的rs7412位點為C，而于第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.6所示序列，其涵蓋的rs7412位點為T。類似的，第三檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針亦可具有SEQ ID N0.7所示序列，而第四檢測線所具者為SEQ ID N0.8所示序列。
[0031]由于所述的APOE等位基因的核苷酸探針為涵蓋諸如APOE的SNP rs429358或rs7412位點的APOE基因序列片段，因此當(dāng)待測對象的檢體被施用于所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，可藉由第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線以及第四檢測線是否產(chǎn)生訊號，以及訊號的組合形式，決定待測對象的APOE等位基因型是E2/E2、E2/E3、E3/E3、E2/E4、E3/E4或E4/E4，進(jìn)而提供一罹患晚發(fā)型阿茲海默癥的風(fēng)險為低至高的判斷結(jié)果。
[0032]綜上所述，本實用新型藉由將涵蓋不同的APOE等位基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點的核苷酸探針，依照預(yù)定的側(cè)向流方向固定于薄膜墊的第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線及第四檢測線，于施用樣品溶液于樣品墊，經(jīng)反應(yīng)后，比較參照第一 SNP檢測區(qū)與第二 SNP檢測區(qū)的第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線及第四檢測線的訊號，而可以于單一步驟反應(yīng)中專一且準(zhǔn)確的測定待測對象的APOE的SNP基因型，而判定APOE等位基因型，提供罹患晚發(fā)型阿茲海默癥風(fēng)險的預(yù)測，以作為預(yù)防與治療的依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1是本實用新型的較佳實施例的俯視示意圖。
[0034]圖2是圖1的側(cè)視剖面示意圖。
[0035]圖3是本實用新型的薄膜墊的操作原理示意圖。
[0036]圖4A至圖4F為本實用新型的較佳實施例的實施狀態(tài)參考圖。
[0037]圖中符號說明:
[0038]10 基板
[0039]20樣品墊
[0040]30吸附墊
[0041]40結(jié)合墊
[0042]50薄膜墊
[0043]511第一檢測線
[0044]512第二檢測線
[0045]521第三檢測線
[0046]522第四檢測線
[0047]53控制線
【具體實施方式】
[0048]本實用新型的一種阿茲海默癥基因檢測裝置，其包含一基板、一樣品墊、一結(jié)合墊、一薄膜墊以及一吸附墊，其中樣品墊、結(jié)合墊、薄膜墊依序排列設(shè)置于基板的一表面上并且彼此相互連接；薄膜墊設(shè)有一第一 SNP檢測區(qū)、一第二 SNP檢測區(qū)以及一控制線，其中第一 SNP檢測區(qū)包括一第一檢測線以及一第二檢測線，以及第二 SNP檢測區(qū)包括一第三檢測線以及一第四檢測線，第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線以及第四檢測線分別固定一APOE等位基因的核苷酸探針。所述的阿茲海默癥基因檢測裝置是將樣品墊20、吸附墊30、結(jié)合墊40、薄膜墊50固定于基板10上而組裝成。
[0049]所述的第一 SNP檢測區(qū)的第一檢測線511、第二檢測線512各自具有一 APOE等位基因的核苷酸探針，所述APOE等位基因的核苷酸探針彼此之間具有一核苷酸差異，通過第一 SNP檢測區(qū)的第一檢測線、第二檢測線訊號，可以判斷待側(cè)對象的APOE基因的特定位點的單核苷酸多態(tài)性。
[0050]在本實用新型的一較佳實施例中，第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針涵蓋同一 APOE的rs429358 SNP位點，它們只有一個核苷酸的差異，第一檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.1所示序列，其涵蓋的rs429358位點為C，而第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.2所示序列，其涵蓋的rs429358位點為T。在本實用新型的另一較佳實施例中，第一檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針亦可具有SEQ ID N0.3所示序列，其涵蓋的rs429358位點為C，而第二檢測線所具APOE等位基因的核苷酸探針為SEQ ID N0.4所示序列，其涵蓋的rs429358位點為T。
[0051]在本實用新型的一較佳實施例中，第三檢測線、第四檢測線為涵蓋APOE的SNPrs7412位點的APOE等位基因的核苷酸探針，第三檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.5所示序列，其涵蓋的rs7412位點為C，而于第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID勵.6所示序列，其涵蓋的1^7412位點為1'。在本實用新型的另一較佳實施例中，第三檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針亦可具有SEQ ID N0.7所示序列，其涵蓋的rs7412位點為C，而第四檢測線所具APOE等位基因的核苷酸探針為SEQ ID N0.8所示序列，其涵蓋的rs7412位點為T。
[0052]在本實用新型的一較佳實施例中，所述阿茲海默癥基因檢測裝置具有主要如上述所述的結(jié)構(gòu)，除此之外，其中第一 SNP檢測區(qū)還可包括一第五檢測線、一第六檢測線，以及第二 SNP檢測區(qū)還可包括一第七檢測線、一第八檢測線。
[0053]在本實用新型的一較佳實施例中，第一檢測區(qū)包括第一檢測線、第二檢測線、第五檢測線、第六檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針，它們?yōu)楹wSNP rs4293582位點的野生型與突變型正義、負(fù)義探針，如選自于SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.4所示序列的核苷酸探針；而第二檢測區(qū)包括第三檢測線、第四檢測線、第七檢測線、第八檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針，它們?yōu)楹wSNP rs7412位點的野生型與突變型正義、負(fù)義探針，如選自于SEQ ID N0.5至SEQ ID N0.8所示序列的核苷酸探針。如前所述，當(dāng)正義、負(fù)義探針同時存在時，作為檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性的重復(fù)確認(rèn)，而更進(jìn)一步避免假性檢測結(jié)果發(fā)生。
[0054]在本實用新型的另一較佳實施例中，第一檢測線、第二檢測線、第五檢測線、第六檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針選自于SEQ ID N0.5至SEQ ID N0.8，第一檢測線、第二檢測線、第五檢測線、第六檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針各自為具有SEQ ID N0.5至SEQ ID N0.8所示不同序列的核苷酸探針；而第三檢測線、第四檢測線、第七檢測線、第八檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針選自于SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.4 ;第三檢測線、第四檢測線、第七檢測線、第八 檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針各自為具有SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.4所示不同序列的核苷酸探針。
[0055]本實用新型藉由下列實施例作為例示說明，以使得所請范疇更為清楚，而不應(yīng)作為解釋保護(hù)范圍的限制。
[0056]實施例
[0057]阿茲海默癥基因檢測裝置的制造
[0058]如圖1與圖2所示，本實施例提供一阿茲海默癥基因檢測裝置，其包括一基板10、一樣品墊20、一吸附墊30、一結(jié)合墊40以及一薄膜墊50，其中基板10的一側(cè)面的一端設(shè)置樣品墊20，基板10的該側(cè)面的另一端設(shè)置吸附墊30，位于樣品墊20與吸收墊30之間并與樣品墊20鄰接設(shè)置結(jié)合墊40，結(jié)合墊40與吸附墊30之間設(shè)置薄膜墊50，薄膜墊50橫向平行設(shè)置有一第一 SNP檢測區(qū)51以及一第二 SNP檢測區(qū)52以及一控制線53，其中該第一SNP檢測區(qū)51包括一第一檢測線511和一第二檢測線512，該第二 SNP檢測區(qū)52包括一第三檢測線521和一第四檢測線522。
[0059]所述的阿茲海默癥基因檢測裝置的制備方式簡述如下，其與一般免疫層析檢測大致相同。首先提供一基板10、一樣品墊20、一吸附墊30、一結(jié)合墊40的本體以及一薄膜墊50，所述的基板10為塑料材料所制造而成；所述的樣品墊20為玻璃纖維所制成；所述的吸附墊30為纖維紙；所述的結(jié)合墊40的本體為玻璃纖維所制成；所述的薄膜墊50為硝化纖維素薄膜。
[0060]所述的結(jié)合墊40包括一本體與一標(biāo)定物，此處的標(biāo)定物為與膠體金結(jié)合的抗-Digoxigenin (Dig)抗體,其能夠辨識Dig,而能與經(jīng)Dig標(biāo)定的APOE基因片段結(jié)合,膠體金的聚集沉淀會呈現(xiàn)肉眼可見的顏色，可藉此判定與標(biāo)定物結(jié)合的標(biāo)的基因片段的存在與否。結(jié)合墊40是藉由將玻璃纖維本體浸潰于含有與膠體金結(jié)合的抗-Digoxigenin (Dig)抗體的溶液后干燥而得。
[0061]將卵白素(sti^ptavidin)與經(jīng)生物素(biotin)標(biāo)定的具有SEQID N0.3,SEQ IDN0.4、SEQ ID N0.7及SEQ ID N0.8所示序列的探針的混合溶液噴涂于薄膜墊50，形成四條間隔的并行線，形成所述的第一檢測線511、第二檢測線512、第三檢測線521、第四檢測線522，如圖3所示,藉以分別與rs429358為C、rs429358為T、rs7412為C、rs7412為T的APOE等位基因片段相結(jié)合。
[0062]將經(jīng)生物素標(biāo)定的rs429358突變型負(fù)義探針(注記為MAT)，即經(jīng)生物素標(biāo)定的具有如SEQ ID N0.3所示序列的APOE等位基因的核苷酸探針，通過與卵白素結(jié)合而固定于薄膜墊，以形成所述的第一檢測線511。
[0063]將經(jīng)生物素標(biāo)定的rs429358野生型負(fù)義探針(注記為WAT)，即經(jīng)生物素標(biāo)定的具有如SEQ ID N0.4所示序列的APOE等位基因的核苷酸探針，通過與卵白素結(jié)合而固定于薄膜墊，以形成所述的第二檢測線512。
[0064]將經(jīng)生物素標(biāo)定的rs7412野生型負(fù)義探針(注記為WAT)，即經(jīng)生物素標(biāo)定的具有如SEQ ID N0.7所示序列的APOE等位基因的核苷酸探針，通過與卵白素結(jié)合而固定于薄膜墊，以形成所述的第三檢測線521。
[0065]將經(jīng)生物素標(biāo)定的rs7412突變型負(fù)義探針(注記為MAT)，即經(jīng)生物素標(biāo)定的具有如SEQ ID N0.8所示序列的APOE等位基因的核苷酸探針，通過與卵白素結(jié)合而固定于薄膜墊，以形成所述的第四檢測線522。
[0066]另于薄膜墊50第四檢測線522與吸附墊30之間涂布針對抗Dig抗體的二級抗體(Ant1-Dig secondary antibody),形成控制線53,以辨識標(biāo)定與膠體金結(jié)合的抗Dig抗體，作為陽性反應(yīng)的對照組。
[0067]將樣品墊20、吸附墊30、結(jié)合墊40、薄膜墊50固定于基板10上，組裝成所述的阿茲海默癥基因檢測裝置。
[0068]由檢體準(zhǔn)備樣品溶液
[0069]取待測對象A、B、C、D、E及F的核酸檢體，使用經(jīng)Dig標(biāo)定的引物AP0E_A(SEQ IDN0.9)以及APOE-C (SEQ ID N0.10)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增大小為303堿基對的經(jīng)Dig標(biāo)定的APOE基因片段，其涵蓋rs429358以及rs7412的SNP位點，并且齊備含有該經(jīng)標(biāo)定的APOE基因片段的樣品溶液A、B、C、D、E及F。
[0070]以阿茲海默癥基因檢測裝置分析檢體
[0071]配合參考圖3所示，將前述樣品溶液各自施用于一阿茲海默癥基因檢測裝置的樣品墊10，使之均勻分布進(jìn)入結(jié)合墊40，該經(jīng)Dig標(biāo)定的APOE基因片段于結(jié)合墊40中與膠體金結(jié)合的抗Dig抗體結(jié)合,膠體金結(jié)合的抗Dig抗體與經(jīng)Dig標(biāo)定的APOE基因片段通過毛細(xì)現(xiàn)象繼續(xù)移動進(jìn)入薄膜墊50，第一檢測線511、第二檢測線512、第三檢測線521、第四檢測線 522 的具有如 SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.7 及 SEQ ID N0.8 所示序列的APOE等位基因的核苷酸探針會專一'丨生的與結(jié)合有膠體金結(jié)合的抗Dig抗體的經(jīng)Dig標(biāo)定的APOE基因片段反應(yīng)，而膠體金聚集而顯現(xiàn)顏色，沒有作用的膠體金結(jié)合的抗Dig抗體會與控制線53的針對抗Dig抗體的抗體結(jié)合而顯現(xiàn)顏色。
[0072]樣品溶液A施用于一阿茲海默癥基因檢測裝置，結(jié)果如圖4A所示，顯示樣品溶液A中經(jīng)Dig標(biāo)定的APOE基因片段與第一 SNP偵測區(qū)的第二檢測線512以及第二 SNP偵測區(qū)的第四檢測線522結(jié)合，表示檢體A的APOE等位基因型為E2/E2型。
[0073]樣品溶液B施用于一阿茲海默癥基因檢測裝置，結(jié)果如圖4B所示，顯示樣品溶液B中經(jīng)Dig標(biāo)定的APOE基因片段與第一 SNP偵測區(qū)51的第二檢測線512以及第二 SNP偵測區(qū)52的第三檢測線521、第四檢測線522結(jié)合，表示檢體B的APOE等位基因型為E2/E3型。
[0074]樣品溶液C施用于一阿茲海默癥基因檢測裝置，結(jié)果如圖4C所示，顯示樣品溶液C中經(jīng)Dig標(biāo)定的APOE基因片段與第一 SNP偵測區(qū)51的第一檢測線511、第二檢測線512以及第二 SNP偵測區(qū)52的第三檢測線521、第四檢測線522結(jié)合，表示檢體C的APOE等位基因型為E2/E4型。
[0075]樣品溶液D施用于一阿茲海默癥基因檢測裝置，結(jié)果如圖4D所示，顯示樣品溶液D中經(jīng)Dig標(biāo)定的APOE基因片段與第一 SNP偵測區(qū)51的第二檢測線512以及第二 SNP偵測區(qū)52的第三檢測線521結(jié)合，表示檢體D的APOE等位基因型為E3/E3型。
[0076]樣品溶液E施用于一阿茲海默癥基因檢測裝置，結(jié)果如圖4E所示，顯示樣品溶液E中經(jīng)Dig標(biāo)定的APOE基因片段與第一 SNP偵測區(qū)51的第一檢測線511、第二檢測線512以及第二 SNP偵測區(qū)52的第三檢測線521結(jié)合，表示檢體E的APOE等位基因型為E3/E4型。
[0077]樣品溶液F施用于一阿茲海默癥基因檢測裝置，結(jié)果如圖4F所示，顯示樣品溶液F中經(jīng)Dig標(biāo)定的APOE基因片段與第一 SNP偵測區(qū)51的第一檢測線511以及第二 SNP偵測區(qū)52的第三檢測線521結(jié)合，表示檢體F的APOE等位基因型為E4/E4型。
[0078]基于上述檢測結(jié)果可見，所述樣品溶液制備后施用于所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，可于單一的步驟于檢測線位置呈現(xiàn)顏色，顯示檢體A-F的來源待檢測對象之APOE等位基因型分別為E2/E2型、E2/E3型、E3/E3型、E2/E4型、E3/E4型、E4/E4型，判定所屬檢
測對象罹患晚發(fā)型阿茲海默癥的風(fēng)險分別為低至高。
[0079]
【權(quán)利要求】
1.一種阿茲海默癥基因檢測裝置，其特征在于，該阿茲海默癥基因檢測裝置包含一基板、一樣品墊、一結(jié)合墊、一薄膜墊以及一吸附墊，其中樣品墊、結(jié)合墊、薄膜墊依序排列設(shè)置于基板的一表面上并且彼此相互連接；薄膜墊設(shè)有一第一 SNP檢測區(qū)以及一控制線，其中第一 SNP檢測區(qū)包括一第一檢測線以及一第二檢測線。
2.如權(quán)利要求1所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其特征在于，第一檢測線、第二檢測線分別具有APOE等位基因的核苷酸探針，其中第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有一核苷酸的差異。
3.如權(quán)利要求2所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其特征在于，APOE等位基因的核苷酸探針選自于涵蓋APOE的SNP rs429358或rs7412位點的APOE基因序列片段。
4.如權(quán)利要求3所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其特征在于，第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針涵蓋APOE的rs429358SNP位點。
5.如權(quán)利要求4所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其特征在于，薄膜墊還設(shè)有一第二SNP檢測區(qū)，第二 SNP檢測區(qū)包括一第三檢測線以及一第四檢測線，第三檢測線以及第四檢測線分別具有APOE等位基因的核苷酸探針，其中第三檢測線、第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有一核苷酸的差異。
6.如權(quán)利要求5所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其特征在于，第三檢測線、第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針涵蓋APOE的rs7412 SNP位點。
7.如權(quán)利要求1至6任一項所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其特征在于，第一檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.3所示序列，而第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.4所示序列。
8.如權(quán)利要求5或6所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其特征在于，第三檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.7所示序列，而第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.8所示序列。
9.如權(quán)利要求7所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其特征在于，第三檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.7所示序列，而第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.8所示序列。
10.如權(quán)利要求1至6中任一項所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其特征在于，APOE等位基因的核苷酸探針的大小介于16至25核苷酸，其熔點溫度為50°C至65°C。
11.如權(quán)利要求1至6中任一項所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其特征在于，第一SNP檢測區(qū)還包括一第五檢測線、一第六檢測線，以及第二 SNP檢測區(qū)更包括一第七檢測線、一第八檢測線。
12.如權(quán)利要求5所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其特征在于，第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線、第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針分別具有SEQ ID N0.3、SEQID N0.4、SEQ ID N0.7 及 SEQ ID N0.8 所示序列。
13.如權(quán)利要求11所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其特征在于，第一檢測區(qū)的第一檢測線、第二檢測線、第五檢測線、第六檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針是選自于SEQID N0.1至SEQ ID N0.4所示序列的核苷酸探針；而第二檢測區(qū)的第三檢測線、第四檢測線、第七檢測線、第八檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針是選自于SEQ ID N0.5至SEQ IDN0.8所示序列的核苷酸探針。
【文檔編號】C12M1/34GK203582863SQ201320811500
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月28日
【發(fā)明者】關(guān)淑君, 林詠翔, 施惠馨, 黃雪茵, 蔡岳穎 申請人:大江基因醫(yī)學(xué)股份有限公司