一種直接測定生物樣品中未經(jīng)分離的小核酸的方法及檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種直接測定生物樣品中未經(jīng)分離的小核酸的方法，包括如下步驟：（1）取生物樣品；（2）加Ploy?A到小核酸的3’端：3）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：加入帶一第一引物的寡聚dT及逆轉(zhuǎn)錄酶，生成帶寡聚T+和設(shè)計的第一引物尾的單鏈cDNA；（4）PCR放大定量小核酸：加入和小核酸序列完全互補或部分互補的第二引物，以及和第一引物完全互補或部分互補的第三引物，之后進(jìn)行PCR檢測定量小核酸的量。本發(fā)明無需分離生物樣品中的小核酸，而是直接利用生物樣品測定其小核酸（如siRNA、miRNA、反義核酸、aptamer)含量。
【專利說明】【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及定量分析生物樣品中的小核酸的方法 和試劑盒。 -種直接測定生物樣品中未經(jīng)分離的小核酸的方法及檢測 試劑盒 【背景技術(shù)】
[0002] 小核酸廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)，但目前亟需解決問題是：siRNA的 組織定量檢測是小核酸體內(nèi)分布及代謝動力學(xué)研究的瓶頸，而小核酸組織的分布和代謝的 部位是直接或間接地確定其小核酸及傳輸系統(tǒng)的效果及毒性的證據(jù)，所以亟需建立一種簡 便而準(zhǔn)確的siRNA定量檢測方法。但生物樣品中小核酸量的測定尚無較好的測定方法，尤 其是體內(nèi)樣品的定量分析。而體內(nèi)小核酸的定量是開發(fā)藥物的極其重要的手段。生物樣 品中小核酸的定量分析方法最為成熟、應(yīng)用最多的是非放射性同位素標(biāo)記定量分析方法包 括毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis, CE)和高效液相色譜法（High performance liquid chromatography, HPLC)。CE方法對于小核酸的檢測具有高分辨率、可分辨相差一個 核苷酸的小核酸，其在血漿基質(zhì)中對小核酸的最低定量限約在70μ g/L(約12nmol/L)水 平。HPLC方法的分辨率和靈敏度與CE方法相比略低。目前小核酸類藥物通常在較低劑量 下lmg/kg)給藥即能發(fā)揮藥效，這對定量分析方法學(xué)的靈敏度提出越來越高的要求。 而上述方法的靈敏度難以達(dá)到對小核酸在血漿和組織中藥代動力學(xué)終末消除相的定量能 力（濃度通常低于lOnmol/L)。此外，上述兩種主流分析方法還有一個共同的缺陷，即樣 品前處理過程相當(dāng)復(fù)雜，絕對回收率低，分析周期長、成本高，應(yīng)用受限。核酸分子雜交 的酶聯(lián)橋接（Enzyme-linked bridging assay, ELBA)法其檢測靈敏度也僅比上述方法稍高 一些，仍不能滿足對生物樣品中小核酸定量的精確要求.莖環(huán)法RT-qPCR技術(shù)已經(jīng)普遍應(yīng) 用，但是據(jù)我們及其他實驗室的驗證，實驗數(shù)據(jù)的一致性差、誤差大、很難達(dá)到符合RNAi藥 物申報的要求。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為克服【背景技術(shù)】的以上問題，本發(fā)明提供了一種直接測定生物樣品中未經(jīng)分離的 小核酸的方法及試劑盒
[0004] 本發(fā)明的試劑盒包括：
[0005] 1. Triton - X100 溶液；
[0006] 2.組織裂解液；
[0007] 3. Poly A聚合酶反應(yīng)液；
[0008] 4. Poly A 聚合酶；
[〇〇〇9] 5. Poly T+第一引物；
[〇〇1〇] 6.逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液；
[0011] 7.逆轉(zhuǎn)錄酶；
[0012] 8. PCR 反應(yīng)液；
[0013] 9. PCR 聚合酶；
[0014] 10. 3'端通用PCR引物，其和第一引物完全互補或部分互補；
[0015] 11.去 DNase 和 RNase 水；
[〇〇16] 本發(fā)明的一種直接測定生物樣品中未經(jīng)分離的小核酸的方法，包括如下步驟：
[0017] (1)分離生物樣品；
[0018] (2)加 Ploy A到小核酸的3'端：
[〇〇19] 如生物樣品為體液樣品，用含Triton-ΧΙΟΟ水稀釋，然后在稀釋液中加入聚合酶A 以及dATP，使生物樣品中的小核酸生成polyA尾；
[0020] 如生物樣品為組織樣品，則先用組織裂解液將組織勻漿，之后用含Triton-XlOO
[0021] 水稀釋組織勻漿液，然后在稀釋液中加入聚合酶A以及dATP，使生物樣品中的小 核酸生成polyA尾；
[0022] (3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：加入帶一第一引物的寡聚dT及逆轉(zhuǎn)錄酶，生成帶寡聚T+和設(shè)計 的第一引物尾的單鏈DNA ;
[0023] (4) PCR放大定量小核酸：在PCR反應(yīng)液中，加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的單鏈cDNA，力口 入和小核酸序列完全互補或部分互補的第二引物(小核酸特異引物)，以及和第一引物完全 互補或部分互補的第三引物（3'端引物)，之后進(jìn)行PCR檢測定量小核酸的量。
[0024] 在一較佳實施例中，步驟（2)中，含Triton-ΧΙΟΟ水稀釋體液的倍數(shù)范圍為3 倍-50倍。。
[0025] 在一較佳實施例中，步驟（2)中，組織中加入的組織裂解液體積比范圍為2倍-50 倍，含Triton-ΧΙΟΟ水稀釋組織勻漿液的倍數(shù)范圍為2倍-500倍，更佳可以為5倍-15倍。。
[0026] 在一較佳實施例中，poly-A的長度范圍為5個堿基-100個堿基，更佳可以為20個 堿基-50個堿基。
[0027] 在一較佳實施例中，第一引物的長度范圍為5個堿基-100個堿基，更佳可以為15 個堿基-27個堿基。
[0028] 在一較佳實施例中，第二引物的長度范圍為5個堿基-100個堿基，更佳可以為15 個堿基-27個堿基。
[0029] 在一較佳實施例中，第三引物的長度范圍為5個堿基-100個堿基，更佳可以為15 個堿基-27個堿基。
[0030] 在一較佳實施例中，步驟（2)反應(yīng)體系為：
[0031] 在一較佳實施例中，步驟（2)反應(yīng)體系為：
[0032] l-10ul稀釋后的血漿或組織勻漿，然后按下列順序分別加入：
[0033] 0· 4_2〇ul5X 反應(yīng)液
[0034] 0. 2-20ul25mM MnCl2
[0035] 0. 8-10ul ATP
[0036] 0· 04_5ul Poly A 聚合酶
[0037] 0· 3_7ul 水
[0038] 37 °C度溫育15分鐘。
[0039] 在一較佳實施例中，步驟（3)反應(yīng)體系為：
[0040] 0· 6-6. 25ul 緩沖液
[0041] 1· 8-18. 75ul 含寡聚 dT 的引物
[0042] 65°C孵育5分鐘，然后分別加入
[0043] 6-62. 5ul2X 反應(yīng)液
[0044] 1-12. 5ul 反轉(zhuǎn)錄酶
[0045] 50°C孵育5分鐘，85°C孵育5分鐘。
[0046] 在一較佳實施例中，步驟（4)反應(yīng)體系為：
[0047] 2_15ul 稀釋的 cDNA
[0048] l_25ul2X 反應(yīng)液
[0049] 0. 2-lul50X SYBR green
[0050] l-10ul PCR 引物（6uM)
[0051] l-10ul 水
[0052] 95 °C 15 分鐘，40 個循環(huán)：95 °C 15 秒，55 °C 30 秒，72 °C 30 秒。
[0053] 本發(fā)明提供了一種快速高靈敏及高效的檢測方法及其試劑盒，本發(fā)明方法無需分 離生物樣品中的小核酸，而是直接利用生物樣品測定其小核酸(如siRNA、miRNA、反義核酸、 aptamer)含量。本發(fā)明首先用聚合酶在小核酸的3'末端加上一段寡聚核酸，從而使小核酸 變得更長而能作為一個有效的PCR模板。延長的小核酸可以用一個特異的與5'端小核酸 本身互補的寡聚核酸作為引物，并用另一與3'延長段的寡聚核酸互補的另一核酸作為另一 引物來經(jīng)PCR擴(kuò)增而達(dá)到定量測定小核酸量的目的。該方法不但靈敏度高。數(shù)據(jù)的一致性 高，其數(shù)據(jù)可以用于GLP實驗室和RNAi藥物的定量及申報要求。
[0054] 使用本發(fā)明的小核酸定量試劑盒，用戶只需要根據(jù)自己的小核酸序列設(shè)計特異的 PCR引物即可。其優(yōu)點是無需從樣品中分離、純化，就能夠快速、準(zhǔn)確定量分析生物樣品中的 小核酸。該方法靈敏度高（可精確定量血漿中小核酸的量至l〇pg/ml，組織中小核酸的量 至10pg/g)，線性范圍寬，重復(fù)性好，可用于小核酸的生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0055] 圖1為本發(fā)明的原理圖；
[0056] 圖2為siRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線（用實施例1-5的方法）。A:含10%小鼠血漿的Triton X-100的水中有不同濃度的siRNA。B:含1%小鼠肝組織勻漿的Triton X-100的水有不同 濃度的siRNA。用A和B的樣品經(jīng)定量RT-PCR方法分析并建立siRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0057] 圖3為用定量RT-PCR測定肝組織或血漿中siRNA的量（用實施例1-5的方法）。 ⑶-1小鼠經(jīng)尾靜脈注射抗乙肝siRNA配方制劑（lmg/kg)，一組小鼠在給藥4小時后取血 并分離血漿，另一組動物在給藥24小時后取肝臟，其血漿用0. 25%Triton X-100的水稀釋 后用定量RT-PCR方法測定血漿中抗乙肝siRNA的量；肝臟組織在組織裂解液中勻漿并用 0. 25%Triton X-100的水稀釋后用定量RT-PCR方法測定血漿中抗乙肝siRNA。 【具體實施方式】
[0058] 定義
[0059] 本發(fā)明中所用技術(shù)術(shù)語的定義應(yīng)理解為包括這些術(shù)語和在本領(lǐng)域中的技術(shù)人員 已知的那些技術(shù)名詞。并不限于本發(fā)明的范圍。并不需要重復(fù)每一次的申明。
[0060] 本文中使用的術(shù)語"一"，"一個"和類似的術(shù)語在描述本發(fā)明，并在權(quán)利要求中，將 被解釋為包括單數(shù)和復(fù)數(shù)。術(shù)語"包括";"具有";和"含有"將被解釋為開放式術(shù)語。它們 的意思是，例如"包括，但不限于"。
[0061] 應(yīng)用的或設(shè)定值的范圍是指在此范圍內(nèi)的每個單獨的值，應(yīng)等同于任何單獨值的 描述。這里所采用的具體值，將被理解為示例性，而不是限于本發(fā)明的范圍。
[0062] 如本文所用的術(shù)語小核酸是指單鏈或雙鏈小于500堿基或堿基對的脫氧核糖核 酸或核糖核酸包括但不限于siRNA, antisense, miRNA, aptamer.
[0063] 如本文所用的術(shù)語小干擾核酸（siRNA)是指具有彼此互補鏈的核酸雙鏈。當(dāng)進(jìn)入 RISC復(fù)合物后，誘導(dǎo)RNA酶降RNA的RNAi (RNA interference)機(jī)制。此外，siRNA通過啟 動子的RNAa機(jī)制，調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的增高表達(dá)。一般來說，siRNA的每一條核苷酸鏈主要是 核糖核酸(核糖核苷酸)，但也可以是RNA的類似物，RNA和RNA的類似物，經(jīng)修飾的核苷酸， RNA和DNA，RNA的類似物和DNA，非核苷酸，或一個鏈完全是DNA，另一個鏈?zhǔn)荝NA，只要是 能通過RNAi機(jī)制誘導(dǎo)同源RNA降解，均可作為iNA的構(gòu)造。
[0064] 在遺傳學(xué)上，微分子RNA (microiRNA，miRNA)是單鏈RNA，長度約21-23個核苷酸， 調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miRNA是從DNA轉(zhuǎn)錄的，但沒有翻譯成蛋白質(zhì)(非編碼RNA)，它們是由被稱 為初級轉(zhuǎn)錄的PRi-miRNA的短莖環(huán)結(jié)構(gòu)而生成pre-miRNA，最后從pre-miRNA生成miRNA。 成熟miRNA分子部分互補于一個或多個的信使RNA分子，它們的主要功能是降低基因的表 達(dá)。
[0065] siRNA分子修飾的核苷酸可以在任何鏈。例如，經(jīng)修飾的核苷酸，可以有一 個Northern的構(gòu)象（例如，Northern pseudorotation周期，見Sanger，核酸結(jié)構(gòu)的原 理，Springer-Verlag ed·，1984)。核苷酸具有Northern配置的實例包括鎖核酸（Lock nucleic acid，LNA)的核苷酸(如2'-0,4'-C-亞甲基-(D-呋喃核糖基）核苷酸)，（2'-0 ，4' -C-methylene-(D-ribofuranosyl)nucleotides)，2' -甲氧基乙氧基（Μ0Ε)核苷酸 (2, -methoxyethoxy (Μ0Ε) nucleotides, )，2' -甲基-硫代-乙基，2' -脫氧 _2' -氟核苷 酸（2, -methyl-thio-ethyl, 2, -deoxy-2, -fluoro nucleotides)，2,-脫氧 _2,-氯核苷 酸（2, -deoxy-2, -chloro nucleotides)，2,-疊氮基的核苷酸（2, -azido nucleotides)， 2'-0-甲基核苷酸（2'-0-methyl nucleotides)。同時保持誘導(dǎo)RNAi的能力和可以抵抗核 酸酶降解的化學(xué)修飾的核苷酸。
[0066] 在一些實施例中，siRNA分子包括正義和反義序列或區(qū)段，其特征在于正義和反義 區(qū)的核苷酸或非核苷酸以共價鍵連接，或通過非共價、離子性相互作用、氫鍵、范德華相互 作用，疏水相互作用和/或堆積（stacking)相互作用。
[〇〇67] siRNAs可以由兩個單獨的寡核苷酸組裝成一個雙鏈，其中一條鏈?zhǔn)钦x鏈和另一 個是反義鏈，其中，所述的反義和正義鏈自身互補（即每一條鏈所含的堿基的核苷酸序列與 另一條鏈的序列相補，如其中的反義鏈和有義鏈形成了一個雙相或雙鏈結(jié)構(gòu))。反義鏈的堿 基序列可與一個靶核酸分子或其部分的核苷酸序列互補，有義鏈的核苷酸序列可于靶核酸 序列或其一部分相同。siRNA可以從單一的寡聚核苷酸而來，其中雙向siRNA的自身互補的 正義和反義區(qū)域可由核酸的堿基或非核酸的基團(tuán)連接。
[0068] "反義核酸"，是指非酶的核酸分子，結(jié)合到靶RNA的RNA、DNA或PNA (蛋白質(zhì)核酸， 見Egholmetal·，1993Nature365,566)的分子，并改變了革ERNA的活性(見論述：Steinand Cheng, 1993Science261, 1004and Woolf et al.，U. S. Pat. No. 5, 849, 902)。通常情況下，反 義序列是一單一的連續(xù)與靶序列完全互補的序列。然而，在某些實施例中，反義分子可以結(jié) 合到底物，使得靶核酸分子形成了一個環(huán)和/或結(jié)合的反義分子本身形成一個環(huán)。因此，反 義分子可以與兩個(或甚至更多）非連續(xù)的底物（RNA)的區(qū)段序列互補、反義分子非連續(xù)區(qū) 段序列的部分，可以互補于靶序列的兩個區(qū)段。此外，反義DNA可以用于靶基因 RNA，通過 DNA-RNA的相互作用，激活RNA酶H，降解靶RNA。反義寡核苷酸可以包括一個或多個RNA酶 Η的激活區(qū)，能夠激活RNA酶H，裂解靶RNA。反義DNA可以化學(xué)合成，或者，也可以通過使用 的單鏈DNA的表達(dá)載體或等表達(dá)。"反義RNA"具有互補靶基因 RNA序列，通過結(jié)合到靶基 因 RNA可以誘導(dǎo)RNA干擾。反義RNA具有結(jié)合靶基因 RNA的互補序列，通過結(jié)合到靶基因 的RNA誘導(dǎo)RNA干擾。正義核糖核酸"具有互補反義RNA的序列，與其互補的反義RNA退火 形成siRNA。這些反義和正義RNA可以化學(xué)合成。
[0069] "核酸"是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，它們的聚合物可是單鏈或雙鏈形式。 該術(shù)語包括含由已知的核苷酸類似物或修飾骨架殘基或聯(lián)接子的核酸，可以化學(xué)合成，天 然存在，非天然存在，具有相似的作為基準(zhǔn)的核酸結(jié)合特性，以及類似方式被代謝。這種類 似物的實例包括，但不限于，硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，甲基膦酸，手性甲基膦酸鹽，2'-0-甲 基核糖核苷酸，肽核酸(肽核酸，PNAs)。
[0070] 所謂"RNA"是指包含至少一個核糖核苷酸殘基的分子。"核糖核苷酸"是指核苷酸 的β D-核糖呋喃糖部分的2'位是一個羥基基團(tuán)。這一術(shù)語包括雙鏈RNA，單鏈RNA，分離 的RNA(例如部分純化的RNA)，基本上純的RNA，合成RNA，重組產(chǎn)生的RNA，以及從天然存在 的RNA通過添加，缺失，取代不同和/或改變一個或多個核苷酸改變的RNA。這樣的改變可 包括添加非核苷酸材料到siRNA的末端或內(nèi)部。例如，一個或多個核苷酸。發(fā)明中的RNA 分子中的核苷酸還可以包括非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化學(xué)合成的核苷酸 或脫氧核苷酸。這些改變的RNA可稱為天然存在的RNA的類似物。如本文所用，術(shù)語"核糖 核酸"和"RNA"指含有至少一個核糖核苷酸殘基的分子。核糖核苷酸是含有β-D-核呋喃 糖基部分的2'位的羥基核苷酸。這些術(shù)語包括雙鏈RNA，單鏈RNA，分離的RNA (例如部分 純化的RNA)，基本上純的RNA，合成RNA，重組產(chǎn)生的RNA，以及不同于天然存在的RNA通過 添加，缺失RNA修飾和改變，替代，修改和/或改變一個或多個核苷酸。RNA的改變可包括添 加非核苷酸到siRNA的末端或內(nèi)部。例如RNA分子中的核苷酸包括一個或多個非標(biāo)準(zhǔn)核苷 酸，例如，非天然存在的核苷酸或化學(xué)合成的核苷酸或脫氧核苷酸。這些改變的RNA可稱為 類似物。
[0071] 本文所用的"核苷酸"在本領(lǐng)域中所承認(rèn)的，包括天然的堿(標(biāo)準(zhǔn)）基，并在本 領(lǐng)域中公知的經(jīng)修飾的堿基。這類堿基一般位于核苷酸糖Γ的位置。核苷酸一般包括 堿，糖和磷酸基團(tuán)。核苷酸可以在糖，磷酸鹽和/或堿基部分修飾（也可簡稱為可互換的 核苷酸類似物，經(jīng)修飾的核苷酸，非天然核苷酸，其他未修飾或修飾的非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸。參 見,Usman and McSwiggen, supra;Eckstein,et al. , International PCT Publication No. W092/07065;Usman, et al, International PCT Publication No. W093/15187;Uhlma n&Peyman, supra,所有在此引入本文作為參考)。核酸研究作為總結(jié)可參考Limbach, et al, Nucleic Acids Res. 22:2183,1994。一些非限制性實施例可以被引入到核酸分子的修 飾基團(tuán)包括，次黃嘌呤核苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、pseudouracil、2, 4, 6-三 甲氧基苯、3 -甲基尿啼陡、dihydrouridine、萘基、氨基苯基、5-alkylcytidines (例如， 5-甲基胞苷）、5_alkyluridines (例如，ribothymidine)、5-halouridine (例如，5-溴尿 苷）或6-azapyrimidines或6-alkylpyrimidines (例如6-甲基尿苷)、丙炔和其它基團(tuán) (Burgin, et al.，Biochemistry35:14090, 1996; Uhlman&Peyman, supra)。在這方面的所謂 "經(jīng)修飾的堿基"是指在Γ的位置腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶核苷酸堿基以外的或等 同物。
[0072] 堿基互補的核苷酸堿基是指彼形成氫鍵的堿基互補。腺嘌呤（Α)與胸腺嘧啶（Τ) 或RNA中的尿嘧啶（U)，鳥嘌呤（G)與胞嘧啶（C)。核酸的互補鏈段或鏈(加入通過氫鍵）彼 此互補。"互補"是指核酸可以與另一核酸序列形成氫鍵，可以通過傳統(tǒng)的Watson-Crick的 或由其他非傳統(tǒng)鍵結(jié)合。
[0073] siRNA可以通過化學(xué)合成或生物生產(chǎn)。化學(xué)合成的方法，可以在Nucleic Acids Research, 624-627, 1999and Nucleic Acids Research, 3547-3553, 1955分別找到。分子克 隆技術(shù)可以用于生物生產(chǎn)。
[0074] 如本文所用的術(shù)語小干擾RNA (siRNA)有時也被稱為短干擾RNA或沉默RNA，是用 來指雙鏈RNA分子具有16-60個核苷酸的長度，可以發(fā)揮多種生物學(xué)作用。最值得注意的 是，siRNA通過RNA干擾途徑，能干擾一個特定的基因表達(dá)。
[0075] 如本文所用，術(shù)語RNAa指的雙鏈RNA激活基因表達(dá)的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象被稱為"小 RNA介導(dǎo)的基因激活"或RNAa。雙鏈RNA靶向性基因的啟動子，誘導(dǎo)強(qiáng)有力的基因轉(zhuǎn)錄。最 近，RNAa已經(jīng)在幾個其他哺乳動物，包括非人靈長類，小鼠，大鼠被證明。
[0076] 本文所用術(shù)語"RNA干擾是指的依賴RNA的基因沉默的過程，是在細(xì)胞中由雙鏈 RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，在那里它們與催化RISC的催化單位ARG0NAUTE結(jié)合。當(dāng)雙鏈RNA 或RNA-類似siRNA或siRNA是外生的(來自感染了病毒的RNA基因組或從轉(zhuǎn)染的siRNA或 siRNA)，RNA或siRNA被直接導(dǎo)入到細(xì)胞質(zhì)，由Dicer酶切割成短的片段。產(chǎn)生的dsRNA可 以是內(nèi)源性的(源于細(xì)胞）如前的microRNA從RNA編碼基因的基因組中表達(dá)?；虻某跫?轉(zhuǎn)錄物首先被處理，以在細(xì)胞核中形成的特征的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA，然后將其導(dǎo)出到 細(xì)胞質(zhì)中，由Dicer切割。因此，有兩個dsRNA的途徑，外源性和內(nèi)源性。RNA-誘導(dǎo)的沉默 復(fù)合物（RISC)的活性成分，核酸內(nèi)切酶被稱為Argonaute蛋白。
[0077] 實施例1 :PCSK9siRNA及脂質(zhì)體包裹
[0078] siRNA 序列：
[0079] 反義鏈：5' UCCGAAUAAACUCCAGGCCUA3'
[0080] 正義鏈：5' UAGGCCUGGAGUUUAUUCGGA3'
[0081] 按照供應(yīng)商（上海百代(上海）生物科技有限公司）提供的體內(nèi)siRNA脂質(zhì)體傳輸 系統(tǒng)的方法，將siRNA包裹，包裹后的雙鏈siRNA懸浮液經(jīng)過測定，包裹率大于85%以上。
[0082] 實施例2:含小核酸血漿及組織的處理
[0083] 體內(nèi)實驗動物的研究使用的所有程序是機(jī)構(gòu)動物管理和使用委員會（IACUC)批準(zhǔn) 的，并按照當(dāng)政府法規(guī)進(jìn)行。CD1小鼠，通過尾靜脈注射0. 2毫升注射，lmg/公斤siRNA的 配方。24小時后，取血，分離血漿，用含0. 25%Triton X-100的水稀釋血漿：2微升血漿加至 18微升含0. 25%Triton X-100的水稀釋后直接用于定量RT-PCR或定量PCR測定血漿中小 核酸的量（圖1，2)。組織的處理：從注射小核酸的動物體內(nèi)取100-500mg組織樣品。組織 樣品如心、肝、脾、肺、腎等，用組織裂解液（Qiagen:RLN或LifeteCh:AM8540G)按每毫升裂 解液100毫克組織，用高速組織勻漿機(jī)將組織勻漿，然后取出2微升組織勻漿液加入198微 升含0. 25%Triton-xl00水，均勻稀釋后即可定量RT-PCR或定量PCR來測定其中的小核酸 的量（圖3)。
[0084] 實施例3 :加 Ploy A到小核酸的3'端
[0085] 如要分析實施例2的樣品中的小核酸是核糖核酸(如siRNA、miRNA)，則用Poly A 聚合酶在小核酸的3'末端加上一段Poly A。方法如下：
[0086] 1. 25ul稀釋后的血漿或組織勻漿，然后按下列順序分別加入：
[0087] 0· 5ul5X 反應(yīng)液
[0088] 0. 25ul25mM MgCl2
[0089] 0. lul ATP
[0090] 0· 05ul Poly A 聚合酶
[0091] 0.35ul 水
[0092] 37 °C溫育 15 分鐘。
[0093] 其產(chǎn)物應(yīng)為：5' TCCGAATAAACTCCAGGCCTAAAAAAAAAAAAAA......3'
[0094] 實施例4 :逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的原理及反應(yīng)條件
[0095] 將方案實施例3中已在3'末端加了 Poly A的小核酸，加入如下與帶一引物的寡 聚dT
[0096] TTTTTTTTTTTTGAACCTAGCTGGCCAA，與帶有 Poly A 的小核酸互補結(jié)合，如下：
[0097] 5, UCCGAAUAAACUCCAGGCCUA AAAAAAAAAAAAA......3，
[0098] TTTTTTTTTTTTTTTTTGAACCTAGCTGGCCAA
[0099] 在實施例3中已完成的反應(yīng)中加入下列試劑：
[0100] 0· 625ul 反應(yīng)液
[0101] 1. 875ul含寡聚dT的引物
[0102] 65度孵育5分鐘。然后分別加入
[0103] 6.25ul2X 反應(yīng)液
[0104] 1. 25ul反轉(zhuǎn)錄酶
[0105] 50°C孵育5分鐘，85度孵育5分鐘，合成cDNA
[0106] 實施例5 :PCR放大定量小核酸
[0107] 將方案實施例4中已合成的cDNA稀釋加入5'和3'引物： 5' TCCGAATAAACTCCAGGCCTA3' 和 5' AACCGGTCGATCCAA3,并按下列的每管的量，用 API7500 熒光定量PCR儀，定量PCR擴(kuò)增來測定組織樣品中小核酸的量。
[0108] 6ul稀釋的cDNA (方案實施例4)
[0109] 10ul2X 反應(yīng)液
[0110] 0. 4ul50X SYBR green
[0111] 1. 5ul PCR 引物（6uM)
[0112] 2. lul 水
[0113] 95°C 15分鐘，40個循環(huán)：95度15秒，55度30秒，72度30秒。小核酸的定量方法 用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量血液及組織中量。
【權(quán)利要求】
1. 一種用定量RT-PCR或定量PCR直接測定生物樣品中未經(jīng)分離的小核酸的試劑盒，其 特征在于，包括 ： (1) · Triton - X100 溶液； (2) .組織裂解液； (3) . Poly A聚合酶反應(yīng)液； (4) · PolyA 聚合酶； (5) .Poly T+第一引物； (6) .逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液； (7) .逆轉(zhuǎn)錄酶； (8) .PCR反應(yīng)液； (9) .PCR聚合酶； (10) . 3'端通用PCR引物，其和第一引物完全互補或部分互補； (11) ·去 DNase 和 RNase 水；
2. -種直接測定生物樣品中未經(jīng)分離的小核酸的方法，包括如下步驟： (1) 取生物樣品； (2) 加 Poly A到小核酸的3'端： 如生物樣品為體液樣品，用含Triton-ΧΙΟΟ水稀釋，然后在稀釋液中加入聚合酶A以及 ATP，使生物樣品中的小核酸生成poly A尾； 如生物樣品為組織樣品，則先用組織裂解液將組織勻漿，之后用含Triton-ΧΙΟΟ水稀 釋組織勻漿液，然后在稀釋液中加入聚合酶A以及ATP，使生物樣品中的小核酸生成poly A 尾； (3) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入帶一第一引物的寡聚dT及逆轉(zhuǎn)錄酶，生成帶寡 聚T+和設(shè)計的第一引物尾的單鏈cDNA ; (4) PCR放大定量小核酸：在PCR反應(yīng)液中，加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的單鏈cDNA，加入和 小核酸序列完全互補或部分互補的第二引物，以及和第一引物完全互補或部分互補的第三 引物，之后進(jìn)行PCR檢測定量小核酸的量。
3. 如權(quán)利要求2所述的一種直接測定生物樣品中未經(jīng)分離的小核酸的方法，其特征在 于：步驟（2)中，含Triton-ΧΙΟΟ水稀釋體液的倍數(shù)范圍為3倍-50倍；組織中加入的組織裂 解液體積比范圍為2倍-50倍，含Triton-ΧΙΟΟ水稀釋組織勻漿液的倍數(shù)范圍為2倍-500 倍。
4. 如權(quán)利要求2所述的一種直接測定生物樣品中未經(jīng)分離的小核酸的方法，其特征在 于：poly-A的長度范圍為5個堿基-100個堿基，更佳為20個堿基-50個堿基。
5. 如權(quán)利要求2所述的一種直接測定生物樣品中未經(jīng)分離的小核酸的方法，其特征在 于：第一引物的長度范圍為5個堿基-100個堿基，更佳為15個堿基-27個堿基。
6. 如權(quán)利要求2所述的一種直接測定生物樣品中未經(jīng)分離的小核酸的方法，其特征在 于：第二引物的長度范圍為5個堿基-100個堿基，更佳為15個堿基-27個堿基。
7. 如權(quán)利要求2所述的一種直接測定生物樣品中未經(jīng)分離的小核酸的方法，其特征在 于：第三引物的長度范圍為5個堿基-100個堿基，更佳為15個堿基-27個堿基。
8. 如權(quán)利要求2所述的一種直接測定生物樣品中未經(jīng)分離的小核酸的方法，其特征在 于：步驟（2)反應(yīng)體系為： Ι-lOul稀釋后的血漿或組織勻漿，然后按下列順序分別加入： 0. 4-20ul5X 反應(yīng)液 0. 2-20ul25mM MnCl2 0.8-10ul ATP 0· 04_5ul Poly A 聚合酶 0·3-7ul 水 37 °C度溫育15分鐘。
9. 如權(quán)利要求2所述的一種直接測定生物樣品中未經(jīng)分離的小核酸的方法，其特征在 于：步驟（3)反應(yīng)體系為： 0. 6-6. 25ul 緩沖液 1.8-18. 75ul含寡聚dT的引物 65°C孵育5分鐘，然后分別加入 6-62. 5ul2X 反應(yīng)液 1- 12. 5ul反轉(zhuǎn)錄酶 50°C孵育5分鐘，85°C孵育5分鐘。
10. 如權(quán)利要求2所述的一種直接測定生物樣品中未經(jīng)分離的小核酸的方法，其特征 在于：步驟（4)反應(yīng)體系為： 2- 15ul 稀釋的 cDNA l-25ul2X反應(yīng)液 0. 2-lul50X SYBR green l-10ul PCR 引物 l-10ul 水 95°C 15 分鐘，40 個循環(huán)：95°C 15 秒，55°C 30 秒，72°C 30 秒。
【文檔編號】C12Q1/68GK104109708SQ201310754613
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】梁東, 崔坤元, 陳波 申請人:廈門成坤生物技術(shù)有限公司