秈稻開(kāi)花期耐冷主效qtl位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，具體步驟為：秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法具體步驟如下：利用分子標(biāo)記RM25678的引物對(duì)、分子標(biāo)記RM6745的引物對(duì)、分子標(biāo)記RM25681的引物對(duì)中一對(duì)或多對(duì)引物，對(duì)待鑒定水稻材料的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，如擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)大小的DNA片段，則標(biāo)志著耐冷主效QTL?qCTF-10存在。本發(fā)明還提供所述的秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法在選育耐冷水稻品種中的應(yīng)用。本發(fā)明采用QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，有利于推動(dòng)耐冷水稻品種選育。
【專利說(shuō)明】秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻對(duì)溫度最敏感的時(shí)期為孕穗期至抽穗揚(yáng)花期，此時(shí)期如遇日平均氣溫低于20°C、日最高氣溫低于23°C的低溫或“寒露風(fēng)”，開(kāi)花就會(huì)減少，或雖開(kāi)花而不授粉，形成空殼，從而降低產(chǎn)量。南方秈稻區(qū)的一季晚稻或雙季晚稻主要是由于抽穗開(kāi)花期遭遇低溫造成結(jié)實(shí)率大幅度下降而減產(chǎn)，如2001年9月5日至9月7日，湖南岳陽(yáng)的日平均氣溫僅為19.90C >19.2°C、21.4°C，導(dǎo)致正處抽穗開(kāi)花期的岳優(yōu)63較正常年份減產(chǎn)24.9% ; 1997年9月14日至10月I日湖南常德連續(xù)18d日平均氣溫低于22°C，導(dǎo)致處于抽穗開(kāi)花灌漿期的金優(yōu)198結(jié)實(shí)率比正常年降低15.2%,減產(chǎn)11.2%。我國(guó)江南紅黃壤丘陵區(qū)因寒露風(fēng)造成秈稻減產(chǎn)較重年份的概率為60%，嚴(yán)重年份概率為11.4%。2000~2007年長(zhǎng)江以南的江西、浙江和湖南大部分地區(qū)晚稻抽穗至灌漿期極端低溫天氣持續(xù)的時(shí)間有小幅度增加。因此，低溫冷害已成為限制水稻生產(chǎn)的主要因素之一，如何快速、準(zhǔn)確選育耐冷的水稻品種是育種家長(zhǎng)期追求的目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，具體步驟如下:
[0004]利用分子標(biāo)記RM25678的引物對(duì)、分子標(biāo)記RM6745的引物對(duì)、分子標(biāo)記RM25681的引物對(duì)中一對(duì)或多對(duì)引物，對(duì)待鑒定水稻材料的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，如擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)大小的DNA片段，則標(biāo)志著耐冷主效QTL qCTF-ΙΟ存在。
[0005]其中，所述分子標(biāo)記RM25678的引物對(duì)，對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，電泳能檢測(cè)到與水稻品種996相同位置的條帶。
[0006]其中，所述分子標(biāo)記RM25678的引物對(duì)，其為:
[0007]上游引物5’ -GCTCGGGCTGCTATTATTGATGC-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)
[0008]下游引物5’ -GCCAACTCAAGAACAAAGCTGAATGG-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0009]其中，所述分子標(biāo)記RM6745的引物對(duì)，對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，電泳能檢測(cè)到與水稻品種996相同位置的條帶。
[0010]其中，所述分子標(biāo)記RM6745的引物對(duì)，其為:
[0011]上游引物5’ -GAAGCCTCCTTGATGTTGACTGG-3’(如 SEQ ID N0.3 所示)
[0012]下游引物5’ -CAACGATTATGCGTCCTTAGATGC-3’(如 SEQ ID N0.4 所示)。
[0013]其中，所述分子標(biāo)記RM25681的引物對(duì)，對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，電泳能檢測(cè)到與水稻品種996相同位置的條帶。
[0014]其中，所述分子標(biāo)記RM25681的引物對(duì)，其為:
[0015]上游引物5’ -AGCCGCTACTTCTACTACCACAGC-3’(如 SEQ ID N0.5 所示)[0016]下游引物5’ -TCGTCGTCTTCTGGTACATCAGG-3’(如 SEQ ID N0.6 所示)。
[0017]其中，所述PCR的反應(yīng)體系如下:
[0018]
引物(2μιηο1/υ0.7uL dNTP(2.5 mniol/L)0.2uL DNA 模板1.0uL TaqDNA 聚合酶(5U/pL)0.1 ul
[0019]
10 X PCR 緩沖液(含 Mg2 )1.0uL
[0020]反應(yīng)體系用ddH20補(bǔ)足到總體積10 μ I。
[0021]其中，PCR反應(yīng)條件為:941:變性51^11，941: 30s, 55°C 30s，72°C 60s，擴(kuò)增 35 個(gè)循環(huán)，最后72°C終延伸7min。
[0022]本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供所述的秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法在選育耐冷水稻品種中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明采用QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，本方法是應(yīng)用篩選到的與在耐冷水稻品種996第十染色體上定位到的開(kāi)花期耐冷主效QTLqCTF-1O緊密連鎖的3個(gè)分子標(biāo)記，預(yù)測(cè)水稻材料的開(kāi)花期耐冷性，加快耐冷水稻品種的選擇進(jìn)度。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1水稻品種996開(kāi)花期耐冷主效QTLqCTF-1O在第10染色體的定位。垂直線表示水稻第10染色體，右邊的水平短線表示染色體上的分子標(biāo)記，左邊的水平短線表示標(biāo)記間的遺傳距離(CM)。耐冷主效QTL qCTF-ΙΟ定位于RM6745和RM25681之間0.9cM的區(qū)域。
[0025]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中SSR引物RM6745在親本及996/4628F8群體中擴(kuò)增產(chǎn)生的電泳圖。其中:M為DNA marker標(biāo)記、I為耐冷水稻品種996、2為水稻品種4628、3~31為996/4628F8群體不同株系。
[0026]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中SSR引物RM25681在親本及996/4628F8群體中擴(kuò)增產(chǎn)生的電泳圖。其中:M為DNA marker標(biāo)記、I為水稻品種4628、2為耐冷水稻品種996、3-22為996/4628F8群體不同株系。
[0027]圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中SSR引物RM25678在親本及996/4628?8群體中擴(kuò)增產(chǎn)生的電泳圖。其中:M為DNA marker標(biāo)記、1-35為996/4628F8不同株系，36為水稻品種4628、37為耐冷水稻品種996。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。平均結(jié)實(shí)率計(jì)算方法與其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作參見(jiàn):Quantitative trait loci associated with seed set under high temperature stressat the flowering stage in rice(Oryza sativa L.),Yinghui Xiao等，2011,Euphytica。
[0029]實(shí)施例1
[0030]供試材料
[0031]本實(shí)施例的供試材料為:以開(kāi)花期耐冷的秈稻品種996為母本，以冷敏感水稻品種4628為父本雜交，以一粒傳法構(gòu)建了含286個(gè)株系的996X4628RILs F8和Fltl群體。
[0032]表現(xiàn)型鑒定
[0033]2010年、2011年分別 于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地種植996、4628及996X4628RILsF8 (2010年)、Fltl (2011年)群體286個(gè)株系，分3期播種，分別于2010年、2011年的4月19日、5月I日、5月13日播種，每期隔12天，于2010年、2011年的5月14日、5月26日、6月7日移栽，單本植，每期每個(gè)材料各種植50株，每期每個(gè)材料于水稻抽穗前20d左右選生育期一致的3株移入盆缽中。
[0034]在每缽至少有3個(gè)分蘗穗抽出劍葉Icm左右的時(shí)候?qū)⒉牧戏謩e移入人工氣候室進(jìn)行適溫[24 V (06:00-8:00 ； 19:00-23:00) /26 V (08:00-10:00 ； 16:00-19:00)/30 0C (10:00-16:00) /22 0C (23:00-06:00)]和低溫[19 O (06:00-8:00 ； 19:00-23:00)/210C (08:00-10:00 ; 16:00-19:00)/23 (10:00-16:00) /17 °C (23:00-06:00)]處理，光照強(qiáng)度為290001x，每天照光14小時(shí)，相對(duì)濕度為70-75%。標(biāo)記同時(shí)抽穗的稻穗，其中996X4628RILS群體只選擇生育期相近的234個(gè)株系進(jìn)行適溫或低溫處理；連續(xù)處理7d后，將處理材料移到室外讓其自然生長(zhǎng)。
[0035]成熟后考查標(biāo)記穗的平均結(jié)實(shí)率，計(jì)算結(jié)實(shí)率下降值、低溫敏感指數(shù)。
[0036]結(jié)實(shí)率下降值為適溫處理下的結(jié)實(shí)率減去低溫處理下的結(jié)實(shí)率；低溫敏感指數(shù)=結(jié)實(shí)率下降值+適溫處理結(jié)實(shí)率X 100%。
[0037]遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建
[0038]選取在水稻12條染色體上均勻分布，覆蓋全基因組的848對(duì)SSR引物和66對(duì)SFP引物對(duì)耐冷水稻品種996和冷敏感水稻品種4628兩個(gè)親本材料間進(jìn)行多態(tài)性篩選。其中174對(duì)引物在兩親本間表現(xiàn)出多態(tài)，多態(tài)性引物的比例為19.04%,因?yàn)閮捎H本996和4628均為秈稻，親緣關(guān)系較近，因此兩親本間多態(tài)性引物的比例較低，且第3、7、8染色體上的引物的多態(tài)性較低。
[0039]選取兩親本間多態(tài)明顯的149對(duì)共顯性SSR標(biāo)記或SFP標(biāo)記，用含有286個(gè)株系的996X4628RIL F8群體構(gòu)建全基因組12條染色體的分子連鎖圖譜。該連鎖圖的總長(zhǎng)度為1910.8CM，標(biāo)記間平均距離為12.82CM，標(biāo)記較均勻地分布在12條染色體上。
[0040]開(kāi)花期耐冷QTL的定位
[0041]通過(guò)Windows QTL Cartographer 2.5定位軟件進(jìn)行復(fù)合區(qū)間作圖，以低溫處理下結(jié)實(shí)率、結(jié)實(shí)率下降值和低溫敏感指數(shù)3個(gè)指標(biāo)作為996X4628RILF8群體耐冷性表型指標(biāo)，分別進(jìn)行 QTL 分析(具體方法參見(jiàn):Quantitative trait loci associated with seedset under high temperature stress at the flowering stage in rice (Oryza sativaL.)，Yinghui Xiao 等，2011，Euphytica。)，均在染色體 10 上 RM184 ~RM6745 區(qū)間檢測(cè)到主效的qCTF-10，其中以低溫處理下結(jié)實(shí)率為耐冷性表型指標(biāo)檢測(cè)到的，其LOD值為16.92，表型解釋率為28.87%，加性效應(yīng)為-9.18 ;以結(jié)實(shí)率下降值為耐冷性表型指標(biāo)檢測(cè)到的，其LOD值為15.59，表型解釋率為30.37%，加性效應(yīng)為8.83 ;以低溫敏感指數(shù)為耐冷性表型指標(biāo)檢測(cè)到的，其LOD值為17.04，表型解釋率為28.30%，加性效應(yīng)為12.07，加性效應(yīng)來(lái)自耐冷親本996的等位基因。構(gòu)建的水稻第10條染色體圖譜及耐冷主效QTL qCTF-ΙΟ的位置示意圖見(jiàn)圖1，部分電泳圖見(jiàn)圖2-4。
[0042]為精細(xì)定位這個(gè)區(qū)段的主效QTL，在這個(gè)區(qū)段又篩選到4個(gè)兩親本間有多態(tài)的SSR標(biāo)記 RM1375、RM6100、RM25678、RM25681，用以加密此區(qū)段的標(biāo)記數(shù)。以 996X4628RIL F10群體的低溫處理下結(jié)實(shí)率、結(jié)實(shí)率下降值和低溫敏感指數(shù)3個(gè)指標(biāo)為耐冷性表型指標(biāo)對(duì)qCTF-ΙΟ進(jìn)行進(jìn)一步定位，將其定位于SSR標(biāo)記RM6745與RM25681間，這兩個(gè)標(biāo)記間的遺傳距離為0.9CM。其中以低溫處理下結(jié)實(shí)率為耐冷性表型指標(biāo)檢測(cè)到的，其LOD值為16.97，表型解釋率為29.70%，加性效應(yīng)為-9.12 ;以結(jié)實(shí)率下降值為耐冷性表型指標(biāo)檢測(cè)到的，其LOD值為15.70，表型解釋率為24.55%，加性效應(yīng)為7.75 ;以低溫敏感指數(shù)為耐冷性表型指標(biāo)檢測(cè)到的，其LOD值為18.69，表型解釋率為29.38%，加性效應(yīng)為12.08，加性效應(yīng)來(lái)自耐冷親本996的等位基因。運(yùn)用RM25678、RM6745、RM25681等可對(duì)該主效QTL進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇。
[0043]本實(shí)施例PCR的反應(yīng)體系為:
[0044]
【權(quán)利要求】
1.秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，其特征在于，具體步驟如下: 利用分子標(biāo)記RM25678的引物對(duì)、分子標(biāo)記RM6745的引物對(duì)、分子標(biāo)記RM25681的引物對(duì)中一對(duì)或多對(duì)引物，對(duì)待鑒定水稻材料的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，如擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)大小的DNA片段，則標(biāo)志著耐冷主效QTL qCTF-ΙΟ存在。
2.如權(quán)利要求1所述的秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，其特征在于，所述分子標(biāo)記RM25678的引物對(duì)，對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，電泳能檢測(cè)到與水稻品種996相同位置的條帶。
3.如權(quán)利要求2所述的秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，其特征在于，所述分子標(biāo)記RM25678的引物對(duì)，其為: 上游引物 5，-GCTCGGGCTGCTATTATTGATGC-3，(如 SEQ ID N0.1 所示) 下游引物 5’ -GCCAACTCAAGAACAAAGCTGAATGG-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)。
4.如權(quán)利要求1所述的秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，其特征在于，所述分子標(biāo)記RM6745的引物對(duì)，對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，電泳能檢測(cè)到與水稻品種996相同位置的條帶。
5.如權(quán)利要求4所述的秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，其特征在于，所述分子標(biāo)記RM6745的引物對(duì)，其為: 上游引物 5’ -GAAGCCTCCTTGATGTTGACTGG-3’(如 SEQ ID N0.3 所示)
下游引物 5’-CAACGATTATGCGTCCTTAGATGC-3’(如 SEQ ID N0.4 所示)。
6.如權(quán)利要求1所述的秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，其特征在于，所述分子標(biāo)記RM25681的引物對(duì)，對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，電泳能檢測(cè)到與水稻品種996相同位置的條帶。
7.如權(quán)利要求6所述的秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，其特征在于，所述分子標(biāo)記RM25681的引物對(duì)，其為: 上游引物 5’ -AGCCGCTACTTCTACTACCACAGC-3’(如 SEQ ID N0.5 所示) 下游引物 5，-TCGTCGTCTTCTGGTACATCAGG-3，(如 SEQ ID N0.6 所示)。
8.如權(quán)利要求1所述的秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，其特征在于，所述PCR的反應(yīng)體系如下: 引物(2 μ--θΙ/L)0.7uL dNTP(2,5 mmol/L)0.2uLDNA 模板1.0uLTaqDNA 聚合酶(5U/pL)0.1 uiIO χ PCR 緩沖液(含 Mg2+ )1.0uL 反應(yīng)體系用ddH20補(bǔ)足到總體積10 μ I。
9.如權(quán)利要求1所述的秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為:94°C變性5min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后72°C終延伸7min。
10.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的秈稻開(kāi)花期耐冷主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法在選育耐冷水稻品種中的應(yīng)用。`
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103667515SQ201310752529
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】鄧化冰, 陳桂華, 陳立云, 肖應(yīng)輝 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)