一種鑒別河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧及中華沙塘鱧的引物和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧及中華沙塘鱧的鑒別引物和方法，具體涉及應用微衛(wèi)星標記對河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧及中華沙塘鱧進行鑒別。本發(fā)明的一對引物命名為OP34a，序列如SEQ?ID?NO.1和2所示。鑒定時用該對引物對3種沙塘鱧DNA樣品進行PCR擴增，再用1.5%瓊脂糖凝膠(EB染色)電泳對PCR產物進行檢測，221～251bp大小條帶的為河川沙塘鱧，337～351bp大小條帶的為鴨綠沙塘鱧，465～471bp大小條帶的為中華沙塘鱧。本發(fā)明在不處死魚種的基礎上，只需剪取少量尾鰭或其它魚體組織部分即可進行鑒別，具有穩(wěn)定性高、操作簡單重復性好、實用性強并可快速準確鑒別等優(yōu)點。
【專利說明】一種鑒別河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧及中華沙塘鱧的引物和方法
【技術領域】[0001]本發(fā)明涉及DNA分子標記鑒別同屬魚種方法，具體地說，本發(fā)明涉及應用微衛(wèi)星標記對河)11沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧及中華沙塘鱧進行鑒別。
【背景技術】
[0002]河川沙塘體(Odontobutispotamophila)、鴨綠沙塘體(0.yaluensis)及中華沙塘鱧(0.sinensis)隸屬于鱸形目、蝦虎魚亞目、沙塘鱧科、沙塘鱧屬。沙塘鱧的分布頗有規(guī)律，河川沙塘鱧地方名為塘鱧魚、虎頭鯊、呆子魚等，僅分布于長江中、下游，錢塘江及閩江各水系，不見于珠江流域及長江上游，在長江水系的分布西限可上溯至湖北的荊州(沙市)、九江、黃梅，江西的鷹潭、宜春等地，因其肉質細嫩、味道鮮美、肌間刺少等優(yōu)點成為江蘇省特色水產業(yè)中具有良好發(fā)展前景的魚類品種之一；而中華沙塘鱧的分布區(qū)域較廣，主要見于珠江流域、海南島及長江中上游的貴州、湖北、湖南及江西各省，不見于閩江、錢塘江及長江下游各地；而地處長江中游的荊州、九江、黃梅、鷹潭、宜春等地水域則是中華沙塘鱧的分布東限，可以認為這些地區(qū)亦是河川沙塘鱧和中華沙塘鱧的混棲區(qū)，相互滲透和交匯，該魚成魚體長達170mm，個體雖小，但肉質鮮美，細嫩可口，屬上品食用魚類；鴨綠沙塘鱧俗稱瞎胖魚，僅分布于遼河及鴨綠江水系，具有抗寒、耐粗飼、個體較大、生長速度快等優(yōu)點，屬于易危物種，已被列入中國物種紅色名錄。沙塘鱧屬魚類經濟價值較高，市場需求量逐日擴大，從而刺激了其捕撈強度，使得自然資源急劇下降，再者，由于環(huán)境污染等原因導致生存空間受到嚴重威脅，并且產卵環(huán)境也屢遭破壞使得其野生資源、品質急劇下降。近年來沙塘鱧屬魚類的養(yǎng)殖規(guī)模也不斷擴大，為防止養(yǎng)殖者將品種搞混，必須盡快掌握其種質資源狀況，從而制定和實施更科學的漁業(yè)管理政策，有必要發(fā)明一種鑒別三種沙塘鱧屬魚類的方法。
[0003]河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧及中華沙塘鱧三者的親緣關系十分相近，外形極其相似。目前主要依據形態(tài)學特征進行區(qū)分:第一，頭頂部鱗片、眼前下方橫行感覺乳突呈現(xiàn)的排列方式不同以及眼后方有無感覺管孔；第二，一些可量性狀(頭長、吻長、眼徑等)及可數性狀(胸鰭、背鰭、臀鰭等)的多少；一般情況下，這些外部特征并不是固定特征，尤其是育苗的不同階段會隨著環(huán)境等因素的影響出現(xiàn)差別，因此不能作為判斷三種沙塘鱧的主要依據。由此可見，這種僅憑肉眼識別的形態(tài)學鑒別方法要求具有專業(yè)分類學知識，而且是在不受外界環(huán)境的影響下進行的。
[0004]微衛(wèi)星DNA廣泛分布于真核生物基因組中，信息含量大、共顯性標記、實驗操作簡單、結果便于PCR檢測，穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，成為當前研究者最喜愛的分子生物學方法之一，它在魚類的群體遺傳結構的分析、物種遺傳多樣性的鑒定以及遺傳基因連鎖圖譜的構建等方面已得到應用。應用結果表明:微衛(wèi)星側翼序列在親緣關系較近或種屬間是相當保守的。因此，鑒于沙塘鱧屬魚類形態(tài)學鑒定的不確定性，我們利用微衛(wèi)星分子標記法對三種沙塘鱧進行鑒別。
【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種快速準確鑒別河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧及中華沙塘鱧的鑒別引物和方法，以克服現(xiàn)有從形態(tài)學上鑒定存在主觀性強且不能有效地鑒定三種魚種的缺陷，本發(fā)明在不處死魚種的基礎上，只需剪取少量尾鰭或其它魚體組織部分即可進行鑒另IJ，具有穩(wěn)定性高、操作簡單重復性好、實用性強并可快速準確鑒別等優(yōu)點。
[0006]為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術方案是
[0007]一種河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧及中華沙塘鱧的鑒別引物，命名為0P34a，序列如下:
[0008]F:5' -AATCTCAGCTCTTTGGAATG-3' (SEQ ID N0.1)；
[0009]R:5' -CGAGGAATCAAGCAGAACAC-3' (SEQ ID N0.2)。
[0010]本發(fā)明還公開了一種河)11沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧及中華沙塘鱧的鑒別方法，包括下列步驟:
[0011]I)用上述引物對3種沙塘鱧鑒定樣本進行DNA擴增，獲得PCR產物；
[0012]2)用1.5%瓊脂糖凝膠(EB染色)電泳對PCR產物進行檢測，221~251bp大小條帶的為河川沙塘鱧，337~351bp大小條帶的為鴨綠沙塘鱧，465~471bp大小條帶的為中華沙塘鱧。
[0013]本發(fā)明是首次基于分子生物學手段建立起對河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧及中華沙塘鱧進行鑒別的方法，利用本實驗室從河川沙塘鱧中合成、篩選的特異微衛(wèi)星引物0P34a，建立了一個普通的PCR反應就可以實現(xiàn)鑒別三種沙塘鱧種質的新方法。本方法無需依賴專業(yè)的魚類分類學知識，也不需要具有長期從事魚類鑒別的豐富經驗，僅需取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測得到穩(wěn)定、清晰、差異明顯的擴增條帶，成本低，操作簡單，實用性強，可以用于指導沙塘鱧養(yǎng)殖生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1: 0P34a弓丨物在河j 11沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧及中華沙塘鱧3個群體中的擴增結果。
[0015]M-Marker ;1_8為河川沙塘鱧；9_16為鴨綠沙塘鱧；17_24為中華沙塘鱧。
【具體實施方式】
[0016]以下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
[0017]實施例
[0018]1.河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧及中華沙塘鱧總DNA的提取及定量
[0019]I)取實驗魚的尾鰭0.1~0.3g加入450iiLDNA抽提緩沖液(10mmol/L Tris-HCl,5mmol/LEDTA,75mmol/L NaCl)，混勻后依次加入SDS和蛋白酶K至終濃度分別為0.5%和200 u g/mL，然后于55°C水浴消化過夜。
[0020]2)加入等體積飽和苯酚、苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)、氯仿/異戊醇(24:1)各抽提一次。每次抽提均輕柔混合10分鐘后，4°C，12000rpm離心20分鐘，取上清。
[0021]3)將所得上清液加入2.·5mol/L NaCl (終濃度為0.2mol/L)和預冷的2倍體積的無水乙醇沉淀，12000rpm離心20分鐘取沉淀；用70%乙醇漂洗2次后在室溫下自然干燥，待乙醇揮發(fā)后溶于200 y L的TE中，置于4°C冰箱備用。在核酸蛋白測定儀上測定其純度及濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0022]2.確定PCR擴增體系
[0023]PCR擴增反應體系如下:各成分及其終濃度分別為=IOXbuffer緩沖液，2mM的dNTP, 2.5mM的Mg2+, 5U的Taq酶，IOuM正反引物，沙塘鱧模板DNA50ng,用滅菌水補足至20 μL，所述的引物序列為:
[0024]F:5' -AATCTCAGCTCTTTGGAATG-3'；
[0025]R:5' -CGAGGAATCAAGCAGAACAC-3'。
[0026]3.PCR擴增反應
[0027]在PCR儀上于95°C預變性5min，30個循環(huán):94°C變性30sec，47°C下退火30sec，72°C延伸Imin，最后72°C延伸5min，4°C保存。
[0028]4.瓊脂糖凝膠電泳檢測
[0029]取PCR擴增反應產物5 U L進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色并用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照，如圖1所示，根據電泳條帶與標準Marker比較:221~251bp大小條帶的為河川沙塘鱧；337~351bp條帶大小的為鴨綠沙塘鱧；465~471bp條帶大小的為中華沙塘鱧。
【權利要求】
1.一種河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧及中華沙塘鱧的鑒別引物，其特征在于所述引物命名為0P34a，其序列如下: F:5' -AATCTCAGCTCTTTGGAATG-3'； R:5, -CGAGGAATCAAGCAGAACAC-3'。
2.一種河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧及中華沙塘鱧的鑒別方法，其特征在于，包括下列步驟: 1)用權利要求1所述引物對3種沙塘鱧鑒定樣本進行DNA擴增，獲得PCR產物； 2)用1.5%瓊脂糖凝膠EB染色電泳對PCR產物進行檢測，221~251bp大小條帶的為河川沙塘鱧，337~351bp大小條帶的為鴨綠沙塘鱧，465~471bp大小條帶的為中華沙塘鱧。`
【文檔編號】C12N15/11GK103667499SQ201310733535
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月26日 優(yōu)先權日:2013年12月26日
【發(fā)明者】尹紹武, 張麗娟, 張國松, 張亞萍, 張洪偉, 胡亞麗 申請人:南京師范大學