豬mx1基因在抗prrs病毒中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及豬MX1基因在抗PRRS病毒中的新功能，具體提供了豬MX1基因在抗PRRS病毒中的應(yīng)用，其是通過MX1基因在細(xì)胞中的過表達(dá)來抑制PRRS病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。本發(fā)明還提供了利用MX1基因表達(dá)量篩選抗PRRS病毒豬的方法，以及制備過表達(dá)MX1基因的克隆胚胎的方法。
【專利說明】豬MX1基因在抗PRRS病毒中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及豬MXl基因在抗PRRS病毒中的新功能。【背景技術(shù)】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，俗稱“藍(lán)耳病”是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的,該病毒是巢狀病毒目動脈炎病毒科的一個成員，同屬的病毒還有馬動脈炎病毒，鼠乳酸脫氫酶酶病毒和猴出血熱病毒。該病主要引起豬的繁殖與呼吸癥狀，表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎和母豬流產(chǎn)木乃伊胎等，每年對全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2007年在中國爆發(fā)了一場高熱病，該病迅速在全國范圍擴(kuò)散，超過200萬頭豬被感染，40萬頭豬死亡，該病最后證實是由一種高致病性的藍(lán)耳病毒引起的。PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細(xì)胞，現(xiàn)在研究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型干擾素應(yīng)答，體液免疫不能及時產(chǎn)生有效的中和抗體，而且會形成抗體依賴的病毒增強效應(yīng)，最終導(dǎo)致免疫抑制和持續(xù)感染。由于該病毒的突變率極高，傳統(tǒng)疫苗方法也不能有效控制該病，很多研究都致力于尋找RNAi，干擾素等新的方法來針對該病毒，用于彌補傳統(tǒng)方法的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種與抗藍(lán)耳病相關(guān)的新基因MXl，及其通過對MXl基因進(jìn)行過表達(dá)，從而抑制PRRS病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方 案如下:
[0005]本發(fā)明首先提供了豬MXl基因在抗PRRS病毒中的應(yīng)用，其是通過MXl基因在細(xì)胞中的過表達(dá)來抑制PRRS病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。
[0006]本發(fā)明還提供了一種過表達(dá)MXl基因的載體。
[0007]作為優(yōu)選，所述載體為導(dǎo)入MXl基因CDS序列的pCMV-Myc-N載體。
[0008]本發(fā)明還提供了含有所述載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
[0009]進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為除胚胎細(xì)胞外的豬體細(xì)胞。
[0010]本發(fā)明還提供了一種制備克隆胚胎的方法，其以權(quán)利要求5所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核移植供體細(xì)胞，離體的卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過核移植技術(shù)獲得克隆胚胎。
[0011]本發(fā)明還提供了利用MXl基因表達(dá)量篩選抗PRRS病毒豬的方法，所述方法為通過對豬的MXl基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，MXl表達(dá)量高的豬比MXl表達(dá)量低的豬具有更高的抗PRRS病毒感染能力。
[0012]本發(fā)明所鑒定的與抗藍(lán)耳病相關(guān)的新基因MXl (Myxovirus resistancel)是屬于動力蛋白樣GTP酶家族。它主要負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)的囊泡運輸和維持細(xì)胞器的動態(tài)平衡狀態(tài)。在許多物種中，干擾素可以刺激產(chǎn)生MX基因，而且MX基因是宿主抗病毒的主要成分之一。MX對于禽流感等RNA病毒具有廣譜的抗病毒作用，它可以抑制病毒在進(jìn)入宿主細(xì)胞后，病毒基因組復(fù)制之前，這個早期階段的復(fù)制。有研究表明，在感染PRRS病毒后，豬肺部的MXl的mRNA表達(dá)量會上調(diào)，但是目前沒有實驗表明，過表達(dá)MXl會抑制PRRS病毒的復(fù)制。我們是第一次發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)MXl可以抑制PRRS病毒在MARC145細(xì)胞中的復(fù)制。
[0013]本發(fā)明的有益效果在于:
[0014]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的新的抑制PRRSV復(fù)制的基因MXl可以有以下兩個用途:
[0015]1.分析表明，相對于沒有過表達(dá)MXl基因的細(xì)胞，過表達(dá)MXl基因的細(xì)胞可以顯著抑制PRRS病毒的復(fù)制，因此，可以通過對豬的MXl基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，MXl表達(dá)量高的豬可能會比MXl表達(dá)量低的豬更加抗PRRSV的感染，從而達(dá)到根據(jù)MXl基因的表達(dá)量高低來篩選抗PRRSV的豬。
[0016]2.可以利用轉(zhuǎn)基因等基因工程學(xué)的方法，使得MXl基因在豬中的表達(dá)量升高，從而得到MXl表達(dá)量高的豬，進(jìn)而培育出抗PRRSV復(fù)制的豬。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明實施例1中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到的MXl在通城豬和長白豬感染PRRSV的第O天，第3天，第5天和第7天肺組織中的表達(dá)模式和相對表達(dá)量；橫坐標(biāo)代表時間點，縱坐標(biāo)代表RPKM (相對表達(dá)量)。
[0018]圖2為本發(fā)明實施例2中原始載體pCMV-Myc-N的載體圖譜。
[0019]圖3為本發(fā)明實施例2中MARC145細(xì)胞攻毒實驗后24小時PRRSV的拷貝數(shù)；橫坐標(biāo)代表對照組和攻毒組； 縱坐標(biāo)代表PRRSV 0RF7的相對表達(dá)量。
【具體實施方式】
[0020]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(New York:Gold Spring HarborLaboratory Press, 1989),或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0021]實施例1利用分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)方法發(fā)現(xiàn)新的抗PRRSV感染的基因
[0022]MXl
[0023]由于不同的豬品種和個體的遺傳背景差異，對藍(lán)耳病的抗性也不同，研究表明在臨床癥狀和生理生化指標(biāo)上，通城豬、梅山豬等國內(nèi)豬品種相較于國外長白豬、大白豬等感染高致病性PRRSV后有較強的抗性。通過高通量測序的方法，對感染PRRSV前后長白豬和通城豬的組織做差異基因表達(dá)分析，某些免疫相關(guān)的基因表達(dá)量在感染前后兩個品種間有顯著的差異。通過對不同品種間PRRSV感染造成的基因表達(dá)差異的分析，不僅可以研究藍(lán)耳病的感染機制，還可以找出抗性或易感相關(guān)的基因，從而為藍(lán)耳病的治療和預(yù)防提供新辦法。
[0024]前期實驗通過對6個品種豬(長白豬、大白豬、杜洛克豬、清平豬、梅山豬、通城豬)感染高致病性藍(lán)耳病毒(PRRSV)進(jìn)行抗病豬的篩選，通過臨床癥狀記錄:采食量、體溫、生理生化、細(xì)胞因子以及存活時間等的檢測，最后得到了對藍(lán)耳病抗性差異較大的兩個品種:長白豬(易感豬)、通城豬(抗病豬)。
[0025]選取抗病豬和易感豬各8頭，分別在第O天和感染高致病PRRSV后第3、5、7天宰殺取樣，肺組織提取總RNA，建庫進(jìn)行高通量測序，通過生物信息學(xué)分析。分析發(fā)現(xiàn):在攻毒第O天即對照組，MXl在通城豬肺組織中的相對表達(dá)量(RPKM) 60.56大于長白豬的7.35 ；而且在通城豬肺組織中MXl的表達(dá)達(dá)到峰值是在感染后第5天，在長白豬肺組織中MXl的表達(dá)達(dá)到峰值是在感染后第7天(如圖1所示)。
[0026]實施例2利用細(xì)胞實驗方法驗證MXl基因抗PRRSV感染
[0027]1.設(shè)計針對MX-1基因(GenBank登錄號為NM_214061.1)的引物，利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)反轉(zhuǎn)錄mRNA并擴(kuò)增得到MXl基因的CDS序列，引物序列如下:
[0028]目的基因MXl:
[0029]上游引物MXl-F:
[0030]5' -GCGTCGACCATGGTTTATTCCAACTGTG-3'；
[0031]下游引物MXl-R:
[0032]5' -CCCTCGAGTCAGCCTGGGAACTTG-3'。
[0033]將擴(kuò)增得到的MXl基因的⑶S序列(如SEQ ID N0.1所示)導(dǎo)入原始載體pCMV-Myc-N (購自Clonetech公司，載體圖譜如圖2所示),構(gòu)建pCMV_MXl_Myc載體。由于pCMV-Myc-N具有CMV強啟動子，能夠使導(dǎo)入其中的MXl基因進(jìn)行過表達(dá)。
[0034]2.MXl基因過表達(dá)的驗證
[0035]將構(gòu)建好的連有MXl基因⑶S序列的pCMV-MXl載體和未連接有MXl基因的⑶S序列的pCMV-Myc-N載體 ，分別轉(zhuǎn)染MARC145細(xì)胞。
[0036]3.將構(gòu)建好的連有MXl基因⑶S序列的pCMV-MXl載體和未連接有MXl基因的⑶S序列的pCMV-Myc-N載體，分別轉(zhuǎn)染MARC145細(xì)胞，培養(yǎng)24小時之后，提取細(xì)胞的總RNA，對PRRS病毒的0RF7 (第7個編碼閱讀框)進(jìn)行定量PCR檢測。
[0037]PRRS 病毒 0RF7 引物:
[0038]上游引物PRRS-F: AATAACAACGGCAAGCAGCA ；
[0039]下游引物PRRS-R: GCACAGTATGATGCGTCGGC。
[0040]為了計算PRRS病毒的0RF7的相對表達(dá)量，在對PRRS病毒的0RF7進(jìn)行定量PCR檢測的同時引入內(nèi)參基因GAPDH (GAPDH在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量比較恒定)，同時進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0041]內(nèi)參基因GAPDH (GenBank 登錄號為 ΝΜ_001206359.1):
[0042]內(nèi)參基因GAPDH引物:
[0043]上游引物GAPDH-F: CCTTCCGTGTCCCTACTGCCAAC ；
[0044]下游引物GAPDH-R:GACGCCTGCTTCACCACCTTCT。
[0045]4.分析轉(zhuǎn)染了帶有MXl基因⑶S序列的質(zhì)粒的細(xì)胞中的PRRS0RF7的拷貝數(shù)與轉(zhuǎn)染了不帶有MXl基因CDS序列的質(zhì)粒的細(xì)胞中的0RF7的拷貝數(shù)是否有顯著差異。我們的結(jié)果顯示，在攻毒完成，并培養(yǎng)24小時后，轉(zhuǎn)染了過表達(dá)MXl基因CDS序列的細(xì)胞中的PRRS病毒的0RF7的相對表達(dá)量要顯著的低于對照組(如圖3所示)。
[0046]通過比較過表達(dá)MXl基因的MARC145細(xì)胞和不轉(zhuǎn)任何基因的MARC145細(xì)胞中的PRRS的拷貝數(shù)目，來分析MXl基因?qū)τ赑RRS病毒在MARC145細(xì)胞中復(fù)制的影響。我們研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MXl基因后，PRRS病毒在MARC145細(xì)胞中的復(fù)制明顯受到抑制，這說明MXl基因?qū)τ赑RRS病毒的復(fù)制具有抑制作用，我們可以通過過表達(dá)MXl基因來達(dá)到抑制PRRS病毒復(fù)制的目的。
[0047]本實施例實驗操作中包含:
[0048]I)總RNA的提取
[0049]總RNA的提取是用Invitrogen公司生產(chǎn)的TRIzol試劑，并嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書要求進(jìn)行操作。
[0050]2)反轉(zhuǎn)錄 PCR
[0051]反轉(zhuǎn)錄所采用的是MMLV逆轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶并嚴(yán)格按照Promega公司的說明書要求進(jìn)行操作。
[0052]3)利用熒光實時定量PCR技術(shù)檢測PRRSV 0RF7的表達(dá)情況
[0053]熒光實時定量PCR:
[0054]儀器型號:ABI公司生產(chǎn)的 Applied BiosystemsViiA7
[0055]試劑盒:康為世紀(jì)公司生產(chǎn)的FastSYBR mixture (Coffin Biotech C0., Ltd.[CWBIO])，并按照產(chǎn)品說明書操作。
[0056]PRRSV 0RF7相對表達(dá)量分析方法:
[0057]Λ Λ Ct方法:Λ Ct實驗組=(實驗組目的基因Ct-實驗組內(nèi)參基因Ct)
[0058]Δ Ct對照組=(對照組目的基因Ct-對照組內(nèi)參基因Ct)
[0059]2—Δ ACt=2~(ACt 實驗組-ACt 對照組)
[0060]采用GAPDH作為內(nèi)參基因。
[0061]實施例3利用MXl基因過表`達(dá)制備抗PRRSV的轉(zhuǎn)基因豬
[0062]1、供體細(xì)胞的復(fù)蘇。從液氮中取出凍存管，快速投入37度水浴中，并不斷快速搖動凍存管。待冷凍液徹底解凍后，轉(zhuǎn)移至離心管中，用新鮮培養(yǎng)液稀釋3倍，lOOOrpm，離心5分鐘，出去上清，用新鮮的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞稀釋至所需濃度，接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。
[0063]2、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將連有MXl基因⑶S序列的目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入供體細(xì)胞中。常規(guī)方法消化細(xì)胞，用IOOul無血清培養(yǎng)基DMEM來稀釋0.8ug待轉(zhuǎn)質(zhì)粒和2ul脂質(zhì)體(lipofectamine?2000)o室溫孵育20分鐘后，向24孔培養(yǎng)板的每個孔內(nèi)添加IOOul上述液體。將培養(yǎng)板前后輕輕晃動搖勻，培養(yǎng)4-6小時后更換培養(yǎng)液為完全細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0064]3、轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的篩選。將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48小時的細(xì)胞加入800ug/mL G418，每2-3天換液一次，篩選14天后，用PBS洗2遍，收集陽性細(xì)胞克隆。
[0065]4、轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的DNA檢測。按照常規(guī)分子克隆方法，提取轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞DNA并進(jìn)行PCR驗證。
[0066]5、以上述轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞為核移植供體細(xì)胞，以體外成熟的初情期前母豬卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞。把供體細(xì)胞以及成熟卵母細(xì)胞同時轉(zhuǎn)入39度，5%C02,100%濕度平衡10分鐘，然后在配有顯微操作儀器及恒溫臺的倒置顯微鏡上用固定吸管吸持卵母細(xì)胞，用注射針將吸取卵母細(xì)胞核。然后挑選表面光滑的體細(xì)胞，從去核時裂口處放入卵周隙，用注射針點壓透明帶，使供體細(xì)胞與受體卵的胞膜接觸緊密。將供體細(xì)胞-卵胞質(zhì)構(gòu)成的重構(gòu)卵轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)液PZM3中，在39度，5%C02，100%濕度培養(yǎng)箱中恢復(fù)I小時。
[0067]6、將恢復(fù)好的重構(gòu)卵分批轉(zhuǎn)移到融合液中平衡2分鐘，用融合/激活液洗滌3遍后，每批放5-8個放入已經(jīng)鋪滿融合液的融合槽內(nèi)，使供體細(xì)胞-受體卵細(xì)胞膜接觸面與電極平行，用CUY-21融合儀(BEX，日本)施加I個lOOus，1.4kv/cm的直流電脈沖誘導(dǎo)融合同時激活，接著用PZM3培養(yǎng)液洗滌3遍，立即轉(zhuǎn)入礦物油覆蓋胚胎培養(yǎng)液中或輔助激活液中，39度，5%C02,100%濕度培養(yǎng)4小時后再體視顯微鏡下判定融合。
[0068]7、克隆胚胎體外培養(yǎng)。將融合的重構(gòu)胚用胚胎培養(yǎng)液洗滌5遍后，轉(zhuǎn)入預(yù)平衡2小時以上的胚胎培養(yǎng)液PZM3中，培養(yǎng)條件39度，5%C02，5%02，90%N2，飽和濕度。
[0069]8、挑選形態(tài)優(yōu)良的克隆胚胎用非手術(shù)法移入自然發(fā)情的經(jīng)產(chǎn)母豬子宮內(nèi)進(jìn)行妊娠。
[0070]9、對出生的克隆轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行PCR和southern檢測，進(jìn)行功能研究。
[0071]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精 神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.豬MXl基因在抗PRRS病毒中的應(yīng)用，其特征在于，其是通過MXl基因在細(xì)胞中的過表達(dá)來抑制PRRS病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。
2.一種過表達(dá)MXl基因的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于，所述載體為導(dǎo)入MXl基因CDS序列的pCMV-Myc-N 載體。
4.含有權(quán)利要求2或3所述載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其特征在于，其為除胚胎細(xì)胞外的豬體細(xì)胞。
6.一種制備克隆胚胎的方法，其特征在于，其以權(quán)利要求5所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核移植供體細(xì)胞，離體的卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過核移植技術(shù)獲得克隆胚胎。
7.利用MXl基因表達(dá)量篩選抗PRRS病毒豬的方法，其特征在于，所述方法為通過對豬的MXl基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，MXl表達(dá)量高的豬比MXl表達(dá)量低的豬具有更高的抗PRRS病毒感染能 力。
【文檔編號】C12N15/12GK103757027SQ201310718071
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】李寧, 李佳, 任立明, 李駿蔚 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)