使用菌根菌與腐生菌共同培養(yǎng)黃鱗鵝膏菌絲體的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使用菌根菌與腐生菌共同培養(yǎng)黃鱗鵝膏菌絲體的方法，屬于大型真菌培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。其特征為：直接在增殖培養(yǎng)基中加入菌根真菌石灰菌及人工培養(yǎng)的腐生菌香菇，即可使黃鱗鵝膏菌絲體的生長速度提高9～12倍，生長明顯加快。本發(fā)明不需繁瑣復(fù)雜的流程，只在培養(yǎng)基中加入兩種菌體混合物，即加快了菌絲體繁殖速度，其效果明顯、培養(yǎng)簡單易實現(xiàn)、生產(chǎn)成本不高。鵝膏屬毒素在開發(fā)新特效藥如抗腫瘤、抗菌抗病毒、鎮(zhèn)靜或麻醉藥等領(lǐng)域具有潛在地應(yīng)用，但至今因其資源珍稀、難以人工馴化等瓶頸問題尚難以開發(fā)應(yīng)用。本發(fā)明征對黃鱗鵝膏菌絲生長比較緩慢等制約純培養(yǎng)的問題進行了創(chuàng)新研究，為菌絲的規(guī)模化培養(yǎng)及今后人工馴化栽培等提供了依據(jù)。
【專利說明】使用菌根菌與腐生菌共同培養(yǎng)黃鱗鵝膏菌絲體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種使用菌根菌與腐生菌共同培養(yǎng)黃鱗鵝膏菌絲體的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說是屬于有毒大型真菌室內(nèi)培養(yǎng)范疇。
【背景技術(shù)】
[0002]鵝膏菌屬—)隸屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、鵝膏菌科 iaceae)，是有毒的大型真菌中較特殊、較有價值的一個世界性廣布大屬,其物種多
樣性是非常豐富的。全球已報道近400種，中國已記錄的近100種(含亞種、變種及變型)。據(jù)考證，目前中國仍有不少種尚未研究和命名。但是如今隨著全球生態(tài)危機的出現(xiàn)，我國的許多大型真菌資源已告危，處于嚴(yán)重衰退及瀕危狀態(tài)，而部份種面臨著可能還沒有被人類認識或發(fā)現(xiàn)其價值時，就已滅絕的風(fēng)險。
[0003]鵝膏菌屬中的大部份種屬于著名劇毒菌，據(jù)知，因誤食野生蕈菌中毒死亡者95%是因鵝膏菌所致?？茖W(xué)家們對鵝膏菌真正感興趣的是其毒性，因此，大約在140年前，人們就開始了鵝膏菌毒素的研究。鵝膏毒素的應(yīng)用研究主要體現(xiàn)在以下幾方面:①可用于研究真核生物基因的表達、調(diào)控及細胞定位；②可開發(fā)抗菌、抗病毒特效新藥可篩選抗腫瘤藥物；④可開發(fā)鎮(zhèn)靜、麻醉及其它特效藥可用于生物防冶等。
[0004]目前導(dǎo)致鵝膏難以開發(fā)及可持續(xù)性利用的主要瓶頸問題有:①鵝膏資源珍稀，其種群小，個體少，產(chǎn)量低，分布數(shù)量極其有限，加之對生境敏感，一旦生境受到破壞，極易消失或滅絕，屬于特殊的致危生物類群，這增加了其進一步被研究、利用的難度；②鵝膏菌屬，大多屬于外生菌根真菌，目前尚不能人工栽培。因此，至今國內(nèi)外還沒有一種能規(guī)模化開發(fā)的毒素產(chǎn)品，現(xiàn)作為生化試劑的肽類毒素依然價格昂貴(10多年前每克在10萬美元左右—陳作紅等，1999)，難以滿足科研和應(yīng)用所需。
[0005]鵝膏的純培養(yǎng)是保證鵝膏資源可持續(xù)性利用的前提或關(guān)鍵，但此目前仍然屬于難以攻克的問題，存在許多盲點，其中菌絲難以誘導(dǎo)、菌絲生長非常緩慢是制約及影響純培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)或因素。
[0006]黃鱗鵝膏Cl,屬于鵝膏亞屬(Amanita subgen.Amanita)鵝膏組(sect.Amanita),其種群分布較少，目前已成功分離到了該種的菌絲,但菌絲的生長前期仍然很慢，難以擴繁，本發(fā)明征對這個問題，在培養(yǎng)基中加入菌根菌與腐生菌，大大提高了菌絲的生長速度，為鵝膏毒素的可持續(xù)性開發(fā)利用等奠定了重要基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于，提供一種簡單、易實現(xiàn)、生產(chǎn)成本不高，能使鵝膏菌絲快速生長的培養(yǎng)方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是，直接在增殖培養(yǎng)基中同時加入鵝膏屬以外的菌根真菌及人工培養(yǎng)的腐生菌，即可使黃鱗鵝膏菌絲體的生長速度提高9~12倍；
所述的增殖培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖9~llg/L、蛋白凍1.00~1.25g/L、ZnSO40.40 ~0.60g/L、MgS040.40 ~0.60g/L、玉米素 ZT 0.80 ~1.00mg/L、粉碎的過 80 目分樣篩的生境腐葉土 25~35g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6~6.0 ;
所述的菌根真菌為采自鵝膏生境中大量生長的石灰菌(JMCtarius piperatus),腐生菌為可室內(nèi)規(guī)?；a(chǎn)的香燕eiZoofes);石灰菌及香燕的制備及使用方法如下:分別將石灰菌、香菇烘干，粉碎，二者按1:4比例混合，將混合干粉，按1:7~1:8的重量體積比加入水，攪勻，用超聲波處理30~40 min，再加入15~20倍水，調(diào)節(jié)PH值為5.4~
5.6，于45~50°C水浴中，按2.5~3.0%的重量體積比加入纖維素酶，酶解70~100 min后，將水浴溫度升至90~93°C，至水分基本蒸干時移入65~70°C烘箱中，干燥25~30hr ；將酶解的干粉按25~35g/L加入到增殖培養(yǎng)基中；
所述的黃鱗鵝膏菌絲體為本發(fā)明前期誘導(dǎo)及培養(yǎng)，誘導(dǎo)及培養(yǎng)方法如下:野外采摘生長良好、未開傘的健康子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內(nèi)部無菌組織塊約0.35cm2大小，輕輕嵌入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖9~llg/L、蛋白凍1.00~1.25g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl2 1.00g /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 100 ~125ml、瓊脂10.00g/L,控制培養(yǎng)基PH值為5.6~6.0，在22~23°C下暗培養(yǎng)50~60天，組織塊表面長出白色絨毛狀菌絲；將菌絲在上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，即得本發(fā)明用菌絲。 [0009]本發(fā)明的有益效果是:直接在增殖培養(yǎng)基中加入特殊物質(zhì)，即可使菌絲體的生長速度大大提高，其特點如下:
(1)效果明顯:加入菌根菌與腐生菌的混合物后，生長速度為未加入以前的9~12倍，生長明顯加快；
(2)培養(yǎng)簡單易實現(xiàn):不需繁瑣復(fù)雜的流程，只要在培養(yǎng)基中加入經(jīng)過酶解處理的菌體復(fù)合物即可；
(3)生產(chǎn)成本不高:本發(fā)明采用的兩種菌體物質(zhì)，一種采自野外，生長量大，易得；另一種市場上隨處可買，價格便宜，二者皆不會造成培養(yǎng)成本的增高。
【具體實施方式】
[0010]以下的實施例子是對本發(fā)明的進一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
[0011]實例一:
野外采摘生長良好、未開傘的健康子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內(nèi)部無菌組織塊約
0.35cm2大小，輕輕嵌入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖9g/L、蛋白凍
1.00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /L、KH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 100ml、瓊脂10.00g/L,控制培養(yǎng)基PH值為5.6，在22~23°C下暗培養(yǎng)50天，組織塊表面長出白色絨毛狀菌絲；將菌絲在上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，即得本發(fā)明用菌絲；
將菌絲轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，所述的增殖培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖9g/L、蛋白凍
1.00g/L、ZnSO40.40g/L、MgSO40.40g/L、玉米素 ZT 0.80mg/L、粉碎的過 80 目分樣篩的生境腐葉土 25g/L、石灰菌及香菇的酶解干粉25g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6 ;
所述石灰菌及香菇的制備方法如下:分別將石灰菌、香菇烘干，粉碎，二者按1:4比例混合，將混合干粉，按1:7的重量體積比加入水，攪勻，用超聲波處理30min，再加入15倍水，調(diào)節(jié)PH值為5.4，于45°C水浴中，按2.5%的重量體積比加入纖維素酶，酶解70min后，將水浴溫度升至90°C，至水分基本蒸干時移入65°C烘箱中，干燥25hr即可。[0012]實例二:
野外采摘生長良好、未開傘的健康子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內(nèi)部無菌組織塊約0.35cm2大小，輕輕嵌入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖llg/L、蛋白凍 1.25g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl2 1.00g/L,KH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 125ml、瓊脂10.00g/L,控制培養(yǎng)基PH值為6.0，在22~23°C下暗培養(yǎng)60天，組織塊表面長出白色絨毛狀菌絲；將菌絲在上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，即得本發(fā)明用菌絲；
將菌絲轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，所述的增殖培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖llg/L、蛋白凍 1.25g/L、ZnSO40.60g/L,MgSO40.60g/L、玉米素 ZT 1.00mg/L、粉碎的過 80 目分樣篩的生境腐葉土 35g/L、石灰菌及香菇的酶解干粉35g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為6.0 ；所述石灰菌及香菇的制備方法如下:分別將石灰菌、香菇烘干，粉碎，二者按1:4比例混合，將混合干粉，按1:8的重量體積比加入水，攪勻，用超聲波處理40 min，再加入20倍水，調(diào)節(jié)PH值為5.6，于50°C水浴中，按3.0%的重量體積比加入纖維素酶，酶解100 min后，將水浴溫度升至93°C，至水分基本蒸干時移入70°C烘箱中，干燥30hr即可。
[0013]實例三:
野外采摘生長良好、未開傘的健康子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內(nèi)部無菌組織塊約
0.35cm2大小，輕輕嵌入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖10g/L、蛋白凍 1.10g/L, MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 110ml、瓊脂10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6，在22~23°C下暗培養(yǎng)55天，組織塊表面長出白色絨毛狀菌絲；將菌絲在上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，即得本發(fā)明用菌絲；
將菌絲轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，所述的增殖培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖10g/L、蛋白凍 1.10g/L、ZnSO40.50g/L,MgSO40.50g/L、玉米素 ZT 0.90mg/L、粉碎的過 80 目分樣篩的生境腐葉土 30g/L、石灰菌及香菇的酶解干粉30g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6 ；所述石灰菌及香菇的制備方法如下`:分別將石灰菌、香菇烘干，粉碎，二者按1:4比例混合，將混合干粉，按1:7的重量體積比加入水，攪勻，用超聲波處理35 min，再加入18倍水，調(diào)節(jié)PH值為5.4，于48°C水浴中，按2.8%的重量體積比加入纖維素酶，酶解90 min后，將水浴溫度升至91°C，至水分基本蒸干時移入68°C烘箱中，干燥28hr即可。
[0014]實例四:
野外采摘生長良好、未開傘的健康子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內(nèi)部無菌組織塊約
0.35cm2大小，輕輕嵌入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖10g/L、蛋白凍 1.20g/L, MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 120ml、瓊脂10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為6.0，在22~23°C下暗培養(yǎng)58天，組織塊表面長出白色絨毛狀菌絲；將菌絲在上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，即得本發(fā)明用菌絲；
將菌絲轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，所述的增殖培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖10g/L、蛋白凍 1.20g/L、ZnSO40.55g/L,MgSO40.55g/L、玉米素 ZT 0.85mg/L、粉碎的過 80 目分樣篩的生境腐葉土 28g/L、石灰菌及香菇的酶解干粉28g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為6.0 ；所述石灰菌及香菇的制備方法如下:分別將石灰菌、香菇烘干，粉碎，二者按1:4比例混合，將混合干粉，按1:8的重量體積比加入水，攪勻，用超聲波處理38 min，再加入17倍水，調(diào)節(jié)PH值為5.6，于47°C水浴中，按2.6%的重量體積比加入纖維素酶，酶解80 min后，將水浴溫度升至92°C，至水分基本蒸干時移入67°C烘箱中，干燥26hr即可。
【權(quán)利要求】
1.一種使用菌根菌與腐生菌共同培養(yǎng)黃鱗鵝膏菌絲體的方法，其特征為，在增殖培養(yǎng)基中同時加入鵝膏屬以外的菌根真菌及人工培養(yǎng)的腐生菌，能使黃鱗鵝膏菌絲體的生長速度提高9~12倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用菌根菌與腐生菌共同培養(yǎng)黃鱗鵝膏菌絲體的方法，其特征為，所述的增殖培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖9~llg/L、蛋白凍1.0O~1.25g/L、ZnSO40.40 ~0.60g/L、MgS040.40 ~0.60g/L、玉米素 ZT 0.80 ~1.00mg/L、粉碎的過 80 目分樣篩的生境腐葉土 25~35g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6~6.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用菌根菌與腐生菌共同培養(yǎng)黃鱗鵝膏菌絲體的方法，其特征為，菌根真菌為采自鵝膏生境中大量生長的石灰菌腐生菌為可室內(nèi)規(guī)?；a(chǎn)的香eiZoofes);石灰菌及香燕的制備及使用方法如下:分別將石灰菌、香菇烘干，粉碎，二者按1:4比例混合，將混合干粉，按1:7~1:8的重量體積比加入水，攪勻，用超聲波處理30~40 min,再加入15~20倍水，調(diào)節(jié)PH值為5.4~5.6，于45~50°C水浴中，按2.5~3.0%的重量體積比加入纖維素酶，酶解70~100 min后，將水浴溫度升至90~93°C，至水分基本蒸干時移入65~70°C烘箱中，干燥25~30hr ;將酶解的干粉按25~35g/L加入到增殖培養(yǎng)基中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用菌根菌與腐生菌共同培養(yǎng)黃鱗鵝膏菌絲體的方法，其特征為，黃鱗鵝膏菌絲體為本發(fā)明前期誘導(dǎo)及培養(yǎng)，誘導(dǎo)及培養(yǎng)方法如下:野外采摘生長良好、未開傘的健康子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內(nèi)部無菌組織塊約0.35cm2大小，輕輕嵌入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖9~llg/L、蛋白凍1.00~1.25g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /L、KH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 100 ~125ml、瓊脂.10.00g/L，控制培養(yǎng)基PH值為5.6~6.0，在22~23°C下暗培養(yǎng)50~60天，組織塊表面長出白色絨毛狀菌絲；將菌絲在上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，即得本發(fā)明用菌絲。
【文檔編號】C12N1/14GK103667084SQ201310701996
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】李宗菊, 張曦予, 程霞, 唐萍, 曹玉, 馮遼遼, 趙昱, 左奎 申請人:云南大學(xué)