一種強(qiáng)熱穩(wěn)定性的中性蛋白酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種強(qiáng)熱穩(wěn)定性的中性蛋白酶，屬于酶制劑制備【技術(shù)領(lǐng)域】。以產(chǎn)強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌1398-2-12為出發(fā)菌株，并進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝改進(jìn)，經(jīng)液體深層混合發(fā)酵，制得一種熱穩(wěn)定性強(qiáng)、酶活力較高的中性蛋白酶。發(fā)酵液酶活5500-7000U/mL，最適反應(yīng)溫度為70℃；在pH值為4.5-8.5時酶活完全穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH值為7.2；在70℃條件下保存1h后保持80%以上酶活，75℃條件下保存1h后保持70%以上酶活。比現(xiàn)有的中性蛋白酶熱穩(wěn)定性強(qiáng)，酶活力較高，酶作用最適pH值范圍寬泛，儲存穩(wěn)定性高，特別適合反應(yīng)溫度高，蛋白分解與糖化、液化工藝并存的工業(yè)化需求。
【專利說明】一種強(qiáng)熱穩(wěn)定性的中性蛋白酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶制劑制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種強(qiáng)熱穩(wěn)定性的中性蛋白酶。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白酶是生物體內(nèi)的一類酵素(酶)，它們能夠分解蛋白質(zhì)。分解方法是打斷那些將氨基酸連結(jié)成多肽鏈的肽鍵。抑制蛋白酶活性的小分子化合物被稱蛋白酶抑制劑。許多病毒蛋白酶的抑制劑是很有效的抗病毒藥。蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱。按其水解多肽的方式，可以將其分為內(nèi)肽酶和外肽酶兩類。內(nèi)肽酶將蛋白質(zhì)分子內(nèi)部切斷，形成分子量較小的際和胨。外肽酶從蛋白質(zhì)分子的游離氨基或羧基的末端逐個將肽鍵水解，而游離出氨基酸，前者為氨基肽酶后者為羧基肽酶。按其活性中心和最適PH值，又可將蛋白酶分為絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反應(yīng)的最適pH值，分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。
[0003]蛋白酶廣泛存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉、果實和微生物中。微生物蛋白酶主要由霉菌、細(xì)菌，其次由酵母、放線菌生產(chǎn)。
[0004]酶的應(yīng)用已有千年以上的歷史，雖然中性蛋白酶是最早為人類所發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶制劑之一，但是廣泛應(yīng)用還是最近幾十年的事。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，隨著酶的制備、酶和細(xì)胞固定化、酶分子改造等酶技術(shù)的發(fā)展，中性蛋白酶的應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大。自上世紀(jì)以來，世界各國科研工作者一直都致力于中性蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選、酶提取、純化以及酶學(xué)性質(zhì)的研究和應(yīng)用研究工作，取得了一定的成績。
[0005]從目前國內(nèi)中性蛋白酶發(fā)展以及研究報道來看，我國中性蛋白酶的研究總體水平來說仍處于一個起步階段。大量研究表明，微生物發(fā)酵生產(chǎn)及遺傳工程技術(shù)將合成特定氨基酸的基因克隆進(jìn)入微生物細(xì)胞質(zhì)粒中，從而借助某些微生物增殖生產(chǎn)等，中性蛋白酶已廣泛應(yīng)用，這些方法具有產(chǎn)量較高、生產(chǎn)周期短、成本低等優(yōu)點。采用基因工程與傳統(tǒng)的微生物育種方式結(jié)合來提高菌種產(chǎn)酶量是一條值得繼續(xù)探索的發(fā)展途徑。綜合過去已經(jīng)取得的成績以及在研究中存在的問題，今后發(fā)展的方向主要有以下幾個方面:1.繼續(xù)通過基因工程與傳統(tǒng)的微生物育種技術(shù)進(jìn)一步提高微生物產(chǎn)酶能力。2.采用酶體外定向技術(shù)改變酶的底物特異性與適應(yīng)性，如底物親和力、pH適應(yīng)性、耐熱性以及耐氧化性等等，為開拓酶的新應(yīng)用領(lǐng)域做出貢獻(xiàn)。3.繼續(xù)尋找產(chǎn)中性蛋白酶新的菌種，特別是極端微生物源中性蛋白酶顯得尤為重要。4.在應(yīng)用方面，繼續(xù)開發(fā)酶的應(yīng)用領(lǐng)域，同時，積極開展理論與應(yīng)用研究，為此酶在食品與其它 行業(yè)的發(fā)展中如何做出更大貢獻(xiàn)，將是未來營養(yǎng)研究的重要領(lǐng)域，必將為食品與其它行業(yè)高效、持續(xù)、穩(wěn)定發(fā)展開辟新的廣闊前景。
[0006]國內(nèi)目前從事中性蛋白酶生產(chǎn)與銷售的酶制劑企業(yè)很少，主要是由于所采用生產(chǎn)菌種大多為上世紀(jì)八十年代所開發(fā)的誘變菌株，產(chǎn)酶能力下降、不太穩(wěn)定、部分優(yōu)良性狀出現(xiàn)部分退化或喪失，且易受到酵母及噬菌體的污染，對生產(chǎn)造成一定程度的損失。加之，目前我國中性蛋白酶發(fā)酵單位相對較低，濃縮成本高，不便保存與運(yùn)輸，而且，通常情況下，酶保存技術(shù)屬商業(yè)機(jī)密，因此，有關(guān)中性蛋白酶酶保藏的研究仍是一個值得研究的領(lǐng)域。如何獲得新的產(chǎn)中性蛋白酶菌株、提高菌株產(chǎn)酶能力以及如何保藏酶將成為一個發(fā)展方向。
[0007]中國專利CN1289659C公開了一種產(chǎn)高溫中性蛋白酶的地衣芽孢桿菌及其制備高溫中性蛋白酶的工藝和高溫中性蛋白酶，所述中性蛋白酶適用反應(yīng)溫度為50-70°C，最適反應(yīng)溫度為65°C，適用pH值為5-8，最適pH值為7.0-7.2。在50°C保溫I小時酶活力下降10%，在60°C下酶的半衰期45分鐘。
[0008]中性蛋白酶是能催化蛋白質(zhì)肽鍵水解，最適作用pH值在7.0左右的蛋白酶。中性蛋白酶由于具有催化反應(yīng)速度快、無工業(yè)污染、催化反應(yīng)條件適應(yīng)性較寬等性質(zhì)和優(yōu)點，被應(yīng)用于食品、制藥、化妝品、洗滌劑、絲紡、毛皮軟化等行業(yè)，但是由于中性蛋白酶熱穩(wěn)定性差，生產(chǎn)與使用條件復(fù)雜，限制了它進(jìn)一步應(yīng)用的范圍，進(jìn)一步優(yōu)化選育產(chǎn)中性蛋白酶的優(yōu)良菌株，生產(chǎn)出熱穩(wěn)定性強(qiáng)的中性蛋白酶對酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有中性蛋白酶熱穩(wěn)定性差的缺陷，以產(chǎn)強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)1398-2-12為出發(fā)菌株，并進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝改進(jìn)，經(jīng)特定發(fā)酵條件下的液體深層混合發(fā)酵，制得一種熱穩(wěn)定性強(qiáng)、酶活力較高的中性蛋白酶。
[0010]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0011]所述中性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)如下:
[0012](I)溫度:該酶溫 度適應(yīng)范圍較寬，最適作用溫度為70°C，在40-70°C之間具有較聞的酶活；
[0013](2) pH:該酶最適反應(yīng)pH值為7.2，在pH值為4.5-8.5時酶活完全穩(wěn)定；
[0014](3)酶活性:發(fā)酵液中性蛋白酶酶活可達(dá)5500-7000U/mL，是出發(fā)菌株的2.5倍。
[0015](4)熱穩(wěn)定性:該酶在70°C條件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，75°C條件下保存Ih后保持70%以上酶活；
[0016](5)存儲穩(wěn)定性:該酶在室溫下保存12個月后酶活損失小于2.5%。
[0017]所述中性蛋白酶的制備方法如下:
[0018]枯草芽孢桿菌1398-2-12經(jīng)菌種活化和逐級擴(kuò)大培養(yǎng)獲得液體種子；將液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30-36 °C，攪拌速度200-700r/m，通風(fēng)量(V/V) 1:1-3,培養(yǎng)時間10_15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15_20h ;繼續(xù)以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15_20h ;繼續(xù)以l-2°C/h升溫速率緩慢升溫至30-36°C，恒溫培養(yǎng)15-20h;發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得固體中性蛋白酶；所述調(diào)配過程加入濃縮酶液總重量0.5-5%中草藥粉劑。
[0019]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3-10g，氯化鈉5_12g，蛋白胨10_20g，葡萄糖 2-5g, (NH)2S043-5g，K2HP046_8g，CaCl2l_3g，瓊脂 15_20g，中草藥粉劑 5-10g,蒸餾水1000mL, pH 值 7.0-7.2，121°C滅菌 20min ；
[0020]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0021]稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10_15份；黃芩10_15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度700C _90°C保持2-4h，然后降溫至45-60°C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至600C _78°C保持3-4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0022]所述混合酶添加量為混合物料總重量的5-10%。
[0023]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
[0024]所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1-1.5。
[0025]所述種子培養(yǎng)基重量百分比組成為:
[0026]酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸鈣Ig,氯化鎂2g,檸檬酸鈉l_3g，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH 值 7.0-7.2，121-123°C滅菌 30_40min。[0027]所述種子罐培養(yǎng)基重量百分比組成為:
[0028]麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草藥粉劑1.5-2%,海藻糖1-3%,蛋白胨
0.1-0.5%，玉米漿 0.1-0.5%，磷酸氫二鉀 0.8-1.5%，硫酸鎂 0.05-0.1%，檸檬酸鈉 0.1-0.5%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.0-7.2，121-123°C滅菌30_40min。
[0029]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個/ml ；
[0030]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆餅粉15_25g，中草藥粉劑30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉l_5g，消泡劑0.Ι-lg,純凈水lOOOmL，pH值7.0-7.2，121°C滅菌 20min ；
[0031 ] 所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量百分比組成為:麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15-25%，中草藥劑粉5-10%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.0-7.2，121_123°C滅菌30_40min。
[0032]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調(diào)配方法為:
[0033]按比例準(zhǔn)確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調(diào)節(jié)PH值7.0-7.2，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15-30min，然后緩慢升溫至90°C保溫15_30min進(jìn)行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調(diào)初始PH7.0-7.2，121-123°C滅菌30_40min備用。
[0034]發(fā)酵液中性蛋白酶酶活可達(dá)5500_7000U/mL，對酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了分析,將粗酶液分別置于40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C下，每隔10分鐘取樣測定酶活。40°C、45°C、50°C、55°C下，60分鐘酶活沒有下降。60°C與65°C下，30分鐘降到原有酶活的95%,60分鐘降到85%。70°C下，30分鐘降到原有酶活^ 85%,60分鐘降到80%。75°C下，30分鐘降到原有酶活的80%，60分鐘降到70%。
[0035]本發(fā)明中性蛋白酶在啤酒釀造和毛皮軟化行業(yè)中的應(yīng)用。
[0036]本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌1398-2-12是由實驗室保藏的一株產(chǎn)中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)1398_2經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選獲得。[0037]本發(fā)明提供的產(chǎn)強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的菌株具體為枯草芽孢桿菌1398-2-12。該菌株已于2013年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址:中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編:430072)，保藏號為CCTCC NO:M2013539，分類命名:枯草芽孢桿菌1398-2-12 (Bacillus subtilisl398_2_12)。
[0038]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 1398-2-12菌株特點如下:
[0039]所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運(yùn)動性的好氧菌。鏡檢為長桿狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P實驗成陽性。
[0040]有益效果:
[0041]1.本發(fā)明的中性蛋白酶發(fā)酵液酶活可達(dá)5500_7000U/mL，是出發(fā)菌株的2.5倍。在40-70°C之間具有較高的酶活，最適反應(yīng)溫度為70°C ;在pH值為4.5-8.5時酶活完全穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH值為7.2 ;該酶在70°C條件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，75°C條件下保存Ih后保持70%以上酶活。比現(xiàn)有的中性蛋白酶熱穩(wěn)定性強(qiáng)，酶活力較高，酶作用最適PH值范圍寬泛，儲存穩(wěn)定性高，特別適合反應(yīng)溫度高、蛋白分解與糖化、液化工藝并存的工業(yè)化需求。
[0042]2.本發(fā)明中的中性蛋白酶在制備過程中一方面采用溫度刺激發(fā)酵的方法，一方面對培養(yǎng)基實施全程優(yōu)化，添加了具有抗熱應(yīng)激原作用的黃芩、柴胡，使得所得的中性蛋白酶具有更好的穩(wěn)定性和保存活性。
[0043]3.本發(fā)明強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的制備方法中培養(yǎng)基的重要組成部分中草藥粉劑采用酶解工藝和水提醇沉工藝相結(jié)合，顯著提高了各種中草藥的有效成分，不僅增強(qiáng)了中草藥的作用效力，而且還 為微生物發(fā)酵提供了難得的營養(yǎng)物質(zhì)(如中藥多糖等)。
【具體實施方式】
[0044]下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0045]實施例1中性蛋白酶活力的測定
[0046](I)酶活單位的定義:lmL粗酶液，于70°C、pH7.2條件下，Imin分解酪蛋白產(chǎn)生
Iμ g酪氨酸，即定義為I個酶活單位(lU/ml )。
[0047](2)酶活力測定方法:分光光度法
[0048]①取5支試管，編號1、2、3、4、5，分別加入2ml酪蛋白溶液；
[0049]②向1、2、3號試管中加入1ml待測粗酶液，于70°C水浴中反應(yīng)10min ；
[0050]③向4、5號試管中加入1ml待測粗酶液；
[0051]④向5支試管中個加入2ml濃度為0.4mol/L的三氯乙酸(TCA)溶液，搖勻后沸水浴 5min ；
[0052]⑤水浴冷卻后，以4、5號試管為對照，測定1、2、3號在660nm下的吸光度；
[0053]⑥對照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活。[0054]實施例2
[0055]一種強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的制備方法，包括以下步驟:
[0056](I)菌種活化
[0057]將保存完好的枯草芽孢桿菌1398-2-12的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，33°C培養(yǎng)30h進(jìn)行菌種活化，如此活化2次；
[0058]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏6g,氯化鈉8g,蛋白胨15g,葡萄糖4g, (NH)2S044g,K2HP047g, CaCl22g，瓊脂 18g，中草藥粉劑 8g，蒸餾水 1000mL, pH 值 7.2，121°C滅菌 20min ；
[0059]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0060]稱取黃芪25份；黨參16份；柴胡12份；黃芩12份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至50°C，加入混合物料總重量8%的混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為6.0,酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:
1.2，控制溫度至70°C保持4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0061]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)葡聚糖酶15份，外β-葡聚糖酶15份，β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶12份，中性蛋白酶12份，酸性蛋白酶12份，超氧化物歧化酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份。
·[0062](2)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
[0063]①一級種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度33°C，培養(yǎng)時間12h ；
[0064]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0065]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度33°C，培養(yǎng)時間12h ；
[0066]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度33 °C，攪拌速度300rpm，通風(fēng)量(V/V) 1: 1.5，罐壓
0.05Mpa,培養(yǎng)時間15h ；
[0067]所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量百分比組成為:
[0068]酵母粉0.4%，葡萄糖1.2%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氫二鉀1.0%，中草藥粉劑1.8%，海藻糖2%，硫酸鈣lg，氯化鎂2g，檸檬酸鈉2g，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.2，121°C 滅菌 30min。
[0069]所述種子罐培養(yǎng)基重量百分比組成為:
[0070]麥芽糊精10%，酵母粉0.5%，中草藥粉劑1.8%，海藻糖2%，蛋白胨0.2%，玉米漿
0.3%，磷酸氫二鉀1.0%，硫酸鎂0.08%,檸檬酸鈉0.3%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.2，121°C 滅菌 30min。
[0071]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.5xl08個/ml ；
[0072](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0073]將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度35°C，攪拌速度400r/m，通風(fēng)量(V/V)l:2，培養(yǎng)時間12h ;然后以2V /h降溫速率緩慢降溫至12°C，恒溫培養(yǎng)18h ;繼續(xù)以2°C /h降溫速率緩慢降溫至4°C，此時，將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)25h ;最后以2°C /h升溫速率緩慢升溫至12°C，恒溫培養(yǎng)18h ;繼續(xù)以2 V /h升溫速率緩慢升溫至33 °C，恒溫培養(yǎng)18h ；
[0074]溶解氧控制:通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量，控制溶解氧20% ；
[0075]PH控制:通過補(bǔ)氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在7.2 ；
[0076]補(bǔ)料控制:添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，以維持發(fā)酵液還原糖含量為2_5mg/ml ；
[0077]放罐標(biāo)準(zhǔn):60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0078]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精100g，玉米粉55g，豆餅粉20g，中草藥粉劑40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑 0.5g,純凈水 1000mL, pH 值 7.2，121°C 滅菌 20min ；
[0079]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量百分比組成為:麥芽糊精25%，玉米粉15%，豆粉20%，中草藥劑粉8%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.2，121°C滅菌30min。
[0080]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調(diào)配方法為:[0081]按比例準(zhǔn)確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調(diào)節(jié)PH值7.2，加入中溫淀粉酶(311/^玉米粉)與高溫淀粉酶(3011/^玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫20min，然后緩慢升溫至90°C保溫20min進(jìn)行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調(diào)初始PH7.2，121°C滅菌30min備用。
[0082](4)發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶，所述調(diào)配過程加入濃縮酶液總重量3%中草藥粉劑。
[0083]實施例3:中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性分析
[0084]將實施例2 粗酶液分別置于 40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C下，每隔10分鐘取樣測定酶活。粗酶液401:、451:、501:、551:下，60分鐘酶活沒有下降。60°C與65°C下，30分鐘降到原有酶活的95%，60分鐘降到85%。70°C下，30分鐘降到原有酶活的85%,60分鐘降到80%。75。。下，30分鐘降到原有酶活的80%,60分鐘降到70%.[0085]實施例4:中性蛋白酶pH穩(wěn)定性分析
[0086]將實施例2粗酶液分別置于pH值3.5,4.5,5.5,6.5,7.5,8.5下，每隔10分鐘取樣測定酶活。粗酶液pH值5.5、6.5、7.5下，60分鐘酶活沒有下降。pH值4.5與8.5下，30分鐘降到原有酶活的95%，60分鐘降到85%。pH值3.5下，30分鐘降到原有酶活的80%，60分鐘降到70%。
【權(quán)利要求】
1.一種強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶，其特征在于，其酶學(xué)性質(zhì)如下: (1)溫度:該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，最適作用溫度為70°c，在40-70°C之間具有較高的酶活； (2)pH:該酶最適反應(yīng)pH值為7.2，在pH值為4.5-8.5時酶活完全穩(wěn)定； (3)酶活性:發(fā)酵液中性蛋白酶酶活可達(dá)5500-7000U/mL，是出發(fā)菌株的2.5倍； (4)熱穩(wěn)定性:該酶在70°C條件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，75°C條件下保存Ih后保持70%以上酶活； (5)存儲穩(wěn)定性:該酶在室溫下保存12個月后酶活損失小于2.5%。
2.如權(quán)利要求1所述的一種強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶，其特征在于，所述中性蛋白酶由枯草芽孢桿菌1398-2-12經(jīng)液體深層發(fā)酵制備，該菌種保藏編號為:CCTCC M2013539。
3.如權(quán)利要求2所述的一種強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶，其特征在于，所述中性蛋白酶的制備方法如下:枯草芽孢桿菌1398-2-12經(jīng)菌種活化和逐級擴(kuò)大培養(yǎng)獲得液體種子；將液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30-36°C，攪拌速度200-700r/m，通風(fēng)量(V/V)1:1-3,培養(yǎng)時間10-15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15_20h ；繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C，恒溫培養(yǎng)15_20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-36°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得固體中性蛋白酶；所述調(diào)配過程加入濃縮酶液總重量0.5-5%中草藥粉劑。
4.如權(quán)利要求3所述的一種強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基重量百分比組成為:酵母粉0.3-0.5`%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸鈣lg，氯化鎂2g，檸檬酸鈉l_3g，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.0-7.2。
5.如權(quán)利要求3所述的一種強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶，其特征在于，所述種子罐培養(yǎng)基重量百分比組成為:麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1_3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米漿0.1-0.5%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，硫酸鎂0.05-0.1%，檸檬酸鈉0.1-0.5%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值7.0-7.2。
6.如權(quán)利要求3所述的一種強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶，其特征在于，所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為 7.0x108-8.0xlO8 個 /ml。
7.如權(quán)利要求3所述的一種強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆餅粉15-25g，中草藥粉劑30_50g，海藻糖30-40g,酵母粉4-8g，玉米漿l-5g，硫酸銨l-3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉 l-5g,消泡劑 0.Ι-lg,純凈水 1000mL, pH 值 7.0-7.2。
8.如權(quán)利要求3-7任一所述的一種強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶，其特征在于，所述中草藥粉劑的制備方法如下:稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10-15份；黃芩10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70 V -90°C保持2-4h，然后降溫至45-60°C，加入混合物料總重量5-10%的混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)PH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1-1.5，控制溫度至60°C -78°C保持3-4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
9.如權(quán)利要求8所述的一種強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶，其特征在于，所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5-10份，葡萄糖氧化酶5_10份，酸性磷酸酶5-10份。
10.如權(quán)利要求1或2所述的一種強(qiáng)熱穩(wěn)定性中性蛋白酶在啤酒釀造和毛皮軟化行業(yè)中的應(yīng)用 。
【文檔編號】C12N9/56GK103865907SQ201310683868
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】李海清, 胡永明, 辜承蘭, 周玉明, 封章平, 劉德鳳 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司