一種利用綠藻將纖維素轉化為油脂的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用綠藻將纖維素轉化為油脂的方法，所述綠藻是從橡膠樹分離出來的單細胞綠藻，被命名為海南橡藻（Heveochlorella?hainangensis），已于2013年1月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號：CGMCC?NO：7101；利用海南橡藻（Heveochlorella?hainangensis）在含纖維素的培養(yǎng)基中，置于黑暗條件下培養(yǎng)，誘導產生纖維素酶，降解纖維素，獲取碳源，從而生長繁殖，積累油脂。本發(fā)明所提供的海南橡藻具有可培養(yǎng)、生長周期短等特點，有較強的降解纖維素的能力，同時可積累油脂，為秸稈等纖維素質轉化為生物能源提供了新途徑，具有潛在的商業(yè)價值和重要的理論實踐意義。
【專利說明】一種利用綠藻將纖維素轉化為油脂的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬微生物領域，具體的說，涉及一種利用綠藻將纖維素轉化為油脂的方法，尤其涉及誘導綠藻纖維素酶基因表達，降解纖維素，合成油脂。
【背景技術】
[0002]隨著礦物能源消耗和生態(tài)環(huán)境問題的日益嚴重，研究、開發(fā)和利用可再生能源是人類社會、經濟發(fā)展的大勢所趨。生物質能源作為可再生能源的重要組成部分，越來越受到世界各國的重視。2007年，我國發(fā)布《可再生能源中長期發(fā)展規(guī)劃》，明確將生物質能源作為我國可再生能源發(fā)展的重點領域，力爭到2020年生物質發(fā)電達到3000萬千瓦，沼氣年利用總量達到443億立方米，燃料乙醇的年生產能力達到1000萬噸，生物柴油的年生產能力達到200萬噸。
[0003]然而，實現(xiàn)上述目標并不是一件容易的事情。由于發(fā)展生物燃料需要消耗一定量的農作物，在目前還沒有大規(guī)模發(fā)展的今天，生物燃料已經產生了與食物“爭地盤”的矛盾，使糧食和食用油的價格大幅上漲。例如，馬來西亞和印度尼西亞一直是世界領先的棕櫚油生產國，由于利用棕櫚油生產生物柴油，造成食用油價格大幅上漲。美國雖然是糧食出口大國，近年由于發(fā)展生物乙醇，其玉米期貨價格在2007年上漲75%。因此，如何解決吃飽肚子和發(fā)展生物能源的矛盾是各國決策者需要面對的難題。
[0004]“吃飽肚子”是人類和平發(fā)展的基本條件，開發(fā)利用生物質能源是人類可持續(xù)發(fā)展的科技支撐，勢在必行。緩解二者之間矛盾的途徑之一是開放利用包括農作物秸桿在內的纖維素質生物質。秸桿露天焚燒是我國農村“頑疾”，產生的大量煙霧不僅污染空氣，還嚴重影響能見度。據統(tǒng)計，我國每年產生秸桿7.2億噸，40%還田作肥料，剩下的都一燒了之。因此，秸桿是最具開發(fā)潛力的綠色可再生能源之一。國內外對于纖維素質轉化為生物質能源的研究已開展了半個世紀。然而·，主要研究集中在將纖維素轉化為乙醇，極少研究將纖維素轉化為油脂，尤其沒有利用綠藻將纖維素一步法轉化為油脂的報道。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種利用綠藻將纖維素轉化為油脂的方法。
[0006]本發(fā)明所提供的綠藻，是從橡膠樹分離出來，是目前唯一從橡膠樹中分離的單細胞綠藻，被命名為海南橡藻(Heveochlorella hainangensis)。該藻細胞呈圓球狀，直徑
3.8-8.7 μ m，與已知的綠藻在顯微、超顯微結構以及DNA序列上存在顯著差異，分子系統(tǒng)進化分析結果表明該藻為一新種，代表一個新的屬。
[0007]海南橡藻(Heveochlorella hainangensis)已于2013年1月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏號:CGMCC NO:7101,名稱為:Heveochlorella hainangensis。
[0008]海南橡藻(Heveochlorella hainangensis)在含纖維素的培養(yǎng)基中，置于黑暗條件下培養(yǎng)，誘導產生纖維素酶，降解纖維素，獲取碳源，從而生長繁殖，積累油脂。[0009]本發(fā)明所提供的海南橡藻(Heveochlorella hainangensis)具有可培養(yǎng)、生長周期短等特點，有較強的降解纖維素的能力，同時可積累油脂，為秸桿等纖維素質轉化為生物能源提供了新途徑，具有潛在的商業(yè)價值和重要的理論實踐意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為海南橡藻在含纖維素培養(yǎng)基上培養(yǎng)降解纖維素的顯色圖(纖維素被降解后形成退色的透明圈)；
[0011]A:在光照條件下，海南橡藻纖維素酶基因不表達，不形成退色圈；
[0012]B:在黑暗條件下，海南橡藻纖維素酶基因表達，形成退色圈。 【具體實施方式】
[0013]下面結合實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0014]實施例一、剛果紅顯色法確認海南橡藻能在黑暗條件下降解纖維素
[0015]所用培養(yǎng)基為纖維素一MS剛果紅培養(yǎng)基，具體配方如下JHJC^ieSOmgL'KN031900mgL_1, KH2P041 70mgL' CaCl2.2H20440mgL' MgS04.7H20370mgL'FeS04.7H2027.8mgL' Na2EDTA37.3gL' MnS04.4H2022.3mgL' ZnS04.7H208.6mgL'H3BO36.2mgL_1, KI0.83mgL_1, Na2Mo04.2H200.25mgL_1, CuS04.5H200.025mgL_1,CoCl2.6H200.0025mgL'肌醇lOOmgL'甘氨酸2mgL'鹽酸硫胺素0.4mgL'鹽酸吡卩多素0.5mgL'煙酸0.5mgL'鹿糖10-30mgL'羧甲基纖維素鈉20gL'剛果紅200mgL'瓊脂粉9gL-1，ρΗ=6.2。
[0016]將繼代培養(yǎng)的海南橡藻接種至培養(yǎng)基平板中央，放置于黑暗條件26°C培養(yǎng)，以光照培養(yǎng)為對照。培養(yǎng)4-10d，在黑暗條件下培養(yǎng)的海南橡藻周圍開始產生水解退色透明圈(圖1B)，光照條件下培養(yǎng)的不形成退色圈(圖1A)。形成水解退色圈的原理是，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復合物，使培養(yǎng)基呈紅色。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅一纖維素的復合物就無法形成，因而培養(yǎng)基中出現(xiàn)以橡藻為中心的退色透明圈，這表明橡藻在暗條件下能產生纖維素酶。
[0017]實施例二、在含纖維素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)海南橡藻
[0018]所用的液體培養(yǎng)基為添加梭甲基纖維素的MS培養(yǎng)基，具體配方如下:NH4N031650mgL'KN031900mgL'KH2P04170mgL'CaCl2.2H20440mgL'MgS04.7H20370mgL'FeS04.7H2027.8mgL' Na2EDTA37.3gL' MnS04.4H2022.3mgL' ZnS04.7H208.6mgL'H3BO36.2mgL_1, KI0.83mgL_1, Na2Mo04.2H200.25mgL_1, CuS04.5H200.025mgL_1,CoCl2.6H200.0025mgL'肌醇lOOmgL'甘氨酸2mgL'鹽酸硫胺素0.4mgL'鹽酸吡卩多素0.5mgL'煙酸0.5mgL'葡萄糖或者鹿糖SOmgl/1以下、羧甲基纖維素鈉20-4(^17^11=6.2。
[0019]將經平板活化的海南橡藻藻種接種在500mL三角瓶中(含200mL上述已滅菌的培養(yǎng)基)，26°C黑暗條件下120r/min振蕩預培養(yǎng)10d，然后以2%接種濃度接種至50L的發(fā)酵罐(LP351，瑞士比歐)(含30L上述已滅菌的培養(yǎng)基)，26°C在暗條件下120r/min振蕩或靜止培養(yǎng)10d，收集藻細胞。[0020]油脂提取和含量測定:
[0021]用改良的酸水解法提取油脂。具體方法是:將實施例二中所收集到的藻細胞進行冷凍干燥，稱取冷凍干燥后的藻粉lg，置于50mL的帶蓋離心管，加入4mL滅菌蒸餾水，混勻后加入5mL鹽酸，將離心管置于70-80°C水浴20min，取出離心管，加入5mL95%的乙醇，混勻。冷卻后加入10mL乙醚，加蓋振搖lmin,小心開蓋，放出氣體。4000r/min離心2min,吸出上清液于已恒重的錐形瓶內，再加5mL乙醚于離心管中，加蓋振搖lmin，4000r/min離心2min萃取2次，將上清液吸出于原錐形瓶中。將錐形瓶置于水浴鍋上蒸干，置于95_105°C烘箱中干燥2h，取出冷卻后稱重。其中，粗油重量=藻粉干重-提取后藻粉干重，油脂含量％=粗油重量/藻粉干重X 100。試驗重復5次。結果見表1。
[0022]表1海南橡藻油脂含量的測定
[0023]
【權利要求】
1.一種綠藻,是從橡膠樹分離出來的單細胞綠藻，被命名為海南橡藻(Heveochlorellahainangensis),已于2013年1月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏號:CGMCC NO:7101,名稱為:Heveochlorella hainangensis。
2.一種利用綠藻將纖維素轉化為油脂的方法，其特征在于:是將權利要求1所述的海南橡藻(Heveochlorella hainangensis)在含纖維素的培養(yǎng)基中，置于黑暗條件下培養(yǎng)，誘導產生纖維素酶，降解纖維素，獲取碳源，從而生長繁殖，積累油脂。
【文檔編號】C12N1/12GK103667067SQ201310680770
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月13日 優(yōu)先權日:2013年12月13日
【發(fā)明者】張家明, 譚德冠, 付莉莉, 孫雪飄 申請人:中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所