一種新型高度敏感的細(xì)胞內(nèi)潛伏的人巨細(xì)胞病毒檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新型、高度敏感的人巨細(xì)胞病毒檢測(cè)方法，此方法是提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞的核酸，使用特異性外側(cè)上下游引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，以第一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用特異性內(nèi)側(cè)上下游引物進(jìn)行第二輪定量PCR擴(kuò)增的巢式定量PCR技術(shù)，不但可檢測(cè)游離的人巨細(xì)胞病毒，而且可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)感染的人巨細(xì)胞病毒。使用本發(fā)明檢測(cè)HCMV的靈敏度可以達(dá)到8copies/μl。本發(fā)明應(yīng)用PCR方法檢測(cè)HCMV病毒潛伏感染的方法較ELISA方法具有快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，為臨床提供一種早發(fā)現(xiàn)、早診斷的方法。
【專利說(shuō)明】一種新型高度敏感的細(xì)胞內(nèi)潛伏的人巨細(xì)胞病毒檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和微生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種新型、高度敏感的細(xì)胞內(nèi)潛伏的人巨細(xì)胞病毒檢測(cè)方法，可以在臨床檢驗(yàn)及相關(guān)研究中應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人類巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)屬皰疫病毒科β屬雙鏈線性DNA病毒，具廣泛細(xì)胞親嗜性，能感染上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等。人群HCMV人群感染十分普遍，90%以上的成年人都感染HCMV，絕大多數(shù)屬于無(wú)癥狀感染。但新生兒宮內(nèi)感染或圍產(chǎn)期感染，常造成流產(chǎn)、死胎、胎兒畸形、發(fā)育遲緩、聽力障礙、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲緩等。潛伏感染是HCMV重要生物學(xué)特征，一旦感染即可終生存在人體內(nèi)。由于機(jī)體生理或病理狀態(tài)變化，潛伏體內(nèi)的HCMV可反復(fù)激活，進(jìn)入增殖性感染階段，對(duì)免疫力低下個(gè)體(如組織器官移植個(gè)體或艾滋病患者等)可嚴(yán)重威脅生命。因此建立一種高度敏感特異的細(xì)胞內(nèi)潛伏的人巨細(xì)胞病毒檢測(cè)方法至關(guān)重要。
[0003]目前對(duì)于人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的檢測(cè)方法主要有病毒分離、ΡΡ65抗原檢測(cè)、血清IgM, IgG抗體檢測(cè)、核酸檢測(cè)等方法。HCMV診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是HCMV分離培養(yǎng)，但是HCMV在體外人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中增殖非常緩慢， 復(fù)制周期為36-48h。HCMV初次分離培養(yǎng)，需一個(gè)多月才出現(xiàn)特殊的細(xì)胞，即細(xì)胞腫脹變圓、細(xì)胞及核巨大化、核周出現(xiàn)一輪“暈”的大型嗜酸性包涵體。金標(biāo)準(zhǔn)耗時(shí)，操作繁瑣，設(shè)備要求高，但不能用于早期檢測(cè)，而且即使分離結(jié)果陰性并不能完全除外HCMV活動(dòng)性感染，因此不適于作為檢測(cè)HCMV感染的常用方法?，F(xiàn)在臨床上HCMV感染的診斷主要依賴于抗體血清學(xué)(IgG、IgM)檢測(cè)或血清抗原(PP65)檢測(cè)。血清學(xué)檢測(cè)方便簡(jiǎn)捷，但容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，易受高濃度類風(fēng)濕因子的干擾。而且HCMV感染細(xì)胞譜廣，血清學(xué)診斷難以明確感染部位，經(jīng)過(guò)激素和(或)免疫抑制劑治療后，HCMV感染可能不出現(xiàn)或延遲出現(xiàn)IgM類抗體反應(yīng)。EBV感染的病人CMV IgM檢測(cè)陽(yáng)性，因?yàn)镃MV與EBV均為皰疹病毒科，CMV IgM檢測(cè)方法存在交叉反應(yīng)。HCMV pp65抗原檢測(cè)是早期診斷HCMV活動(dòng)性感染的較敏感指標(biāo)，但技術(shù)要求較高，敏感性較核酸檢測(cè)低且費(fèi)時(shí)，且很難確定HCMV在組織、細(xì)胞中的潛伏感染。熒光定量PCR方法是近年來(lái)新興的一種技術(shù)，有文獻(xiàn)報(bào)道的可用于real-time PCR檢測(cè)HCMV感染的靶基因有:pp65基、UL54、UL83、UL123、US17基因、UL75等。目前唯一商品化的人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光法)選擇的是HCMV AD169病毒株中IEl基因的一高度保守的非編碼區(qū)為擴(kuò)增靶區(qū)域，但是檢測(cè)敏感性尚待商榷。這些用于real-time PCR檢測(cè)的基因檢測(cè)陽(yáng)性只能代表HCMV增殖感染，對(duì)于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)潛伏的HCMV不敏感，不能真實(shí)反映人體內(nèi)HCMV感染的情況。
[0004]近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)了一些HCMV潛伏相關(guān)的HCMV基因，如CLTs (cytomegaloviruslatency transcripts) , LUNA (latent undefined nuclear antigen; UL81 - 82as) ,ULlllA以及UL133-UL138基因簇。但尚無(wú)研究分析這些基因在臨床標(biāo)本中的表達(dá)。為此，本發(fā)明通過(guò)對(duì)這些候選基因的分析，確定UL138作為目的檢測(cè)基因，建立一種高度敏感特異的細(xì)胞內(nèi)潛伏的人巨細(xì)胞病毒檢測(cè)方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明專利的目的是對(duì)于HCMV潛伏感染的細(xì)胞中得到的樣品，提供一種新型、高度敏感的細(xì)胞內(nèi)潛伏的人巨細(xì)胞病毒檢測(cè)方法。此方法克服了常規(guī)方法的上述問題，應(yīng)用此方法檢測(cè)HCMV感染的敏感性和特異性較高，檢測(cè)結(jié)果可靠，且可以反映細(xì)胞內(nèi)HCMV潛伏感染的情況。
[0006]本發(fā)明專利的目的是對(duì)于HCMV潛伏感染的細(xì)胞中得到的樣品，提供一種新型、高度敏感的細(xì)胞內(nèi)潛伏的人巨細(xì)胞病毒檢測(cè)方法。此方法克服了常規(guī)方法的上述問題，應(yīng)用此方法檢測(cè)HCMV感染的敏感性和特異性較高，檢測(cè)結(jié)果可靠，且可以反映細(xì)胞內(nèi)HCMV潛伏感染的情況。
[0007]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明首先要選擇目的檢測(cè)基因。根據(jù)核苷酸同源性分析顯示，與其他HCMV潛伏相關(guān)的基因相比，18株HCMV病毒株的UL138基因同源性在96.47-100%,說(shuō)明UL138在不同的HCMV病毒株之間存在很高的同源性(圖1)，可作為檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)人巨細(xì)胞病毒潛伏感染的新的候選基因。考慮到健康人外周血CD16+的單核細(xì)胞前體是HCMV潛伏的細(xì)胞，為分析UL138是否合適作為臨床標(biāo)本中細(xì)胞內(nèi)HCMV潛伏感染的指標(biāo)，本發(fā)明分離外周血白細(xì)胞，并抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行巢式定量PCR，預(yù)計(jì)大小PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2A)，熔解曲線單峰(圖2B)，連接T載體進(jìn)行測(cè)序(圖2C)，驗(yàn)證了 UL138作為臨床標(biāo)本細(xì)胞內(nèi)HCMV檢測(cè)。
[0008]在達(dá)到上述目的后，為對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行方便的檢測(cè)和定量，需要對(duì)上述擴(kuò)增的序列存在進(jìn)行檢測(cè)的同時(shí)，檢測(cè)其拷貝數(shù)。本發(fā)明進(jìn)一步合成UL138全長(zhǎng)序列，并克隆到pcDNA3.l-zeo(+)質(zhì)粒載體上(圖3A)，測(cè)定濃度并換算成拷貝數(shù)，系列稀釋。根據(jù)前述的巢式PCR，將第二輪的PCR用定量PCR替代，檢測(cè)不同模板量的PCR產(chǎn)物熒光強(qiáng)度(圖3B)，建立不同稀釋度的檢測(cè)值(即標(biāo)準(zhǔn)曲線)(圖3C)。根據(jù)本發(fā)明提供的方法，可檢測(cè)Scopies/μ I的HCMV目的基因。以此標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)范圍，判定待測(cè)標(biāo)本的目的基因含量，從而判定標(biāo)本是否存在HCMV潛伏感染。
[0009]為驗(yàn)證本發(fā)明的敏感性和特異性，相同的標(biāo)本平行進(jìn)行了國(guó)內(nèi)臨床使用的定量PCR試劑盒檢測(cè)，相同個(gè)體的血清標(biāo)本同步進(jìn)行了目前國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)的羅氏公司電化學(xué)發(fā)光法試劑盒檢測(cè)HCMV特異性IgG和IgM。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的HCMV感染方法與HCMV IgG檢測(cè)結(jié)果有高度的一致性和敏感性，明顯高于國(guó)內(nèi)臨床使用的定量PCR試劑盒(圖4)。
[0010]本發(fā)明不但提供了 HCMV潛伏感染檢測(cè)的UL138基因，而且提供了一種檢測(cè)HCMV潛伏感染的方法，即巢式PCR。此方法提取人外周血白細(xì)胞內(nèi)HCMV的DNA或HCMV的mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，使用病原特異性外側(cè)上下游引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，以第一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，使用病原特異性內(nèi)側(cè)上下游引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。本發(fā)明以外周血白細(xì)胞內(nèi)HCMV潛伏感染的檢測(cè)作為實(shí)例說(shuō)明，但本發(fā)明亦可檢測(cè)其他細(xì)胞內(nèi)潛伏感染的HCMV，甚至游離存在的HCMV。所使用到的儀器有PCR擴(kuò)增儀，移液器，超速低溫離心機(jī)，電泳儀，定量PCR儀、水浴箱。所使用的主要試劑有Taq聚合酶，SYBR Green定量PCR試劑、上下游引物。
[0011]本發(fā)明相比現(xiàn)有的技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):
(I)本發(fā)明選擇的檢測(cè)基因具高度保守性通過(guò)對(duì)18株HCMV病毒株UL138基因的同源性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)同源性在96.47-100，說(shuō)明UL138在不同的HCMV病毒株之間存在很高的同源性(圖1)，可作為檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)人巨細(xì)胞病毒潛伏感染的新的候選基因。
[0012](2)本發(fā)明檢測(cè)HCMV感染敏感性和特異性分析
表2 本發(fā)明檢測(cè)HCMV感染方法與HCMV IgG (羅氏公司電化學(xué)發(fā)光法試劑盒)檢測(cè)方法的比較
【權(quán)利要求】
1.一種高度敏感的細(xì)胞內(nèi)潛伏感染的人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,以下縮寫為HCMV)檢測(cè)方法，其特征在于:提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞中的核酸，使用特異性外側(cè)上下游引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，以第一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用特異性內(nèi)側(cè)上下游引物進(jìn)行第二輪定量PCR擴(kuò)增，以提高檢測(cè)的敏感性及特異性。
2.如權(quán)利要求1所述的新型高度敏感的檢測(cè)方法，其特征在于:其中前期樣品中的核酸來(lái)自HCMV的UL138基因，可以是抽提的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA，也可以是抽提的DNA。
3.如權(quán)利要求1所述的新型高度敏感的檢測(cè)方法，其特征在于:其中用于人巨細(xì)胞病毒核酸檢測(cè)的內(nèi)外側(cè)引物序列分別為以下編號(hào)所示的序列或至少包含這些序列10個(gè)連續(xù)性堿基構(gòu)成的寡核苷酸: 外側(cè)上游引物:5’ -ATGGACGATCTGCCGCTGAA-3’(Seq N0.1) 外側(cè)下游引物:5’ -TCACGTGTATTCTTGATGAT-3’(Seq N0.2) 內(nèi)側(cè)上游引物:5 ’ -GCTTACCACTGGCACGACACCT-3，(Seq N0.3) 內(nèi)側(cè)下游引物:5 ’ -TACTCCCCGTACAGCTCGCAAC-3，(Seq N0.4 )。
4.如權(quán)利要求1所述的新型高度敏感的檢測(cè)方法，其特征在于:其中第一輪PCR的反應(yīng)體系是:10 XPCR緩沖液2.5 μ L, dNTPs (2mM) 2.5 μ L，外側(cè)上下游引物(10 μ Μ)各I μ L，病毒模板IuL, Taq DNA聚合酶(I U/ μ L) 0.5 μ L,滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μ L。
5.如權(quán)利要求1所述的新型高度敏感的檢測(cè)方法，其特征在于:檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒核酸時(shí)第一輪的PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95°C 5min，循環(huán)95°C 30s，57°C 30s，72°C Imin共35個(gè)循環(huán)，延伸72°C IOmin。
6.如權(quán)利要求1所述 的新型高度敏感的檢測(cè)方法，其特征在于:其中第二輪定量PCR的反應(yīng)體系是:2X SYBR Green PCR混合緩沖液10 μ L，內(nèi)側(cè)上下游引物(10 μ Μ)各0.8 μ L,plus solution 2 μ 1，第一輪PCR擴(kuò)增病毒核酸產(chǎn)物模板DNA I μ L，，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μ L0
7.如權(quán)利要求1所述的新型高度敏感的檢測(cè)方法，其特征在于:檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒核酸時(shí)第二輪的定量PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95°C 5min，循環(huán)95°C 30s, 57°C 30s, 72°CImin共40個(gè)循環(huán)。
8.如權(quán)利要求1所述的新型高度敏感的檢測(cè)方法，其特征在于:不但可用于細(xì)胞內(nèi)潛伏的HCMV檢測(cè),而且可用于游離HCMV的檢測(cè)。
9.如權(quán)利要求3所述的新型高度敏感的檢測(cè)方法，其特征在于:任一寡核苷酸的HCMV檢測(cè)試劑盒及定量試劑盒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103627822SQ201310680241
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】薛向陽(yáng), 陳靜, 張麗芳, 陳文靜, 葉璐璐 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)科大學(xué)