胍基化的含二硫鍵聚氨基胺類聚合物及其制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及胍基化的含二硫鍵聚氨基胺類基因載體聚合物及其制備和應(yīng)用。所述的胍基化的含二硫鍵聚氨基胺類基因載體聚合物，是由具有雙丙烯酰結(jié)構(gòu)的交聯(lián)劑和胍基化試劑依次通過(guò)，苯磺酰氯類對(duì)胍基的保護(hù)反應(yīng)，麥克爾加成聚合，脫去苯磺酰氯類胍基保護(hù)試劑的保護(hù)而最終制得的。聚合物基因載體能夠和不同種類基因片段自組裝成復(fù)合物，具有良好生物膜透過(guò)性，細(xì)胞內(nèi)還原響應(yīng)性降解，及核定位效應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)控制胍基化試劑的種類、在聚合物中的比例以及分子量的大小來(lái)調(diào)整載體對(duì)基因片段的包載能力和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。該類胍基化的SS-PAAs基因載體，可以提高基因的轉(zhuǎn)染效率，并能降低的細(xì)胞毒性，是基因治療過(guò)程中一種新型的基因載體。
【專利說(shuō)明】胍基化的含二硫鍵聚氨基胺類聚合物及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物制劑新輔料和生物制劑新劑型領(lǐng)域，涉及胍基化的含二硫鍵聚氨基胺類聚合物及其制備和應(yīng)用，該載體含二硫鍵，并具有良好膜透性和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境還原敏感性，以及擬肽核定位效應(yīng)。
【背景技術(shù)】
[0002]基因治療作為一種新興的腫瘤治療手段，近20年來(lái)，獲得了醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)＜业膹V泛青睞，成為了抗腫瘤藥物研發(fā)的重要組成部分?；蛑委熂夹g(shù)已經(jīng)從導(dǎo)入期進(jìn)入到成長(zhǎng)期，具有以下明顯優(yōu)勢(shì):(I)能夠針對(duì)疾病發(fā)生、發(fā)展的原因治療，有望實(shí)現(xiàn)疾病的根本治愈；
[2]基于核苷酸的互補(bǔ)配對(duì)原則，具有一定的天然靶向性；(3)和傳統(tǒng)化學(xué)藥物相比，具有較低的毒副作用。
[0003]基因治療作為一種處于成長(zhǎng)期的應(yīng)用技術(shù)，有多種實(shí)施技術(shù)路線，如此多的技術(shù)路線有著不同的原理，這就意味著我們很難用一種通用載體實(shí)現(xiàn)基因治療藥物的體內(nèi)傳遞；目前臨床廣泛應(yīng)用的是基于腺病毒的病毒類載體，其在體循環(huán)穩(wěn)定性和長(zhǎng)期安全性方面存在著一定的問(wèn)題。
[0004]所以非病毒類基因載體是目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，盡管非病毒類基因載體取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但仍然存在著轉(zhuǎn)染效率低，體循環(huán)穩(wěn)定性差，和基因釋放效率低等問(wèn)題。解決這些問(wèn)題目前主要采取增加載體細(xì)胞膜透過(guò)性(如，通過(guò)引入氨基基團(tuán)增加表面正電荷密度等)和加速細(xì)胞內(nèi) 載體釋放目的基因(如，載體胞內(nèi)的還原響應(yīng)性等)兩個(gè)策略；但是前一策略的實(shí)施與降低載體的細(xì)胞毒性之間實(shí)際上存在矛盾關(guān)系，難以逾越。
[0005]針對(duì)非病毒類基因載體面臨的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題，本發(fā)明構(gòu)建了胍基化的SS_PAAs(含二硫鍵的聚氨基胺類)聚合物作為基因轉(zhuǎn)運(yùn)的載體。除了保留原有載體主鏈的二硫鍵(具有在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的還原響應(yīng)性)以外，更重要的是主鏈的胍基化，使得該類載體具有較好的膜透過(guò)性并且細(xì)胞毒性較小，同時(shí)具有精確的核定位效應(yīng)?，F(xiàn)有技術(shù)中并沒(méi)有該載體的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種含有二硫鍵的胍基化聚氨基胺類聚合物(SS-PAAs)。此類聚合物在生理?xiàng)l件下能夠和目的基因片段(cDNA，microRNA, siRNA，質(zhì)粒DNA,反義寡核苷酸等)形成復(fù)合物，由于其主鏈富含氨基和胍基官能團(tuán)能夠高效率的透過(guò)生物膜，主鏈中二硫鍵的存在使其具有胞內(nèi)還原響應(yīng)性，此外主鏈特殊的空間結(jié)構(gòu)及類似精氨酸中的胍基官能團(tuán)賦予其精確的核定位效應(yīng)，因此該類聚合物能夠?qū)崿F(xiàn)高效率的基因跨膜傳遞，細(xì)胞內(nèi)還原響應(yīng)性釋放，及良好的核定位效應(yīng)，成為新一代高轉(zhuǎn)染效率，低細(xì)胞毒性的基因治療藥物載體。可以作為基因治療藥物的多功能載體進(jìn)行藥物傳遞。
[0007]本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0008]本發(fā)明的聚合物結(jié)構(gòu)如下:
[0009]所述的聚合物是N，N-雙(丙烯酰)胱胺(CBA)單體和胍基化試劑的2，2，4，6，7_五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰氯(Pbf-Cl)保護(hù)產(chǎn)物聚合而成的均聚物或共聚物，并最終脫去Pbf-Cl的保護(hù)。所述的胍基化試劑選自胍、氯己定、胍基丁胺、聚六亞甲基雙胍或它們的鹽，胍、氯己定、胍基丁胺、聚六亞甲基雙胍的分子量分別為59.07,505.45，130.27，≥2500，他們?cè)诰酆衔镏械谋壤秊?0-70%。
[0010]當(dāng)胍基化試劑為鹽酸胍時(shí)，其在聚合物中的比例為30-70% ;為氯己定時(shí)，其在聚合物中的比例為30-70%;為胍基丁胺時(shí)，其在聚合物中的比例為50%;為聚六亞甲基雙胍時(shí)，在聚合物中比例為50%。
[0011]本發(fā)明同時(shí)提供了胍基化聚氨基胺類聚合物(SS-PAAs)的制備方法。
[0012]其制備方法如下:
[0013]a.通過(guò)磺酰氯類對(duì)胍基的保護(hù)反應(yīng)，將胍基化試劑中的胍基保護(hù)起來(lái)；
[0014]b.通過(guò)麥克爾加成聚合反應(yīng)，將CBA單體交聯(lián)劑聚合到各胍基單體中的伯胺或仲氨胺基團(tuán)上；
[0015]c.酸性條件下脫去Pbf-Cl保護(hù)基團(tuán)。
[0016]其中，步驟a中Pbf-Cl對(duì)各單體中胍基的保護(hù)反應(yīng)，反應(yīng)介質(zhì)為能溶解反應(yīng)物的各種有機(jī)溶劑或混合溶劑體系，包括丙酮、甲醇、N，N- 二甲基甲酰胺或任意一種與水組成的混合溶劑。反應(yīng)開(kāi)始滴加Pbf-Cl丙酮溶液時(shí)，溫度控制在0°C以下，滴加完畢后，反應(yīng)在室溫、堿性條件下進(jìn)行1-4小時(shí)。
[0017]步驟b中，麥克爾加成聚合反應(yīng)可以采用各種有機(jī)堿作催化劑，加速反應(yīng)進(jìn)行，如，加入乙醇鈉，也可以不加入催化劑；反應(yīng)于30-65°C，避光氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下進(jìn)行，所需時(shí)間依據(jù)是否使用催化劑，和胍基單體種類不同，從I天至6天不等。所述的交聯(lián)劑N，N-雙(丙烯酰)胱胺(CBA)，分子量為260.38，在聚合物中的比例為30_70%。加成聚合反應(yīng)的溶劑為甲醇、N，N- 二甲基甲酰胺、7JC，或任意二者的混合溶劑。
[0018]步驟c中，脫保護(hù)反應(yīng)中酸可以選擇三氟乙酸(TFA)、氫氟酸、硫酸、鹽酸。反應(yīng)在室溫條件下進(jìn)行1-4小時(shí)。所述的溶劑為N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、水、甲醇以及任意兩者的混合溶劑。
[0019]下面以鹽酸胍或胍基丁胺的Pbf-Cl保護(hù)產(chǎn)物為例，來(lái)說(shuō)明胍基單體與CBA聚合反應(yīng)制備胍基化SS-PAAs的方法。
[0020]1、鹽酸胍/胍基丁胺-CBA的制備
[0021]本發(fā)明中的聚合物分子量為2.5KDa以上，是通過(guò)具有雙丙烯酰結(jié)構(gòu)的CBA同含有伯氨基或兩個(gè)仲氨基的胍基化試劑進(jìn)行麥克爾加成聚合完成的。
[0022]本發(fā)明的鹽酸胍/胍基丁胺-CBA的分子式如下:
[0023]
【權(quán)利要求】
1.胍基化的含二硫鍵的聚氨基胺類，其特征在于，其結(jié)構(gòu)和分子量如下:
2.如權(quán)利要求1所述的胍基化的含二硫鍵的聚氨基胺類聚合物的制備方法，其特征在于通過(guò)如下步驟制備:` 通過(guò)磺酰氯類對(duì)胍基的保護(hù)反應(yīng)，對(duì)胍基化試劑中的胍基進(jìn)行保護(hù)； 通過(guò)麥克爾加成聚合反應(yīng)將交聯(lián)劑聚合到胍基單體中的伯胺或仲氨基團(tuán)上； 在酸性條件下，將麥克爾加成聚合反應(yīng)產(chǎn)物脫去保護(hù)基團(tuán)，透析純化后，干燥，除去反應(yīng)體系中的溶劑，即得終產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟a中苯磺酰氯類保護(hù)試劑為，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰氯(Pbf-Cl )，反應(yīng)開(kāi)始滴加保護(hù)試劑的丙酮溶液時(shí)，溫度控制在0°C以下，滴加完畢后，反應(yīng)在室溫、堿性條件下進(jìn)行1-4小時(shí)聚合物中的比例為30-70%o
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟b中麥克爾加成聚合反應(yīng)溶劑，是甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、水，或任意二者的混合溶劑，反應(yīng)于30-65°C，避光氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下進(jìn)行，所需時(shí)間依據(jù)是否使用催化劑，和胍基單體種類不同，從I天至6天不等，步驟c中，酸為三氟乙酸、氫氟酸、硫酸、鹽酸，反應(yīng)在室溫條件下進(jìn)行1-4小時(shí)，溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、水、甲醇或任意兩者的混合溶劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的胍基化試劑為胍、氯己定、胍基丁胺、聚六亞甲基雙胍四種或它們的鹽，且在聚合物中的比例為30-70%。
6.權(quán)利要求1所述的胍基化的含二硫鍵的聚氨基胺類聚合物在轉(zhuǎn)運(yùn)基因中的應(yīng)用。
7.基因/聚氨基胺類聚合物復(fù)合物，其特征在于，權(quán)利要求1的聚合物與基因片段在緩沖溶液中室溫條件下孵育5-30分鐘，采用自組裝法制備。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的胍基化SS-PAAs基因/載體復(fù)合物，其特征在于，孵育用緩沖溶液為JEPES緩沖液、磷酸鹽緩沖液、枸櫞酸緩沖液、無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)液或含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的復(fù)合物，其特征在于，所述的基因片段為cDNA質(zhì)?；蚱?，siRNA質(zhì)?；蚱位騧icroRNA片段，聚合物與基因片段的N/P值為1:1_48:1。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9所述復(fù)合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑混合，制備臨床可接受的注射劑，包括局部注射劑，靜 脈注射劑。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK103626996SQ201310635438
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】丁平田, 余澗坤 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)