一種啟動子OsP002、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種啟動子OsP002、及其制備方法和應(yīng)用，所述啟動子的核苷酸序列為Seq?ID?No.1所示的核苷酸序列或?yàn)榕cSeq?ID?No.1互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明所述啟動子能夠用于調(diào)控單子葉植物中目的基因的表達(dá)，為研究單子葉植物中目的基因表達(dá)提供了一種新的工具和選擇。
【專利說明】—種啟動子0sP002、制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種啟動子0sP002、制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]啟動子是指基因中一段可與RNA聚合酶及其它一些影響轉(zhuǎn)錄的反式因子結(jié)合實(shí)現(xiàn)精確有效起始轉(zhuǎn)錄的DNA序列。植物基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時間和表達(dá)的程度受啟動子的控制，啟動子的克隆及功能分析是植物基因表達(dá)調(diào)控研究的重要內(nèi)容，也是植物基因工程研究的一個重要方面。
[0003]根據(jù)啟動子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類:組成型啟動子、組織或器官特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。所謂組成型啟動子是指在組成型啟動子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育階段的基因表達(dá)沒有明顯差異，因而稱之組成型啟動子。
[0004]人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動子。例如肌動蛋白(actin)和泛素(ubiquitin)等基因的啟動子已被克隆。用這些啟動子代替CaMV35S啟動子，可以更有效地在單子葉植物中驅(qū)動外源基因的轉(zhuǎn)錄。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶P亞基基因和植物光敏色素基因中克隆了相應(yīng)啟動子，用其代替CaMV35S啟動子，在轉(zhuǎn)基因煙草中也取得了很好的表達(dá)效果(Plant biotechnology, 2002,19 (I):19-26)。
[0005]單子葉植物基因中常見的啟動子有:Ubi啟動子(Plant ubiquitinpromoter)、Actin 啟動子(Plant Actin promoter)和 Adh-1 啟動子(Maize alcoholdehydrogenaselpromoter)。Ubi啟動子以其啟動效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩(wěn)定等因素而倍受青睞。Actin啟動子1990年由康奈爾大學(xué)的McElroy等首次在水稻中發(fā)現(xiàn),屬于強(qiáng)組成型啟動子。Actin啟動子在單子葉禾本科中作用顯著，但是鄰近科屬的植物中的基因調(diào)控功能卻十分不理想。因此，許多相`關(guān)研究通過其他單子葉植物尋找Actin啟動子，并成功在香蕉、甜瓜、玉米和擬南芥中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。Actin啟動子由于對基因表達(dá)的強(qiáng)調(diào)控作用，在單子葉植物優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因中已經(jīng)得到越來越廣泛的應(yīng)用。Adh-1啟動子調(diào)控ADH(alcoholdehydrogenase)基因,對植物在缺氧環(huán)境下乙醇脫氫酶的表達(dá)至關(guān)重要。Adh-1啟動子對單子葉植物特別是谷類植物如水稻、燕麥和大麥，和少部分雙子葉植物如煙草，基因的調(diào)控功能比CaMV (花椰菜花葉病毒CaMV) 35S啟動子提高10-50倍。Adh-1啟動子主要應(yīng)用于單子葉植物，對絕大部分雙子葉植物基因表達(dá)的調(diào)控效果都很有限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明通過對水稻基因組的深入研究，提供了一種新的啟動子0sP002，所述啟動子能夠用于調(diào)控單子葉植物中目的基因的表達(dá)，同時為研究單子葉植物中目的基因表達(dá)提供了一種新的工具和選擇。
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種新的啟動子，能夠在植物中調(diào)控基因的表達(dá)。
[0008]本發(fā)明的又一目的是提供一種含有上述啟動子的核酸構(gòu)建體、載體、重組細(xì)胞及植物愈傷組織、植物外植體或植物。
[0009]本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述啟動子的引物、制備方法，以及利用該啟動子調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法。
[0010]本發(fā)明的再一目的是提供一種轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，以及上述啟動子、核酸構(gòu)建體、載體、重組細(xì)胞、或植物愈傷組織或植物外植體或植物在調(diào)控植物中目的基因表達(dá)或植物育種中的用途。
[0011]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0012]本發(fā)明公開了一種啟動子，該啟動子含有選自以下任意一組并具有啟動子功能的核苷酸序列:
[0013]a、Seq ID N0.1所示的核苷酸序列；
[0014]b、與Seq ID N0.1互補(bǔ)的核苷酸序列；
[0015]C、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；
[0016]d、對上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；
[0017]e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90 %同一性的核苷酸序列。
[0018]本發(fā)明還公開了一種核酸構(gòu)建體，包含上述的啟動子，以及與啟動子可操作連接的基因序列，上述啟動子與基因序列來源相同或者不同。
[0019]本發(fā)明還公開了一種載體，該載體含有上述啟動子或核酸構(gòu)建體，優(yōu)選地，該載體為上述啟動子或上述核酸構(gòu)建體分別與PMD18-T或p8質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組載體。
[0020]本發(fā)明還公開了一種重組細(xì)胞，該重組細(xì)胞含有上述的啟動子或核酸構(gòu)建體或載體，優(yōu)選地，該重組細(xì)胞為重組大腸桿菌細(xì)胞或重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。
[0021]本發(fā)明還公開了含有上述啟動子、核酸構(gòu)建體、載體或重組細(xì)胞的植物愈傷組織、植物外植體或植物，該植物優(yōu)選為單子葉植物，再優(yōu)選為稻屬，更優(yōu)選為水稻，進(jìn)一步優(yōu)選為水稻日本晴。
[0022]本發(fā)明還公開了一組引物對，用于擴(kuò)增得到上述啟動子，該引物對的兩條引物分別含有Seq ID No:2和Seq ID No:3所示的序列，優(yōu)選地，該兩條引物在5’端還分別連接有限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基，更優(yōu)選地，該引物對的兩條引物分別具有Seq ID No:4和Seq ID No:5所不的序列。
[0023]本發(fā)明還公開了一種制備Seq ID N0.1啟動子的方法，該方法包括，以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用一對擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，該擴(kuò)增引物根據(jù)SEQ ID NO:1在水稻日本晴基因組gDNA中的序列分別針對首尾進(jìn)行設(shè)計，所用引物優(yōu)選上述引物對。
[0024]本發(fā)明還公開了一種調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法，該方法包括，將上述啟動子、核酸構(gòu)建體、載體或重組細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞；優(yōu)選導(dǎo)入植物愈傷組織；進(jìn)一步優(yōu)選的，植物愈傷組織是通過具有上述啟動子或核酸構(gòu)建體或載體的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的；該植物優(yōu)選為單子葉植物，再優(yōu)選為稻屬，更優(yōu)選為水稻，進(jìn)一步優(yōu)選為水稻日本晴。
[0025]本發(fā)明還公開了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)上述的重組細(xì)胞或植物愈傷組織或植物外植體或植物；優(yōu)選地，所述植物愈傷組織或植物外植體或植物含有上述的啟動子或核酸構(gòu)建體或載體或重組細(xì)胞；該植物優(yōu)選為單子葉植物，再優(yōu)選為稻屬，更優(yōu)選為 水稻，更優(yōu)選為粳稻，進(jìn)一步優(yōu)選為水稻日本晴。[0026]本發(fā)明還公開了上述啟動子、核酸構(gòu)建體、載體、重組細(xì)胞或植物愈傷組織或植物外植體或植物在調(diào)控植物中目的基因表達(dá)或植物育種中的用途；優(yōu)選植物是單子葉植物，再優(yōu)選的植物為稻屬，更優(yōu)選植物為水稻，進(jìn)一步優(yōu)選植物為水稻日本晴。
[0027]由于采用了以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于:
[0028]本發(fā)明提供的新的啟動子能夠在植物中調(diào)控基因表達(dá)，并且，在單子葉植物如水稻幼苗的根、幼苗、水稻花藥、水稻穎殼等中具有啟動子功能，能夠調(diào)控外源基因的表達(dá)，從而為研究單子葉植物中目的基因的表達(dá)提供了一種新的工具和選擇。
【專利附圖】

【附圖說明】[0029]圖1為用于構(gòu)建p8質(zhì)粒的pGAMBIA-1301質(zhì)粒示意圖。
[0030]圖2為p8質(zhì)粒示意圖。
[0031]圖3為經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織的GUS染色結(jié)果；其中，帶有本發(fā)明所述啟動子P002序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P002轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(左)經(jīng)⑶S染色后呈現(xiàn)藍(lán)色；不帶有本發(fā)明啟動子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8質(zhì)粒的水稻愈傷組織(對照，右)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。
[0032]圖4為經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻幼苗期根的GUS染色結(jié)果；其中，由帶有本發(fā)明所述啟動子P002序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P002轉(zhuǎn)化的水稻幼苗期根(右)經(jīng)⑶S染色后呈現(xiàn)藍(lán)色；不帶有本發(fā)明啟動子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8質(zhì)粒的水稻幼苗期根(對照，左)經(jīng)GUS染色后顏色未發(fā)生變化。
[0033]圖5為經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻幼苗期葉片的GUS染色結(jié)果；其中，由帶有本發(fā)明啟動子P002序列的重組根癌農(nóng)桿菌p8+P002轉(zhuǎn)化的水稻幼苗期葉片(右)經(jīng)⑶S染色后呈現(xiàn)藍(lán)色；不帶有本發(fā)明啟動子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8質(zhì)粒的水稻幼苗期葉片(對照，左)經(jīng)GUS染色后顏色未發(fā)生變化。
[0034]圖6為經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻成熟期根的GUS染色結(jié)果；其中，由帶有本發(fā)明所述啟動子P002序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P002轉(zhuǎn)化的水稻成熟期根(右)經(jīng)⑶S染色后呈現(xiàn)藍(lán)色；不帶有本發(fā)明啟動子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8質(zhì)粒的水稻成熟期根(對照，左)經(jīng)GUS染色后顏色未發(fā)生變化。
[0035]圖7為經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻成熟期莖的GUS染色結(jié)果；其中，由帶有本發(fā)明所述啟動子P002序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P002轉(zhuǎn)化的水稻成熟期莖(右)經(jīng)⑶S染色后呈現(xiàn)藍(lán)色；不帶有本發(fā)明啟動子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8質(zhì)粒的水稻成熟期莖(對照，左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。
[0036]圖8為經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻成熟期葉片的GUS染色結(jié)果；其中，由帶有本發(fā)明所述啟動子P002序列的重組根癌農(nóng)桿菌p8+P002轉(zhuǎn)化的水稻成熟期葉片(右)經(jīng)⑶S染色后呈現(xiàn)藍(lán)色；不帶有本發(fā)明啟動子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8質(zhì)粒的水稻成熟期葉片(對照，左)經(jīng)GUS染色后顏色未發(fā)生變化。
[0037]圖9為經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻成熟期穎殼的GUS染色結(jié)果；其中，帶有本發(fā)明所述啟動子P002序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P002轉(zhuǎn)化的水稻成熟期穎殼(右)經(jīng)⑶S染色后呈現(xiàn)藍(lán)色；不帶有本發(fā)明啟動子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8質(zhì)粒的水稻成熟期穎殼(對照，左)經(jīng)GUS染色后顏色未發(fā)生變化。[0038]圖10為經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻花藥、花絲、柱頭的GUS染色結(jié)果；其中，帶有本發(fā)明所述啟動子P002序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P002轉(zhuǎn)化的水稻花藥、花絲、柱頭(右)經(jīng)⑶S染色后呈現(xiàn)藍(lán)色；不帶有本發(fā)明啟動子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8質(zhì)粒的水稻花藥、花絲、柱頭(對照，左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0040]本發(fā)明提供一種能夠在植物中調(diào)控基因表達(dá)的啟動子序列，該啟動子含有選自以下任意一組并具有啟動子功能的核苷酸序列:
[0041]a、Seq ID N0.1所示的核苷酸序列；
[0042]b、與Seq ID N0.1互補(bǔ)的核苷酸序列；
[0043]C、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；
[0044]d、對上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；
[0045]e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0046]本發(fā)明中，術(shù)語“單子葉植物”具體地可以為稻屬植物例如水稻，包括但不限于日本晴、中花10、中花11、丹江8號、云稻2號、皖稻90、皖稻92、皖稻201、津原101、汕優(yōu)608
坐寸o
[0047]在本發(fā)明中，所述的高等嚴(yán)緊條件下與Seq ID N0.1所示或與其互補(bǔ)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，其具有與Seq ID N0.1所示核苷酸序列相同或相似的啟動子活性。
[0048]在本發(fā)明中，所述對Seq ID N0.1或與其互補(bǔ)的核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時在所述核苷酸序列的5 '端和/或3 ’端，和/或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過2-45個，或不超過3-20個，或不超過4-15個，或不超過5-10個，或不超過6-8個的分別用逐個連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取代、缺失、添加修飾。
[0049]在本發(fā)明中，所述對Seq ID N0.1或與其互補(bǔ)的核苷酸序列進(jìn)行如上述行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，具有與Seq ID N0.1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動子活性。
[0050]通過一種多核苷酸進(jìn)行說明，其所具有的核苷酸序列，例如與Seq ID N0.1的參考核苷酸序列至少90%同一性是指:在Seq ID N0.1的參考核苷酸序列的每100個核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)10個核苷酸的不同外，該多核苷酸的核苷酸序列與參考序列相同。即為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少90%相同的多核苷酸，參考序列中多達(dá)10%的核苷酸可以被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的核苷酸可多達(dá)參考序列總核苷酸的10% ;或在一些核苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合。
[0051]在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法，以BLAST和BLAST2.0 算法為例，它們分別描述在 Altschul 等(1977) Nucl.Acid.Res.25:3389-3402和Altschul等(1990) J.Mol.Bi0.215:403-410。采用文獻(xiàn)中所述或默認(rèn)參數(shù)，BLAST和BLAST2.0可用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過國立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。[0052]在本發(fā)明中，所述與Seq ID N0.1所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列，包括與Seq ID N0.1或與其互補(bǔ)的核苷酸序列所公開序列基本同一的多核苷酸序列，在本發(fā)明中，所述與Seq ID N0.1所不核苷酸序列或與其互補(bǔ)的核苷酸序列具有至少90%同一丨丨生的核苷酸序列具有與Seq ID N0.1所不核苷酸序列相同或相似的啟動子活性。
[0053]本發(fā)明還公開了一種核酸構(gòu)建體，包括上述啟動子，以及與該啟動子可操作連接的基因序列?！翱刹僮鬟B接”是指兩個或多個核苷酸區(qū)域或核苷酸序列的功能性空間排列。在本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體中，啟動子被置于基因核酸序列的某個特定位置，所述基因一般是需要提高轉(zhuǎn)錄水平的任何核酸序列，或者，可設(shè)計本發(fā)明所述啟動子和基因以便下調(diào)特定核酸序列。即通過將啟動子與反義方向基因相連來實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明一個具體的實(shí)施方式中，所屬基因優(yōu)選為GUS基因。 [0054]本發(fā)明還涉及一種含有上述啟動子或上述核酸構(gòu)建體的載體。本發(fā)明的載體可以是通過將上述啟動子或上述核酸構(gòu)建體插入到克隆載體或表達(dá)載體而得到的重組載體。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組載體的表達(dá)載體。在本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明含有所述啟動子的載體為上述啟動子與PMD18-T或p8質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組載體，優(yōu)選的，本發(fā)明的重組載體為PMD18-T+P002重組載體或者p8+P002重組載體。
[0055]本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有本發(fā)明所述啟動子的重組細(xì)胞。本發(fā)明的重組細(xì)胞可以通過將上述含有本發(fā)明所述啟動子的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得到的。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞包括但不限于，例如:大腸桿菌細(xì)胞，根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞等。在本發(fā)明一個具體的實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞為重組根癌農(nóng)桿菌。
[0056]本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種植物愈傷組織或植物外植體或植物，所述愈傷組織、植物外植體或植物含有本發(fā)明的上述啟動子。本發(fā)明的植物愈傷組織是單子葉植物愈傷組織，如水稻愈傷組織。
[0057]本發(fā)明還進(jìn)一步涉及用于PCR擴(kuò)增得到本發(fā)明所述啟動子的一組引物對，該組引物對含有序列表中Seq ID No:2和Seq ID No:3所示的序列。為了便于操作，通常優(yōu)選在引物的5’端還設(shè)計連接有限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基。在本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中，所述引物對的兩條引物分別具有Seq ID No:4和Seq ID No:5所示的序列。
[0058]采用上述引物，以水稻日本晴基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠制備得到本發(fā)明的啟動子。
[0059]本發(fā)明還進(jìn)一步公開了一種調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法，該方法包括:將上述啟動子導(dǎo)入植物細(xì)胞。優(yōu)選的是通過將同時含有外源基因以及本發(fā)明啟動子的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞來達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。所述核酸構(gòu)建體中，外源基因與本發(fā)明所述的啟動子可操作地連接。
[0060]在本發(fā)明中，可采用植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因及所述啟動子插入到植物基因中，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。本領(lǐng)域周知，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化常被用于單子葉植物的基因轉(zhuǎn)化，但其轉(zhuǎn)化技術(shù)也可用于本發(fā)明啟動子和外源基因的導(dǎo)入。當(dāng)然，適于本發(fā)明的啟動子和外源基因?qū)氲牧硪环N方法是粒子轟擊，(即顯微金或鎢粒子包覆轉(zhuǎn)化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開發(fā)。另外，還可以采用的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。金銀轉(zhuǎn)化后，采用通用的方法來篩選和再生整合有表達(dá)單元的植株。
[0061]本發(fā)明的啟動子及調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法，可以應(yīng)用于植物品種的選育。例如，可用于水稻的育種。在本發(fā)明的一個【具體實(shí)施方式】中，所述水稻為日本晴。
[0062]本發(fā)明所述的啟動子可稱為一種新的啟動子，作為植物(特別是單子葉植物)轉(zhuǎn)基因的工具啟動子，為開展低表達(dá)基因轉(zhuǎn)化苗篩選、植物花器官敗育等分子育種研究提供便利，從而極大地縮短優(yōu)良品種的選育時間。
[0063]主發(fā)明中，單子葉植物具體可以為禾本科植物，更具體的，可為稻屬植物，例如水稻，包括但不限于日本晴。
[0064]下面通過【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例中未注明的具體技術(shù)或條件，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如，參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)，或按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商的，均為可通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0065]實(shí)施例1:P002啟動子片段的PCR擴(kuò)增和pMD18-T+P002重組載體的構(gòu)建。
[0066]一、P002啟動子片段的PCR擴(kuò)增:
[0067]使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄號:DP320-02)提取水稻日本晴(已在申請?zhí)枮?br> [0068]200910238992.0、發(fā)明名稱為“一種啟動子Bg1sP587、其制備方法及用途”的發(fā)明申請中保藏，并于2010年9月22日公開，保藏編號為CCTCC NO:P200910)的基因組DNA，根據(jù)該啟動子在水稻日本晴gDNA中的序列，分別在首尾設(shè)計一對PCR特異性擴(kuò)增引物(上游引物Fl，加限制性酶切位點(diǎn)Ec oR I和保護(hù)堿基，下游引物Rl，加限制性酶切位點(diǎn)SbfI和保護(hù)堿基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA為模板，使用高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如表1所示。
[0069]表1基因啟動子擴(kuò)增的PCR體系
[0070]
【權(quán)利要求】
1.一種啟動子，其特征在于，所述啟動子含有選自以下任意一組并具有啟動子功能的核苷酸序列: a、SeqID N0.1所示的核苷酸序列； b、與SeqID N0.1互補(bǔ)的核苷酸序列； C、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列； d、對上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列； e、與上述a或b所不核苷酸序列具有至少90%同一丨丨生的核苷酸序列。
2.—種核酸構(gòu)建體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的啟動子，以及與啟動子可操作連接的基因序列，所述啟動子與所述基因序列來源相同或者不同。
3.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求1所述的啟動子或權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體；優(yōu)選地，所述載體為權(quán)利要求1所述的啟動子與權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體與pMD18-T或p8質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組載體。
4.一種重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞含有權(quán)利要求1所述的啟動子或權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體或 權(quán)利要求3所述的載體；所述重組細(xì)胞為重組大腸桿菌細(xì)胞或重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。
5.一種含有權(quán)利要求1所述啟動子、權(quán)利要求2所述核酸構(gòu)建體、權(quán)利要求3所述載體、權(quán)利要求4所述重組細(xì)胞的植物愈傷組織、植物外植體或植物；所述植物為單子葉植物；優(yōu)選地，所述植物為稻屬；優(yōu)選地，所述植物為水稻；優(yōu)選地，所述植物為水稻日本晴。
6.一組引物對，所述引物對用于擴(kuò)增得到權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于，所述引物對的兩條引物分別含有Seq ID No:2和Seq ID No:3所示的序列；所述的兩條引物在5’端分別連接有限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基；優(yōu)選地，所述引物對的兩條引物分別具有Seq ID No:4和Seq ID No:5所示的序列。
7.一種制備權(quán)利要求1中所述Seq ID N0.1啟動子的方法，其特征在于，包括，以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用一對擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，所述擴(kuò)增引物根據(jù)SEQ ID NO:l在在水稻日本晴gDNA中的序列分別針對首尾進(jìn)行設(shè)計；優(yōu)選地，所述擴(kuò)增引物為權(quán)利要求6所述的引物對。
8.—種調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法，其特征在于，該方法包括，將權(quán)利要求1所述的啟動子或權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3所述的載體或權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞；所述植物為植物愈傷組織；優(yōu)選地，所述植物愈傷組織是通過具有權(quán)利要求I所述啟動子或權(quán)利要求2所述核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3所述載體的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的；優(yōu)選地，所述植物為單子葉植物；優(yōu)選地，所述植物為稻屬；優(yōu)選地，所述植物為水稻；優(yōu)選地，所述植物為水稻日本晴。
9.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)上述的重組細(xì)胞或植物愈傷組織或植物外植體或植物；優(yōu)選地，所述植物愈傷組織或植物外植體或植物含有權(quán)利要求1所述的啟動子或權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3所述的載體或權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞；優(yōu)選地，所述植物為單子葉植物；優(yōu)選地，所述植物為稻屬；優(yōu)選地，所述植物為水稻；優(yōu)選地，所述植物為水稻日本晴。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述啟動子或權(quán)利要求2所述核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3所述載體或權(quán)利要求4所述重組細(xì)胞或權(quán)利要求5所述植物愈傷組織或植物外植體或植物在調(diào)控植物中目的基因表達(dá)或植物育種中的用途；優(yōu)選地，所述植物為是單子葉植物；優(yōu)選地，所述植物為稻屬；優(yōu)選地，所述植物為水稻；優(yōu)選地，所述植物為水稻日本晴。
【文檔編號】C12N1/21GK103614378SQ201310526035
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月30日
【發(fā)明者】黃剛, 汪杰, 焦偉鋼, 張厚寶, 辛宜, 拓慶榮, 田伯瑞, 廖加濤, 楊爽 申請人:華大基因楊凌創(chuàng)新研究院有限公司