一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的編碼基因序列及氨基酸序列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種編碼海蚯蚓蛋白酶的編碼基因序列及其氨基酸序列，屬于醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域。編碼海蚯蚓蛋白酶的核苷酸序列全長795bp，編碼的海蚯蚓蛋白酶氨基酸序列長264個氨基酸，包含19個氨基酸殘基組成的信號肽。本發(fā)明的有益效果是：根據(jù)本發(fā)明的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列，可以從海蚯蚓的消化道組織中克隆該酶的編碼基因。該編碼基因通過基因重組技術(shù)，可以在原核表達系統(tǒng)中獲得表達。重組海蚯蚓蛋白酶具有抑制腫瘤細胞增殖的活性，可作為潛在的新型基因工程抗腫瘤藥物，進一步開發(fā)。
【專利說明】一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的編碼基因序列及氨基酸序列
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種海蚯蚓蛋白酶，具體地說是一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的編碼基因序列及其氨基酸序列，屬于醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白酶是一類分布于動物、植物和微生物中能夠特異水解肽鍵的水解酶，其中部分為絲氨酸內(nèi)切蛋白酶，這些蛋白酶在生物體發(fā)揮不同的生理作用，如凝集、纖溶、消化、免疫、調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育等。近年來的實驗及臨床研究表明，蛋白酶在抗腫瘤方面也起到重要作用，有望成為新型抗腫瘤藥物。
[0003]海洋生物海艇蝴(Arenicola cristata)屬于環(huán)節(jié)動物門多毛綱小頭蟲目沙纟屬科，形似蚯蚓，生活于潮間帶多沙地帶，營管居生活，故名海蚯蚓，主要分布于我國渤海、黃海沿岸，繁殖力強，資源豐富。目前對海蚯蚓的研究方向主要集中在其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理代謝、營養(yǎng)成分分析等方面。關(guān)于海蚯蚓的開發(fā)應(yīng)用尚未見報道，特別是未見它在抗腫瘤方面應(yīng)用的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列。
[0005]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
以來自海蚯蚓消化道上皮細胞的mRNA為模板，采用同源序列克隆法，通過3' RACE、RACE技術(shù)，獲得了一種編碼具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列。將該序列表達活性肽的部分經(jīng)PCR擴增，克隆到表達載體pET-2Ia上，在原核表達系統(tǒng)大腸桿菌E.coliBL21中誘導(dǎo)表達，生產(chǎn)具有抗腫瘤活性的重組海蚯蚓蛋白酶。重組海蚯蚓蛋白酶具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，可作為新型的基因工程藥物。
[0006]海蚯蚓蛋白酶cDNA序列的克隆:
(O設(shè)計引物:根據(jù)絲氨酸蛋白酶家族的蛋白酶催化活性中心Ser附近所含的高度保守序列GDSGGP設(shè)計引物。
[0007](2)目的基因cDNA 3'端序列擴增及測序:由步驟(1)得到引物，和來自海蚯蚓消化道組織的總cDNA為模板，通過3' RACE CcDNASi末端快速擴增技術(shù))擴增海蚯蚓蛋白酶的基因cDNA 3'端序列。PCR產(chǎn)物膠回收后分別連TA克隆載體，轉(zhuǎn)化細菌E.coli DH5 α，測序。
[0008](3)目的基因cDNA 5'端序列擴增及測序:根據(jù)獲得的目的基因cDNA 3'端序列設(shè)計兩對特異性引物，以來自海蚯蚓消化道組織的總cDNA為模板，采用5' RACECcDNA 5'末端快速擴增技術(shù))，進行套式PCR，擴增海蚯蚓蛋白酶基因cDNA 5'端序列。PCR產(chǎn)物膠回收后分別連TA克隆載體，轉(zhuǎn)化細菌E.coli DH5a，測序。[0009](4)拼接:應(yīng)用contigexpress軟件對步驟(2)和(3)得到的目的基因cDNA端和5'端序列進行拼接，獲得本發(fā)明的海蚯蚓蛋白編碼基因的DNA (mRNA)序列。
[0010](5)根據(jù)上述步驟(4)得到的DNA (mRNA)序列，使用DNAMAN軟件，獲得該海蚯蚓蛋白酶cDNA編碼的氨基酸序列。
[0011]一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的編碼基因序列，該序列如下:
IGCCACGCGTC GACTAGTACG GGGGGGGGGG GGGAGAGTGT AACCATGTTG TTTGCTGTGG
61 TCATCATCAG CGCCCTCCTG GTGGAGAGCC AGGCGCAGTT CCAGCTAGGA CGGCACCGTA 121 TTATCGGTGG AGAGGATGTG GACCCTCCAG GGAAGTACCC GTGGCAGGTG TCACTGACTC 181 TGCTCGGCCA GCACAACTGC GGTGGCTCCC TCATCACCCC TCAACATGTT CTGACGGCTG 241 CACACTGCGT GGAGGGATTC GGCGCACTGA CACGGATTCG AGTGGGACAA CATGACCGCT 301 CTGGGAATAT GGGCGACCCA AGGATACACG ATCCGGACAG CTGGGTCATC CATGAAGAGT 361 GGGGAGGCAT CAACTCAGGC GCTGATGGGT ATCCCAACGA CATCGCCATC ATCAAGCTGT 421 CAGAGCCGGT CGACATGACT AATGAGTATG TAGACATAAT CCCCCTGGCC GAGGGTGCAG 481 AGGAGGACTA TGAAGGAAGG ACCTGTGTCA TCACAGGCTG GGGGTTGACT GAAGACCTGG 541 TGATCCCTGA CATCCTGCAG GAGGCACCCG TGCAGGTCCA CACTCAAGAA TTCTGTCGTG 601 AATGGTGGGA GGGCGATGCT GGCGGGACTG TGCTCGATTC TCACGTGTGT GTCAGTGAGC 661 CTGGTGAGCG AGGCGCCTGC AGTGGAGACA GCGGTGGCCC CCTCATGTGC GAGACTGAGA 721 ATGGCTGGGA ATTACTGGGC ATCACCTCCT GGGGTCACTC CCTGTGTAAT ACTAATTACC 781 CCTCTGTCTA CGGCAGGGTG CCTTACTTCC GACAGTGGGT GGAAGACAAC CTCAACTGAC 841 ATCTTATTAT GACACTCTTT ACAAAATAAA CCAAAAACCA AAAAAAAAAA AAAAAAgo [0012]
序列中劃線加粗標示的ATG為起始密碼子，劃線加粗標示的TAA為終止密碼子。
[0013]根據(jù)海蚯蚓蛋白的原始cDNA序列，得到一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的氨基酸序列。該序列如下:
IMLFAVVIISA LLVESQAQFQ LGRHRIIGGE DVDPPGKYPff QVSLTLLGQH NCGGSLITPQ
61HVLTAAHCVE GFGALTRIRV GQHDRSGNMG DPRIHDPDSff VIHEEffGGIN SGADGYPNDI
121 AIIKLSEPVD MTNEYVDIIP LAEGAEEDYE GRTCVITGffG LTEDLVIPDI LQEAPVQVHT
181 QEFCREffffEG DAGGTVLDSH VCVSEPGERG ACS⑶SGGPL MCETENGffEL LGITSffGHSL
241 CNTNYPSVYG RVPYFRQffVE DNLN。
[0014]
劃線標示部分(MLFAVV11SALLVESQAQF)為該蛋白酶的信號肽序列。劃線⑶SGGP為絲氨酸蛋白酶家族的高度保守序列。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:根據(jù)本發(fā)明的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列，可以從海蚯蚓消化道組織總cDNA中克隆該酶的編碼基因。通過基因重組技術(shù)，使該酶的編碼基因在原核表達系統(tǒng)大腸桿菌中表達。重組海蚯蚓蛋白酶能夠抑制腫瘤細胞增殖，可作為潛在的新型抗腫瘤藥物，進一步開發(fā)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為海蚯蚓蛋白酶全長cDNA序列克隆的實驗步驟流程圖。[0017]圖2為絲氨酸蛋白酶家族的高度保守序列比對一引物設(shè)計區(qū)。
[0018]圖3為海蚯蚓蛋白酶重組蛋白表達純化及活性測定的實驗步驟流程圖。
【具體實施方式】
[0019]實施例1
海蚯蚓蛋白酶全長cDNA的克隆及序列測定。
[0020]1.設(shè)計引物序列:3R為含接頭引物序列的反轉(zhuǎn)錄引物；3R1為:T端接頭引物；3F1是根據(jù)絲氨酸蛋白酶家族高度保守序列⑶SGGP編碼區(qū)(如圖2:1，2，3，4分別為fetida fibrinolytic protease O, GenBank: DQ836917.1 -,Eisenia fetida fibrinolyticprotease I,GenBank: DQ418454.1 -,Eisenia fetida fibrinolytic protease 2,GenBank:DQ836918.1 -,Urechis unicinctus fibrinolytic enzyme, GenBank: HM623463.1)設(shè)計的簡并引物。5R為oligodT反轉(zhuǎn)錄引物。5R1、5R2是根據(jù)3' RACE獲得的3'端序列設(shè)計的特異性引物；5F1為含51端接頭引物序列的引物；5F2為5'端接頭引物。
【權(quán)利要求】
1.一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列，其特征在于，此序列由897個堿基對組成，此核苷酸序列為: IGCCACGCGTC GACTAGTACG GGGGGGGGGG GGGAGAGTGT AACCATGTTG TTTGCTGTGG 61 TCATCATCAG CGCCCTCCTG GTGGAGAGCC AGGCGCAGTT CCAGCTAGGA CGGCACCGTA 121 TTATCGGTGG AGAGGATGTG GACCCTCCAG GGAAGTACCC GTGGCAGGTG TCACTGACTC 181 TGCTCGGCCA GCACAACTGC GGTGGCTCCC TCATCACCCC TCAACATGTT CTGACGGCTG 241 CACACTGCGT GGAGGGATTC GGCGCACTGA CACGGATTCG AGTGGGACAA CATGACCGCT 301 CTGGGAATAT GGGCGACCCA AGGATACACG ATCCGGACAG CTGGGTCATC CATGAAGAGT 361 GGGGAGGCAT CAACTCAGGC GCTGATGGGT ATCCCAACGA CATCGCCATC ATCAAGCTGT 421 CAGAGCCGGT CGACATGACT AATGAGTATG TAGACATAAT CCCCCTGGCC GAGGGTGCAG 481 AGGAGGACTA TGAAGGAAGG ACCTGTGTCA TCACAGGCTG GGGGTTGACT GAAGACCTGG 541 TGATCCCTGA CATCCTGCAG GAGGCACCCG TGCAGGTCCA CACTCAAGAA TTCTGTCGTG 601 AATGGTGGGA GGGCGATGCT GGCGGGACTG TGCTCGATTC TCACGTGTGT GTCAGTGAGC 661 CTGGTGAGCG AGGCGCCTGC AGTGGAGACA GCGGTGGCCC CCTCATGTGC GAGACTGAGA 721 ATGGCTGGGA ATTACTGGGC ATCACCTCCT GGGGTCACTC CCTGTGTAAT ACTAATTACC 781 CCTCTGTCTA CGGCAGGGTG CCTTACTTCC GACAGTGGGT GGAAGACAAC CTCAACTGAC 841 ATCTTATTAT GACACTCTTT ACAAAATAAA CCAAAAACCA AAAAAAAAAA AAAAAAgo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列，其表達的蛋白質(zhì)為海蚯蚓蛋白酶，其特征在于，海蚯蚓蛋白酶由264個氨基酸組成，其氨基酸序列為: IMLFAVVIISA LLVESQAQFQ LGRHRIIGGE DVDPPGKYPff QVSLTLLGQH NCGGSLITPQ
·61HVLTAAHCVE GFGALTRIRV GQHDRSGNMG DPRIHDPDSff VIHEEffGGIN SGADGYPNDI
·121 AIIKLSEPVD MTNEYVDIIP LAEGAEEDYE GRTCVITGffG LTEDLVIPDI LQEAPVQVHT
·181 QEFCREWffEG DA·GGTVLDSH VCVSEPGERG ACS⑶SGGPL MCETENGffEL LGITSffGHSL · 241 CNTNYPSVYG RVPYFRQffVE DNLN。
【文檔編號】C12N15/57GK103525846SQ201310523204
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月30日
【發(fā)明者】趙春玲 申請人:濰坊醫(yī)學院