海洋微生物菌株ys0810產(chǎn)的堿性過氧化氫酶及其分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及由海洋微生物菌株YS0810高產(chǎn)的堿性過氧化氫酶及其分離純化方法,大小為201.2kDa，具有四聚體，SDS-PAGE測定的結(jié)果顯示該酶的一個(gè)亞基的分子量為50kDa，最適作用溫度為60℃，最適作用pH為12.0，pH6.0-10.0之間較穩(wěn)定;Ba2+、Al3+、Mn2+、Ca2+、Li+、Co2+、Mg2+、K+、Fe2+對酶活沒有影響；Co2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+能夠一定程度的抑制過氧化氫酶的酶活；Cu2+、Al3+是過氧化氫酶活性的抑制劑；Mg2+、Ba2+離子能夠提高過氧化氫酶的活性。該酶分離純化后，目的蛋白的純化倍數(shù)為37.5，其比活力為112446.70U/mg，得率為19.23%。可應(yīng)用于臨床分析、食品加工、紡織、造紙、醫(yī)械器具的消毒及藥物等。
【專利說明】海洋微生物菌株YS0810產(chǎn)的堿性過氧化氫酶及其分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及海洋微生物領(lǐng)域，特別是涉及由海洋微生物菌株YS0810產(chǎn)的堿性過氧化氫酶及其分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物過氧化氫酶(EC 1.11.1.6)又稱觸酶(Catalase，簡稱CAT)，普遍存在于好氧微生物體內(nèi)。作為一種酶類清除劑，其主要功能是催化過氧化氫分解成氧氣和水，防止體內(nèi)羥基自由基的過量積累。基于其高效的催化活性，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于臨床分析、食品加工、紡織、造紙、醫(yī)械器具的消毒及抗腫瘤藥物的研究。近年來，過氧化氫酶由于其在紡織工業(yè)中的應(yīng)用而倍受關(guān)注。多數(shù)的過氧化氫酶的應(yīng)用是在堿性高溫條件下進(jìn)行的，而商品化的過氧化氫酶很少具有這一特性，因而限制了過氧化氫酶更多的推廣應(yīng)用。雖然近些年過氧化氫酶產(chǎn)生菌的相關(guān)研究有些報(bào)道，但堿性過氧化氫酶產(chǎn)生菌的篩選及應(yīng)用研究鮮見。盡管目前國內(nèi)微生物過氧化氫酶仍處于應(yīng)用開發(fā)階段，但隨著人們對微生物過氧化氫酶的日益關(guān)注，以及研究技術(shù)和方法不斷完善成熟，微生物過氧化氫酶必將成為許多應(yīng)用發(fā)展的重要方向。
[0003]現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)主要是以微生物純培養(yǎng)為主，依據(jù)不同菌株的特性，應(yīng)用不同的手段獲得所需微生物，也可通過篩選方法最終獲得新菌種。過氧化氫酶是廣泛存在于各種動(dòng)植物和微生物中。目前國內(nèi)外對微生物源的過氧化氫酶研究有大腸桿菌、黑曲霉、芽孢桿菌、球形紅假單孢菌和溶壁微球菌等。但對不動(dòng)桿菌特別是海洋源的不動(dòng)桿菌的研究尚未見報(bào)道。微生物過氧化氫酶種類多，且能適應(yīng)各種不同的環(huán)境，尤其是海洋微生物過氧化氫酶更具有獨(dú)特的生理功能和特異的性質(zhì)。目前，不同來源的過氧化氫酶的研究仍是一個(gè)熱點(diǎn)。海洋微生物為適應(yīng)海洋這一生命極限環(huán)境，海洋微生物酶表現(xiàn)了比陸源微生物酶更為獨(dú)特的生理功能與酶學(xué)特性，其開發(fā)應(yīng)用潛力巨大，愈來愈引起世界各國的重視與開發(fā)。
[0004]國內(nèi)目前報(bào)道過氧化氫酶以動(dòng)植物源和微生物發(fā)酵為主，其研究主要集中在菌株的篩選，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，基于過氧化氫酶在紡織工業(yè)的應(yīng)用的重要性，仍需開發(fā)更適堿性的過氧化氫酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于經(jīng)發(fā)明人長期開發(fā)研究海洋微生物及其酶產(chǎn)物和生產(chǎn)實(shí)踐，開發(fā)提供一種新型海洋微生物菌株YS0810產(chǎn)的堿性過氧化氫酶及其分離純化方法。
[0006]本發(fā)明提供一種由新型海洋微生物菌株YS0810產(chǎn)的堿性過氧化氫酶(簡稱過氧化氫酶)是一個(gè)亞基分子量約為50kDa的同源四聚體的單功能過氧化氫酶，該酶分子量約為201.2kDa，最適反應(yīng) 溫度為 60°C，最適 pH 為 12.0,ρΗ6.0-10.0 之間較穩(wěn)定。Ba2+、Al3+、Mn2+、Ca2+、L1.、Co2.、Mg2.、K+、Fe2+對酶活沒有影響的；Co2+、Zn2+、Μη2.、Fe2+能夠一定程度的抑制過氧化氫酶的酶活；Cu2+、Al3+是過氧化氫酶活性的抑制劑；Mg2+、Ba2+離子能夠提高過氧化氫酶的活性。[0007]本發(fā)明提供的新型海洋微生物菌株YS0810產(chǎn)的堿性過氧氫酶及其分離純化方法中，所述新型海洋微生物菌株YS0810是從青島海域底泥樣品中篩選獲得一株(種)高產(chǎn)堿性過氧化氫酶(簡稱過氧化氫酶)的海洋微生物菌株(Acinetobacter sp.),將其命名為海洋微生物菌株YS0810 (簡稱菌株YS0810)。對其16S rDNA基因序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育分析，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示菌株YS0810的16S rDNA基因序列以及基因序列長度為 1443bp。應(yīng)用 Blast 程序與 EzTaxon 數(shù)據(jù)庫(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)進(jìn)行16S rDNA序列分析，通過BioEdit程序進(jìn)行多重序列比對后，利用MEGA5.1軟件，采用Neighbor-Joining分析法最大似然法(Maximum-Likelihood Method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。應(yīng)用MEGA 5.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，將高產(chǎn)堿性過氧化氫酶的海洋微生物菌株YS0810鑒定為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter sp.)。該菌株YS0810于2013年7月6日保藏于中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC NO:M2013315。
[0008]本發(fā)明提供的新型海洋微生物菌株YS0810經(jīng)下列發(fā)酵培養(yǎng):乙酸鈉、蛋白胨和蔗糖的添加量分別為10.36g/L、16.68g/L和16.22g/L，發(fā)酵最佳接種量為4wt% ；MgS04.7Η20、NaCl、ΚΗ2Ρ04添加量分別為0.09wt%、0.5wt%和0.15wt%時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為24_48h，起始pH為7時(shí)，溫度25°C以下，高產(chǎn)堿性過氧化氫酶，過氧化氫酶酶活力達(dá)到6814U/ml。
[0009]本發(fā)明提供的新型海洋微生物菌株YS0810產(chǎn)的堿性過氧氫酶酶學(xué)性質(zhì)的表征。
[0010]1、過氧化氫酶活性的測定:
[0011]采用焦性沒食子酸法，即鄰苯三酚法，反應(yīng)總體系3mL:蒸餾水、0.lmol/L pH6.0磷酸鉀鹽緩沖液、0.5wt%H202和5wt%焦性沒食子酸分別為2.lmL、0.32mL、0.16mL和
0.32mL。H202溶液和焦性沒食子酸試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，20°C水浴中加入0.lmL待測樣，以加蒸餾水作為空白，420nm下測定5min吸光度變化值，以每20s生成lmg紅紫掊精為一個(gè)活力單位。活力計(jì)算公式:U/mL=(AA酶液-ΛΑ對照)X3mL/(12 X0.lmL)。
[0012]2、SDS-PAGE 蛋白電泳
[0013]1)蛋白染色
[0014]變性染色:
[0015]Marker經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，用染色液染色30min，然后用脫色液脫色3_10h，期間多次更換脫色液至背景清楚。
[0016]活性染色:
[0017]電泳完成后，用蒸餾水沖洗凝膠3-5次，并用吸水紙吸干四周的水，加入配制好的
0.03wt%的H202溶液，搖床上輕搖lOmin左右，倒掉H202溶液，再用蒸餾水沖洗3_5次，使用吸水紙吸干加入2wt%三氯化鐵-鐵氰化鉀顯色劑，輕搖5min (此時(shí)已能看到墨綠色背景和黃色的活性條帶)，棄去顯色劑，蒸餾水沖洗掉背景，凝膠成像儀拍攝照片。
[0018]2)過氧化氫酶分子量的測定
[0019]采用SDS-PAGE垂直板電泳法，求出各種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率(Rm值)，再以分子量的對數(shù)(lgM)對Rm作圖，依據(jù)過氧化氫酶的Rm求得其分子量約為201.2kDa。
[0020]經(jīng)上述分子量的測定及活性電泳分析，過氧化氫酶發(fā)酵液經(jīng)飽和硫酸銨、陰離子層析和凝膠過濾層析等步驟純化后，SDS-PAGE變形電泳如下圖2所示，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對遷移率(Rf值)和分子量的對數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，求得回歸方程為:[0021]lgMr=2.01-1.0IRf, R2=0.98
[0022]式中，Mr為標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量；Rf為相對遷移率，Rf=樣品移動(dòng)距離/溴酚藍(lán)移動(dòng)距離；同時(shí)由上式求得過氧化氫酶的單個(gè)亞基分子量約為50kDa。
[0023]3、過氧化氫酶最適作用溫度及熱穩(wěn)定性
[0024]將過氧化氫酶溶液置于不同溫度(0_70°C)下，測定其殘余酶活。酶反應(yīng)最適溫度及溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)分別在0-70°C和30-70°C條件下進(jìn)行。將50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)在不同的溫度條件下(4-70°C )預(yù)熱30min,考察酶的最適反應(yīng)溫度,結(jié)果(圖3)顯示，該酶的最適反應(yīng)溫度為60°C。將酶液在不同溫度下(30-70°C)，預(yù)處理15min和30min后測定酶活力，以30°C條件下的酶活力為100%，結(jié)果如圖4所示，可以明顯看出該酶的熱穩(wěn)定性較好，60°C保溫15min，剩余酶活90%以上，30min仍能保留70%的酶活力。
[0025]酶的催化活性受溫度影響較大，這主要由于酶是蛋白質(zhì)，酶對溫度有很高的敏感性。一定條件下，酶的反應(yīng)速度隨著溫度的升高，超過某一特定溫度后，反應(yīng)速度反而下降，最終將變性失活。
[0026]4、過氧化氫酶最適作用pH及pH穩(wěn)定性
[0027]按照過氧化氫酶活性測定方法，在pH4-12的緩沖液中測定過氧化氫酶的最適pH和pH穩(wěn)定性。其中緩沖液:(ρΗ4.0-5.0)為50mM乙酸鈉-乙酸緩沖液;(ρΗ6.0-8.0)為50mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液；(pH9.0-10.0)為50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液；(pHll.0-12.0)為50mM磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液。
[0028]用50mM不同pH (4_12)的緩沖液同倍數(shù)稀釋過氧化氫酶溶液，常溫下靜置3h ;然后在PH7.0的緩沖體系中測定過氧化氫酶的活性。酶的pH特性均在室溫條件進(jìn)行。酶的反應(yīng)最適pH實(shí)驗(yàn)在pH4-ll緩沖溶液中進(jìn)行，pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)在pH4-13的范圍內(nèi)進(jìn)行。
[0029]酶在不同的pH緩沖液下與底物反應(yīng)，檢查過氧化氫酶活力。采用不同pH條件的緩沖液取代原反應(yīng)體系的緩沖液，測定不同pH下過氧化氫酶酶活力及不同pH條件下的殘留酶活力。結(jié)果如圖5所示，表明pH對酶的活性的影響極為顯著，通常各種酶只在一定的pH范圍內(nèi)才表現(xiàn)出活性，同一種酶在不同的pH下所表現(xiàn)的活性不同，其表現(xiàn)活性最高時(shí)的pH值稱為酶的最適pH。表明菌株YS0810所產(chǎn)的過氧化氫酶的最適反應(yīng)pH12。酶溶液在不同pH條件下，4°C保存3h，檢查過氧化氫酶的剩余活力，以未處理的初酶液為100%。結(jié)果(見圖
5)表明，該酶在pHIO保存3h，酶活力基本不變，在pHll條件下，保存3h，仍能保留80%的酶活。
[0030]5、金屬離子對過氧化氫酶活性的影響
[0031]在過氧化氫酶測活體系中，用雙蒸水代替緩沖液，加入各種金屬離子，其終濃度為10mM，常溫下靜置2h后測定過氧化氫酶活力，以不加任何離子的反應(yīng)為對照。
[0032]表1為金屬離子對過氧化氫酶活性的影響，由此可以看出，Ba2+、Al3+、Mn2+、Ca2+、Li+、Co2\ Mg2+、K+、Fe2+對酶活沒有影響；Co2+、Zn2\ Mn2+、Fe2+能夠一定程度的抑制過氧化氫酶的酶活； Cu2+、Al3+是過氧化氫酶活性的抑制劑；Mg2+、Ba2+離子能夠提高過氧化氫酶的活性。
[0033]表1
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種由海洋微生物菌株YS0810 (Acinetobacter sp.)產(chǎn)的堿性過氧化氫酶，其特征在于該堿性過氧化氫酶是一個(gè)亞基分子量約為50kDa的同源四聚體的單功能過氧化氫酶，該酶分子量為201.2kDa，最適作用溫度為60。。，最適作用pH % 12.0, ρΗ6.0-10.0之間較穩(wěn)定;Ba2+、Al3+、Mn2+、Ca2+、Li+、Co2+、Mg2+、K+、Fe2+對酶活沒有影響;Co2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+ 能夠一定程度的抑制過氧化氫酶的酶活；Cu2+、Al3+是過氧化氫酶活性的抑制劑；Mg2+、Ba2+離子能夠提高過氧化氫酶的活性。
2.一種由海洋微生物菌株YS0810產(chǎn)的堿性過氧化氫酶的分離純化方法，其特征在于包括下列步驟 .1)種子培養(yǎng)從保存的斜面中挑取一環(huán)菌體接入含有50ml種子培養(yǎng)基的250ml的三角瓶中，25°C、.200r/min培養(yǎng)18_20h;所述種子培養(yǎng)基:蛋白胨lwt%，牛肉膏0.3wt%, NaCl 0.5wt%，調(diào)節(jié)pH至7.0,121°C高壓蒸汽滅菌30min;.2)發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)基按照4V/V%接種量轉(zhuǎn)接到50ml/250ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，200r/min，25°C培養(yǎng).24h，按照4-1(^八％接種量再轉(zhuǎn)接到300ml/lL大錐形瓶中，200r/min，25°C培養(yǎng)24h，收集發(fā)酵液，10000r/min離心5min，取上清檢測酶活；所述發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖lwt%%，酵母膏.0.5wt%，蛋白胨 0.5wt%, KH2P04 0.lwt%, MgS04.7H20 0.02wt%, pH 調(diào)至 7.0-7.5，121°C 高壓蒸汽滅菌30min;.3)粗酶液的制備經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液，4?下lOOOOrpm離心20min,收集沉淀；pH7.0的50mM的磷酸鹽緩沖液懸浮菌體；冰浴中超聲波間歇細(xì)胞破碎lOmin ;再通過超濾機(jī)10kDa的超濾膜進(jìn)一步濃縮，經(jīng)過以上操作濃縮后的酶為粗酶液1;.4)硫酸銨分級沉淀取100mL粗酶液1，在冰浴中邊加入邊攪拌緩慢加入研磨的硫酸銨，至飽和度為30%，繼續(xù)攪拌15min后,4°C冰箱中放置沉淀2h ;4°C、10000r/min離心lOmin,取上清，繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為60%，4°C冰箱放置過夜，4°C、10000r/min離心lOmin，沉淀中加入50mmol/LpH7.0磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液溶解沉淀蛋白，再12000r/min冷凍離心lOmin,上清液即為粗酶液II ;.5)透析將粗酶液II濃縮后，4°C透析24h，期間更換緩沖液4一5次；.6)離子交換層析緩沖液:A 流動(dòng)相 Tris-HCl pH8.050mMB 洗脫液:Tris-HCl ρΗ8.050mM 含 lmol/L NaCl柱子及條件:HiPr印DEAE FF16/10,15%B洗脫1個(gè)柱體積左右，30%B洗脫1個(gè)柱體積收集峰，100%B沖洗柱子至基線不變化為止；用50mmol/L，pH8.0的Tris-HCl緩沖液平衡HiPr印DEAE FF16/10陰離子柱；將硫酸銨沉淀溶于磷酸鹽緩沖液后粗酶液用50mmol/L pH8.0Tris-HCl緩沖液使用離心管濃縮替換，先以50mmol/L，pH8.0的Tris-HCl緩沖液沖洗掉未被柱子結(jié)合的蛋白，再用含.0-0.8mol/L NaCl的50mmol/L，pH8.0Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性洗脫，并收集其中的活性部分于4°C冰箱保存；7)凝膠過濾層析凝膠過濾:Superdex20010/300GL;緩沖液含 0.10mol/L NaCl 的 0.05mol/L ρΗ7.5PBS。100 μ 1樣品上10X300-310mm柱，流速0.30mL/min。收集活性峰，lOkDa分子截留量超濾濃縮；預(yù)先用含0.15mol/L NaCl的50mmol/L，pH7.5的磷酸鹽緩沖液平衡SuperdexTM20010/300GL凝膠過濾層析柱，將經(jīng)HiPr印DEAE FF16/10柱得到的活性部分濃縮液用ρΗ7.5磷酸緩沖液替換并上樣，采用相同緩沖液洗脫，流速為0.3ml/min;該酶分離純化后，目的蛋白的純化倍數(shù)為37.5，其比活力為`112446.70U/mg，得率為19.23%。
【文檔編號】C12N9/08GK103667201SQ201310507023
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】孫謐, 王偉, 徐甲坤, 郝建華, 劉均忠 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所