一種發(fā)酵過程中添加過氧化氫生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種發(fā)酵過程中添加過氧化氫生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，該方法采用在發(fā)酵48h時添加一定濃度的氧載體過氧化氫（0.5-5%，v/v）到發(fā)酵液中，提高溶氧濃度，進(jìn)而提高γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量，同時也控制了γ-聚谷氨酸中L-谷氨酸和D-谷氨酸的比例。該方法使得γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量得到了很大的提高，而且也控制了其構(gòu)型的比例，使所制得的不同構(gòu)型γ-聚谷氨酸按照各自不同特點分別應(yīng)用到化妝品、環(huán)境保護、食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、沙漠治理等領(lǐng)域。
【專利說明】一種發(fā)酵過程中添加過氧化氫生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種Y-聚谷氨酸的生產(chǎn)方法，特別涉及一種發(fā)酵過程中添加過氧化氫生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的方法 。
【背景技術(shù)】
[0002]y -聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過α -氨基和、-羧基間的酰胺鍵結(jié)合而成的一種多功能生物可降解高分子材料。
[0003]分子量分布在IOOkDa到1000OkDa之間。Y -聚谷氨酸具有優(yōu)良的水溶性、超強的吸附性和生物可降解性，降解產(chǎn)物為無公害的谷氨酸，是一種優(yōu)良的環(huán)保型高分子材料，可作為保水劑、重金屬離子吸附劑、絮凝劑、緩釋劑以及藥物載體等，在化妝品、環(huán)境保護、食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、沙漠治理等產(chǎn)業(yè)均具有很高的商業(yè)價值和社會價值。
[0004]從聚谷氨酸的發(fā)現(xiàn)至今僅有幾十年的歷史，聚谷氨酸的研究主要還是處于實驗室階段，主要包括對其性質(zhì)的研究，產(chǎn)生菌的改良和基因研究，發(fā)酵過程研究和提取純化過程研究，以及衍生物的生產(chǎn)和性質(zhì)的研究。近幾年來，由于人們環(huán)境意識的增強和國家可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的要求，發(fā)展對環(huán)境友好的材料和開發(fā)改善環(huán)境問題的產(chǎn)品成為一種產(chǎn)業(yè)上的趨勢，它也推動了聚谷氨酸產(chǎn)業(yè)化研究和探索的進(jìn)程。進(jìn)入本世紀(jì)，個別國際知名公司開始進(jìn)行聚谷氨酸的生產(chǎn)和應(yīng)用的研究，國內(nèi)部分大學(xué)和研究所也積極開展了相關(guān)的研究，國內(nèi)更有數(shù)家企業(yè)開始計劃聚谷氨酸的大規(guī)模生產(chǎn)。由于這些產(chǎn)業(yè)化研究的跟進(jìn)，使得聚谷氨酸成為現(xiàn)階段最受人關(guān)注的生物制品之一。
[0005]不同構(gòu)型組成的Y-聚谷氨酸有不同的應(yīng)用，例如，含有較高含量L-谷氨酸的Y-聚谷氨酸因其對皮膚的兼容性在化妝品行業(yè)應(yīng)用廣泛，在一些其他的領(lǐng)域，含有較高D-谷氨酸的Y-聚谷氨酸因其降解較慢而被廣泛應(yīng)用。這使得在Y-聚谷氨酸生產(chǎn)過程中控制其構(gòu)型組成以滿足不同的應(yīng)用需求變得很重要。
[0006]Y-聚谷氨酸的構(gòu)型以及組成隨著菌株和培養(yǎng)條件的不同而不同。炭疽芽孢桿菌特異性可以生產(chǎn)出D-Glu構(gòu)型的Y-聚谷氨酸；采用地衣芽孢桿菌生產(chǎn)Y-聚谷氨酸，其會隨著錳離子濃度的不同而得到D-Glu含量10~100%的不同Y -聚谷氨酸；采用枯草芽孢桿菌也可以生產(chǎn)不同類型的Y-聚谷氨酸。
[0007]利用添加氧載體過氧化氫來提高Y -聚谷氨酸的產(chǎn)量，同時控制其構(gòu)型的比例尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種Y -聚谷氨酸的生產(chǎn)方法，特別是提供一種發(fā)酵過程中添加過氧化氫生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的方法。采用本發(fā)明所述生產(chǎn)方法生產(chǎn)Y-聚谷氨酸，不但Y-聚谷氨酸的產(chǎn)量有所提高，Y-聚谷氨酸聚合物中L型谷氨酸和D型谷氨酸的比例也能得到控制。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:[0010]本發(fā)明采用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)生產(chǎn)Y -聚谷氨酸。菌種來源:發(fā)明所用菌種見天津北洋百川生物技術(shù)有限公司申請專利名稱為惰性載體固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的方法專利，申請?zhí)?200910228297。該菌種為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis),現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種編號CGMCC3336。
[0011]—種發(fā)酵過程中添加過氧化氫生產(chǎn)Y -聚谷氨酸的方法，在發(fā)酵48h時,將一定體積百分濃度的過氧化氫(0.5%_5%)添加到發(fā)酵液中，提高了溶氧濃度，進(jìn)而提高了 Y-聚谷氨酸的產(chǎn)量，并控制了 Y-聚谷氨酸的構(gòu)型。
[0012]D-谷氨酸與L-谷氨酸濃度的測定:高效液相色譜(HPLC)
[0013]儀器:Agilentl200高效液相色譜儀(配紫外可見檢測器和工作站)。
[0014]色譜柱:大賽璐CR (+) / (CR-)手性柱；
[0015]流動相:pH2.0高氯酸水溶液；
[0016]流速:0.4mL/min ；
[0017]柱溫:25O;
[0018]檢測波長:UV200nm
[0019]樣品制備:發(fā)酵液經(jīng)二次醇沉復(fù)溶后，與等體積6mol/L鹽酸在110°C進(jìn)行水解，水解前樣品用流動相稀釋適當(dāng)倍數(shù)，水解后樣品用流動相稀釋適當(dāng)倍數(shù)，經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾，濾液供液相色譜分析。
[0020]有益效果:
[0021]利用本發(fā)明所述的Y-聚谷氨酸生產(chǎn)方法來生產(chǎn)Y-聚谷氨酸，其Y-聚谷氨酸的產(chǎn)量得到顯著提高，該方法可以同時控制Y-聚谷氨酸中L/D谷氨酸的比例，因此可以得到不同用途的Y-聚谷氨酸。
【具體實施方式】
[0022]下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明中Y-聚谷氨酸的生產(chǎn)方法。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0023]對照實驗:
[0024]1.CGMCC3336菌種的活化:在富含營養(yǎng)的固體培養(yǎng)基斜面上于37°C培養(yǎng)16小時，制備得到成熟的斜面種子，固體培養(yǎng)基的成分包含:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCllOg/L，瓊脂 20g/L, ρΗ7.2 ；
[0025]2.種子液的制備:
[0026]將一環(huán)上述種子轉(zhuǎn)入裝有液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C，220rpm培養(yǎng)16小時至對數(shù)生長期；
[0027]種子液培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖30 ;酵母膏7 ;胰蛋白胨10 ；Κ2ΗΡ040.5 ；MgSO4.6Η200.5，ρΗ7.2 ； 500ml的三角瓶中分裝50ml培養(yǎng)基；
[0028]3.發(fā)酵罐發(fā)酵:[0029]發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分為(g/L):葡萄糖80，谷氨酸鈉80，硝酸銨18，NaCllO,MgSO4.6Η200.5，CaCl2.6Η201.0, FeSO4.6Η200.01，精氨酸 0.44，組氨酸 0.26，蘇氨酸 0.5，蛋氨酸0.4，膽堿0.1，谷氨酰胺0.5，吡哆醇0.001,ρΗ7.2 ；
[0030]發(fā)酵條件:5L發(fā)酵罐裝液量為3L,種子液的接種量為10%,發(fā)酵溫度37°C,發(fā)酵時間72小時，
[0031]通風(fēng)量1.0vvm，轉(zhuǎn)速400rpm，初始pH為7.2 ;發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)檢測Y聚谷氨酸的產(chǎn)量為18g/L。Y-聚谷氨酸中L-谷氨酸與D-谷氨酸含量比例為1:1。
[0032]實施例1
[0033]發(fā)酵罐發(fā)酵采用氧載體添加策略，其余條件同對照實施例。發(fā)酵48h時添加過氧化氫 0.5% (v/v)0
[0034]結(jié)果:Y -聚谷氨酸產(chǎn)量由對照組的18g/L提高到25g/L。L/D構(gòu)型比例為1:2。
[0035]實施例2
[0036]發(fā)酵罐發(fā)酵采用氧載體添加策略，其余條件同對照實施例。發(fā)酵48h時添加過氧化氫 1% (v/v)0
[0037]結(jié)果:Y -聚谷氨酸產(chǎn)量由對照組的18g/L提高到28g/L。L/D構(gòu)型比例為4:5。
[0038]實施例3
[0039]發(fā)酵罐發(fā)酵采用氧載體添加策略，其余條件同對照實施例。發(fā)酵48h時添加過氧化氫 2% (v/v)0
[0040]結(jié)果:Y -聚谷氨酸產(chǎn)量由對照組的18g/L提高到30g/L。L/D構(gòu)型比例為6:5。
[0041]實施例4
[0042]發(fā)酵罐發(fā)酵采用氧載體添加策略，其余條件同對照實施例。發(fā)酵48h時添加過氧化氫 5% (v/v)0
[0043]結(jié)果:Y -聚谷氨酸產(chǎn)量由對照組的18g/L提高到20g/L。L/D構(gòu)型比例為1:3。
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)酵過程中添加過氧化氫生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的方法，包括如下步驟: (1)地衣芽孢桿菌CGMCC3336菌種的活化: 在富含營養(yǎng)的固體培養(yǎng)基斜面上于37°C培養(yǎng)16小時，制備得到成熟的斜面種子，固體培養(yǎng)基的成分包含:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC110g/L，瓊脂20g/L，pH7.2 ； (2)種子液的制備: 將一環(huán)上述種子轉(zhuǎn)入裝有液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C，220rpm培養(yǎng)16小時至對數(shù)生長期； 所述種子液培養(yǎng)基組成為:葡萄糖30g/L ;酵母膏7g/L ;胰蛋白胨10g/L ；K2HP040.5g/L ；MgS04.6Η200.5g/L，ρΗ7.2 ；500ml 的三角瓶中分裝 50ml 培養(yǎng)基； (3)發(fā)酵罐發(fā)酵: 發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分為:葡萄糖80g/L，谷氨酸鈉80g/L，硝酸銨18g/L，NaC110g/L,MgSO4.6Η200.5g/L，CaCl2.6Η201.0g/L，F(xiàn)eSO4.6Η200.01g/L，精氨酸 0.44g/L，組氨酸 0.26g/L,蘇氨酸0.5g/L，蛋氨酸0.4g/L，膽堿0.lg/L，谷氨酰胺0.5g/L，吡哆醇0.001g/L, pH7.2 ； 發(fā)酵條件:5L發(fā)酵罐裝液量為3L,種子液的接種量為10%,發(fā)酵溫度37°C,發(fā)酵時間72小時，在發(fā)酵48h時，將體積百分濃度為0.5%-5%的過氧化氫添加到發(fā)酵液中，通風(fēng)量1.0vvm，轉(zhuǎn)速 400rpm，初始 pH 為 7.2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵過程中添加過氧化氫生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在發(fā)酵罐發(fā)酵至48h時，添加過氧化氫，添加量為0.5%體積百分濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵過程中添加過氧化氫生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在發(fā)酵罐發(fā)酵至48h時，添加過氧化氫的體積百分濃度為1%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵過程中添加過氧化氫生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在發(fā)酵罐發(fā)酵至48h時，添加過氧化氫的體積百分濃度為2%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵過程中添加過氧化氫生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在發(fā)酵罐發(fā)酵至48h時，添加過氧化氫的體積百分濃度為5%。
【文檔編號】C12R1/10GK103525879SQ201310499326
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】喬長晟, 張帥, 高明昊, 李雪 申請人:天津北洋百川生物技術(shù)有限公司