一種適用于阪崎腸桿菌實時熒光定量pcr檢測的質粒標準分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種阪崎腸桿菌的質粒標準分子，該質粒標準分子的制備方法和定量方法及其應用。該質粒標準分子包含阪崎腸桿菌的外膜蛋白基因（ompA）序列，所述外膜蛋白基因（ompA）序列如序列表中SEQ?ID?NO：1所示，該質粒標準分子的序列如序列表中SEQ?ID?NO：2所示。本發(fā)明利用紫外分光光度法和高分辨電感耦合等離子體發(fā)射質譜（HR-ICP-MS）對該質粒標準分子進行定量，保證了其良好的溯源性。本發(fā)明的質粒標準分子解決了阪崎腸桿菌實時熒光PCR檢測中標準物質缺乏的難題，保證阪崎腸桿菌實時熒光PCR方法檢測結果的可比性，為阪崎腸桿菌實時熒光PCR方法檢測提供了可靠的質量控制方法。
【專利說明】—種適用于阪崎腸桿菌實時熒光定量PCR檢測的質粒標準分子
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物工程【技術領域】的質粒分子，具體涉及一種適用于阪崎腸桿菌實時熒光定量PCR檢測的質粒標準分子以及該質粒標準分子的制備方法、定量方法及其應用。
【背景技術】
[0002]阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)是乳制品中近幾年新發(fā)現(xiàn)的引起廣泛關注的一種致病菌。從1961年開始，世界范圍內由該菌引起的新生兒腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結腸炎的病例相繼被報道，阪崎腸桿菌被作為一種重要的食源性病原菌受到關注。多份研究報告已表明嬰兒配方奶粉是當前發(fā)現(xiàn)致嬰兒及早產兒腦膜炎、敗血癥和壞死性小腸結腸炎的主要感染渠道，總體死亡率高達80%，故已引起世界多國相關部門的重視。
[0003]目前阪崎腸桿菌的檢測方法分為兩類，一類是傳統(tǒng)的培養(yǎng)及其改進方法，依賴于生化與形態(tài)學特點，檢測周期較長，可操作性差；一類是聚合酶鏈式反應(polymerasechain reaction, PCR)相關方法，包括普通PCR方法以及實時熒光PCR方法，主要是針對阪崎腸桿菌區(qū)別于腸桿菌科其它細菌的多個靶基因，選擇特異序列，建立PCR以及實時熒光PCR方法。阪崎腸桿菌PCR相關檢測方法近年來發(fā)展迅速，由于其快速、靈敏、特異的特性，已經(jīng)成為食源性病原微生物的可靠檢測方法。
[0004]質粒DNA標準物質是一種含有檢測目的基因的特異性片段的重組質粒分子，在PCR定性檢測中可以作為陽性對照，在PCR定量分析中可以作為定量分析的標準品，構建定量分析的標準曲線。目前質粒DNA分子作為基因檢測的標準物質得到了越來越多的深入研究和應用，但是針對阪崎腸桿菌實時熒光PC`R檢測方法的質粒DNA標準物質還是空白。在實際阪崎腸桿菌實時熒光PCR時，各單位使用的多是自行設計構建的質粒DNA分子作為標準品，其中的目的基因特異性片段各不相同，同時缺乏統(tǒng)一的定值方法，質粒DNA分子定值準確度差，造成各實驗室之間的檢測結果差異極大，缺乏可比性。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是為了克服現(xiàn)有的阪崎腸桿菌實時熒光PCR檢測方法中缺乏陽性標準品和陽性標準品配置的問題，提供了一種適用于阪崎腸桿菌實時熒光PCR檢測的質粒標準分子。
[0006]實時突光PCR檢測阪崎腸桿菌的原理
[0007]采用實時熒光PCR技術可特異性擴增阪崎腸桿菌基因組中外膜蛋白基因(ompA)序列。設計針對以上靶基因的引物和兩端標記熒光的探針，擴增測試樣品DNA。實時熒光PCR可以通過檢測熒光信號的增加來實時監(jiān)測PCR產物。與此同時，用相同的引物、探針和條件擴增已知濃度的陽性標準物質(或陽性標準分子)。PCR方法中，陽性標準物質(或陽性標準分子)可以作為陽性對照；實時熒光PCR中，陽性標準物質(或陽性標準分子)可以構建穩(wěn)定的標準曲線，根據(jù)標準曲線可分別計算出樣品中對應基因的絕對含量(拷貝數(shù)或濃度)。
[0008]標準物質
[0009]標準物質是具有一種或多種足夠均勻和很好確定了的特性值，用以校準設備，評價測量方法或給材料賦值的材料或物質。
[0010]質粒標準分子
[0011]質粒標準分子是一種含有檢測目的基因的特異性片段的重組質粒分子，在PCR定性檢測中可以作為陽性對照，在PCR定量分析中可以作為定量分析的標準品，構建定量分析的標準曲線。質粒分子的優(yōu)點主要是可以通過微生物進行大量培養(yǎng)，DNA易于擴增，所以可提供無限穩(wěn)定量的標準物質，而且純度較高；同時操作容易，穩(wěn)定性高，同一個標準分子可以同時包含多個外源目的基因，經(jīng)濟又高效。
[0012]為解決上述技術問題，本發(fā)明采取的技術方案之一為:一種阪崎腸桿菌的質粒標準分子，該質粒標準分子包含阪崎腸桿菌的外膜蛋白基因(ompA)序列，所述外膜蛋白基因(ompA)序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
[0013]其中所述的外膜蛋白基因(ompA)基因，編碼合成外膜蛋白A，該蛋白廣泛存在于原核生物的細胞外膜和真核生物的細胞器外膜中，具有為外膜提供通透性，維持外膜結構穩(wěn)定的作用，所述基因序列如序列表中SEQ ID N0:1所不。
[0014]本發(fā)明的質粒標準分子，較佳地含有阪崎腸桿菌熒光PCR檢測的靶基因外膜蛋白基因(ompA)序列,本發(fā)明所述的質粒標準分子的序列較佳的如SEQ ID N0:2所示。
[0015]為解決上述技術問題，本發(fā)明采取的技術方案之二為:一種如上所述阪崎腸桿菌的質粒標準分子的定量方法，其包括以下步驟`:
[0016]①提取質粒標準分子；
[0017]②根據(jù)步驟①所得的質粒標準分子的堿基組成和序列長度，計算質粒標準分子中的磷元素的含量；
[0018]③配制梯度濃度的磷標準溶液，并用此標準溶液作出高分辨電感耦合等離子體發(fā)射質譜的標準曲線；
[0019]④高分辨電感耦合等離子體發(fā)射質譜檢測質粒標準分子溶液，并根據(jù)步驟③所得的標準曲線得出質粒標準分子溶液的磷含量；
[0020]⑤根據(jù)步驟④所得的質粒標準分子溶液的磷含量和步驟②所得的質粒標準分子中的磷元素的含量，計算出質粒標準分子的濃度。
[0021]其中步驟所述③高分辨電感耦合等離子體發(fā)射質譜檢測的條件如下:冷卻氣流量較佳地為10L/min~25L/min，最佳地為16.86L/min，輔助氣流量較佳地為0.5L/min~
3.0L/min,最佳地為0.88L/min,霧化氣流量為較佳地為0.5L/min~1.5L/min,更佳地為
1.123L/min，功率較佳地為1200W~1400W，最佳地為1350W。
[0022]本發(fā)明所述質粒標準分子的定量方法較佳地包括紫外分光光度法和高分辨電感耦合等離子體質譜(HR-1CP-MS)。
[0023]其中紫外分光光度法對質粒標準分子定量方法較佳地包括以下步驟:
[0024]①提取質粒標準分子；
[0025]②用TE緩沖液使紫外分光光度計校正為零點；[0026]③取適量DNA (根據(jù)儀器的需要)至比色杯中(nanodrop直接點在檢測區(qū)域)，記錄儀器讀數(shù)；
[0027]④若可直接讀出DNA濃度則直接記錄；若不可,則記錄樣品在260nm和280nm的光密度，DNA樣品的濃度為0D260X核酸稀釋倍數(shù)X 50，濃度單位為ng/μ L。
[0028](2) HR-1CP-MS對質粒標準分子定量方法較佳地包括以下步驟:
[0029]①提取質粒標準分子；
[0030]②根據(jù)質粒標準分子的堿基組成和序列長度，分別計算各質粒標準分子的磷元素的含量；
[0031]③配制梯度濃度的磷標準溶液，并用此標準溶液作出HR-1CP-MS的標準曲線。
[0032]④HR-1CP-MS檢測質粒標準分子，并根據(jù)標準曲線得出質粒標準分子的磷含量。
[0033]⑤根據(jù)質粒標準分子的磷含量計算出質粒標準分子的濃度。
[0034]為解決上述技術問題，本發(fā)明采取的技術方案之三為:一種阪崎腸桿菌實時熒光定量PCR檢測方法，其所采用的標準物質是如上所述的質粒標準分子。
[0035]其中所述的阪崎腸桿菌實時熒光定量PCR檢測方法為本領域常規(guī)的實時熒光定量PCR方法。
[0036]為解決上述技術問題，本發(fā)明采取的技術方案之四為:一種如上所述的阪崎腸桿菌的質粒標準分子的制備方法，包括以下步驟:
[0037]①人工合成阪崎腸桿菌的外膜蛋`白基因(ompA)序列，所述外膜蛋白基因(ompA)序列如序列表中SEQ ID NO: I所不；
[0038]②將步驟①所得阪崎腸桿菌的外膜蛋白基因(ompA)序列克隆至克隆載體上，得到阪崎腸桿菌的質粒標準分子。
[0039]步驟①所述人工合成的方法較佳地包括全基因合成該序列，或者通過PCR擴增技術獲得該序列。
[0040]本發(fā)明所述質粒標準分子pXL07構建方法較佳地包括以下步驟:
[0041]①在NCBI (美國國立生物技術信息中心)的Genbank中查詢阪崎腸桿菌的外膜蛋白基因(ompA)序列；
[0042]②對上述序列進行分析，選擇合適的序列和合適的酶切位點，并將酶切位點加至所選擇序列的5’端和3’端。
[0043]③將處理后的序列進行全基因人工合成服務，包括單鏈Oligo DNA的合成、DNA片段拼接等工作，并將全長基因克隆至質粒載體中，獲得質粒標準分子PXL07。
[0044]所述的質粒載體可以是任何常規(guī)載體，較佳的是克隆載體，更佳的是能夠在大腸桿菌中增殖的克隆載體，所述克隆載體較佳地為:pUC19, pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScript II SK或pGEM系列載體,優(yōu)選地為pUC19。
[0045]④測序驗證質粒標準分子的序列。
[0046]⑤質粒標準分子的實時熒光PCR檢測方法驗證。
[0047]所述的實時熒光PCR檢測方法驗證，是指檢測質粒標準分子在進行實時熒光PCR分析時的特異性和構建標準曲線能力等特性，以鑒定該質粒標準分子作為實時熒光PCR方法檢測阪崎腸桿菌的標準物質的能力。
[0048]在符合本領域常識的基礎上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。
[0049]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0050]本發(fā)明的積極進步效果在于:本發(fā)明利用全基因人工合成的方法構建了含有阪崎腸桿菌實時熒光PCR檢測靶基因外膜蛋白基因(ompA)序列的質粒標準分子，并利用紫外分光光度法和高分辨電感耦合等離子體發(fā)射質譜(HR-1CP-MS)對其進行定量，保證了其良好的溯源性。本發(fā)明的質粒標準分子具有均勻性強，穩(wěn)定性高的優(yōu)點，同時本發(fā)明解決了阪崎腸桿菌實時熒光PCR檢測中標準物質缺乏的難題，保證阪崎腸桿菌實時熒光PCR方法檢測結果的可比性，為阪崎腸桿菌實時熒光PCR方法檢測提供質量控制。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0051]圖1是本發(fā)明質粒標準分子PXL07的圖譜。
[0052]圖2是本發(fā)明所得質粒標準分子PXL07穩(wěn)定性檢測結果圖。
[0053]圖3是用本發(fā)明質粒標準分子PXL07建立的實時熒光PCR標準曲線。
【具體實施方式】
[0054]下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0055]實施例1質粒標準分子的構建
[0056]實驗試劑和實驗儀器:
[0057]質粒大量提取試劑盒(0MEGA)，其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純生化試劑；實驗儀器包括離心機、恒 溫水浴鍋、恒溫培養(yǎng)搖床、移液槍等。
[0058]實驗方法包括以下步驟:
[0059]1、在GenBank中搜索阪崎腸桿菌的外膜蛋白基因(ompA)序列，
[0060]2、對上述序列進行分析，選擇合適的序列和合適的酶切位點。ompA基因序列長度為1425bp，兩端加上Hind III酶切位點。
[0061]3、將處理后的序列送至寶生物工程(大連)有限公司，由其負責進行全基因人工合成服務，包括單鏈Oligo DNA的合成、DNA片段拼接等工作，所得外膜蛋白基因(ompA)序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。將所得全長基因克隆至質粒載體pUC19中，構建獲得包含外膜蛋白基因(ompA)基因的質粒標準分子，將其命名為PXL07 (該質粒標準分子的序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示)，其中第450位到第1875位為外膜蛋白基因(ompA)基因序列，所得質粒標準分子的圖譜如圖1所示。
[0062]4、大量培養(yǎng)含有包含所得pXL07的重組大腸桿菌，利用質粒大量提取試劑盒(OMEGA)提取質粒，獲得高純度的質粒標準分子pXL07。經(jīng)過紫外分光光度計以及電泳進行純度分析，將質粒DNA標準分子置于-20°C保存，抽提質粒的方法包括以下步驟:
[0063]a、將100~200mL過夜培養(yǎng)的細菌于室溫5000 Xg離心10分鐘，棄去上清；
[0064]b、加入 12mL Solution I (含有 RNase A)，振蕩充分混勻;
[0065]C、加入12mL Solution II，上下顛倒溫和混勻，室溫放置2分鐘以使菌體充分裂解；[0066]d、加入16mL Solution III,立即上下充分顛倒混勻數(shù)次,直至形成均勻的白色沉淀；
[0067]e、≥ 12000Xg，4°C離心 10 分鐘；
[0068]f、吸取20mL上清小心地移至一個干凈的HiBind Maxi吸附柱中(置于50mL收集管中)，5000 Xg室溫離心5分鐘；
[0069]g、棄去收集管中的液體，加入IOmL Buffer HB清洗吸附柱，5000Xg室溫離心5分鐘；
[0070]h、棄去收集管中的液體，加入15mL DNA Wash Buffer (無水乙醇稀釋)清洗吸附柱；
[0071]1、重復上述清洗步驟；
[0072]j、6000Xg離心15分鐘以干燥吸附柱；
[0073]k、將吸附柱置于一個干凈的50mL管中，加入2mL~3mLTE緩沖液，室溫放置1~2分鐘，8000 X g離心2分鐘以洗脫DNA，所得DNA溶液即為提取的質粒標準分子溶液，保存在-20°C
[0074]5、測序驗證質粒標準分子pXL07
[0075]將提取的質粒標準分子送至八家測序公司進行序列驗證，八家測序公司分別為北京六合華大基因科技股份有限公司、上海博尚生物技術有限公司、英濰捷基(上海)貿易有限公司、上海杰李生物技術有限公司、上海美吉生物技術有限公司、上海生工生物技術有限公司、蘇州金唯智生物科技有限公司、寶生物生物工程有限公司。對于質粒DNA標準物質來說，序列長度與定量有直接關系，通過8家不同的測序公司進行序列測定是標準物質研制中對于定值的要求(詳見ISO導則35，標準物質定值部分的具體要求)。
[0076]序列考察公式:序列正確率=正確堿基數(shù)目/堿基總數(shù)。
[0077]測序結果證明，所有參與序列驗證的單位得到的序列正確率為100%。
[0078]實驗結果為:經(jīng)過序列選擇步驟、全基因人工合成步驟以及質粒大量提取等步驟得到高純度的質粒標準分子PXL07，經(jīng)測序驗證，質粒標準分子插入片段序列與設計完全相符，其中第450位到第1875位為外膜蛋白基因(ompA)基因序列。
[0079]實施例2質粒標準分子pXL07的均勻性檢驗
[0080]均勻性是表征物質中一種或多種特性相關的結構或組成的一致性狀態(tài)。通過測量取自不同包裝單元(如瓶、包等)或取自同一包裝單元不同位置的規(guī)定大小的樣品，測量結果落在規(guī)定不確定度范圍內，則可認為該標準物質對指定的特性量是均勻的。均勻性是標準物質的基本屬性，用于描述標準物質特性的空間分布特征。在標準物質的研制(生產)過程中必須進行均勻性評估，以證明其具有良好的均勻性。均勻性良好的質粒標準分子，其量值不會受到分裝等因素的影響，各瓶間的量值差異不大，因此保證了檢測結果的可靠性。
[0081]實驗試劑TE緩沖液(PH7.5)。實驗儀器Nanodrops ND-2000。
[0082]實驗方法:
[0083]1、按照《JJG1006-1994 —級標準物質技術規(guī)范》均勻性抽取樣品要求，從各質粒DNA標準物質中隨機抽取15瓶。
[0084]2、對所取每個樣品取樣3次，每次取樣量為1μL。每個取樣量用紫外分光光度重復測定3次，取平均值。[0085]3、對測定結果用F檢驗法進行統(tǒng)計，判斷均勻性檢驗結果。具體方法為:抽取m個樣本，在相同條件下測得m組等精度測量數(shù)據(jù)，如果測定方差無顯著性差異，則應滿足下式的統(tǒng)計要求。
[0086]
【權利要求】
1.一種阪崎腸桿菌的質粒標準分子，其特征在于，該質粒標準分子包含阪崎腸桿菌的外月旲蛋白基因(ompA)序列,所述外?旲蛋白基因(ompA)序列如序列表中SEQ ID NO:1所不。
2.一種阪崎腸桿菌的質粒標準分子，其特征在于，該質粒標準分子的序列如序列表中SEQ ID NO:2 所示。
3.—種如權利要求1或2所述阪崎腸桿菌的質粒標準分子的定量方法，其特征在于，其包括以下步驟: ①提取質粒標準分子； ②根據(jù)步驟①所得的質粒標準分子的堿基組成和序列長度，計算質粒標準分子中的磷元素的含量； ③配制梯度濃度的磷標準溶液，并用此標準溶液作出高分辨電感耦合等離子體發(fā)射質譜的標準曲線； ④高分辨電感耦合等離子體發(fā)射質譜檢測質粒標準分子溶液，并根據(jù)步驟③所得的標準曲線得出質粒標準分子溶液的磷含量； ⑤根據(jù)步驟④所得的質粒標準分子溶液的磷含量和步驟②所得的質粒標準分子中的磷元素的含量，計算出質粒標準分子的濃度。
4.如權利要求3所述阪崎腸桿菌的質粒標準分子的定量方法，其特征在于，步驟③所述高分辨電感耦合等離子體發(fā)射質譜檢測的條件為:冷卻氣流量為10L/min~25L/min，輔助氣流量為0.5L/min~3.0L/min,霧化氣流量為0.5L/min~1.5L/min,功率為1200W~1400W。
5.如權利要求3所述阪崎腸桿菌的質粒標準分子的定量方法，其特征在于，步驟③所述高分辨電感耦合等離子體發(fā)射質譜檢測的條件為:冷卻氣流量為16.86L/min，輔助氣流量為0.88L/min，霧化氣流量為1.123L/min，功率為1350W。
6.一種阪崎腸桿菌實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，所采用的標準物質是如權利要求1或2所述的質粒標準分子。
7.如權利要求1或2所述的質粒標準分子在阪崎腸桿菌實時熒光定量PCR檢測中的應用。
8.—種如權利要求1或2所述的阪崎腸桿菌的質粒標準分子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: ①人工合成阪崎腸桿菌的外膜蛋白基因(ompA)序列，所述外膜蛋白基因(ompA)序列如序列表中SEQ ID NO:1所示； ②將步驟①所得阪崎腸桿菌的外膜蛋白基因(ompA)序列克隆至克隆載體上，得到阪崎腸桿菌的質粒標準分子。
9.如權利要求8所述的阪崎腸桿菌的質粒標準分子的制備方法，其特征在于，步驟②所述克隆載體為 PUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScript II SK 或 pGEM。
10.如權利要求8所述的阪崎腸桿菌的質粒標準分子的制備方法，其特征在于，步驟②所述克隆載體為PUC19。
【文檔編號】C12N15/63GK103497963SQ201310482883
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權日:2013年10月15日
【發(fā)明者】許麗, 劉剛, 李蘭英, 梁文, 李妍, 徐勤, 聞艷麗 申請人:上海市計量測試技術研究院