一種多重pcr法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組及試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組及試劑盒和方法。所述引物組包括三對引物，第一對引物的上下游序列分別如SEQ?ID?No.1～2所示，第二對引物的上下游序列分別如SEQ?ID?No.3～4所示，第三對引物的上下游序列分別如SEQ?ID?No.5～6所示。該引物組有極強(qiáng)的特異性，每一對引物僅能擴(kuò)增相應(yīng)病害的病原菌特異性片段，因此可用于對水稻白枯葉病原菌、水稻細(xì)菌性條斑病原菌和水稻細(xì)菌性谷枯病原菌這三種病原菌進(jìn)行同時、快速、準(zhǔn)確的檢測鑒定。
【專利說明】—種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組及試劑盒和方法【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于植物病原菌檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域，具體涉及一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組及試劑盒和方法?！颈尘凹夹g(shù)】[0002]水稻是最重要的糧食作物，世界上一半人口以水稻為生。隨著水稻種質(zhì)資源的調(diào)運(yùn)日益頻繁，一些水稻病害隨種子調(diào)運(yùn)而嚴(yán)重?cái)U(kuò)散，對稻米產(chǎn)量造成了不可挽回的損失。因此，重視并加強(qiáng)檢驗(yàn)檢疫工作，對切實(shí)保障稻米生產(chǎn)安全及產(chǎn)地生態(tài)安全有著重要的意義。 此外，我國加入WTO后，在植物出入境檢疫方面亦面臨著空前的挑戰(zhàn)。為確保我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，必須一方面有效制止病蟲害傳入我國，另一方面則要保證我國出口的農(nóng)產(chǎn)品符合進(jìn)口國的要求。而這些檢疫、防疫工作的落實(shí)則依賴靈敏、準(zhǔn)確以及便捷的病原檢測技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。[0003]2007年，農(nóng)業(yè)部匯同國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局共同制定了《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》，該目錄中明確規(guī)定水稻白葉枯病(Rice bacterial leaf blight)、水稻細(xì)菌性條斑病(Rice bacterial leaf streak)和水稻細(xì)菌性谷枯病 (Bacterial grain rot)為水稻的檢疫性病害。由于帶菌種子是這三種病害的主要初侵染源與傳播途徑，因此及早檢測發(fā)現(xiàn)種子上的病原菌及有無癥狀病害，對于預(yù)防及采取相應(yīng)措施加以防治、指導(dǎo)生產(chǎn)、減少經(jīng)濟(jì)損失等均有著重要的意義。[0004]現(xiàn)階段已有許多技術(shù)應(yīng)用到對水稻白葉枯病、細(xì)菌性條斑病和細(xì)菌性谷枯病的檢驗(yàn)檢疫，例如經(jīng)典的產(chǎn)地檢驗(yàn)、育苗生長觀察法、選擇性分離、噬菌體檢測、致病性測定、免疫分離、血清學(xué)檢測技術(shù)等，但主要還是依據(jù)三種病原菌的生理生化差異來區(qū)分。根據(jù)《中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》中關(guān)于水稻白葉枯病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌的檢測方法規(guī)定，對于出入境種子首先需要進(jìn)行樣品的清洗、研磨并獲得提取液，然后進(jìn)行 SPA的平板培養(yǎng)，或利用ELISA試劑盒對提取液進(jìn)行快速篩選檢測。對于檢測結(jié)果呈陽性的還需進(jìn)行進(jìn)一步的平板分離和生化鑒定。整個過程程序復(fù)雜，耗時長，且仍有可能造成假陽性。[0005]近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)已廣泛用于水稻白葉枯病、細(xì)菌性谷枯病和細(xì)菌性條斑病的檢測(TakeuchiT, Sawada H, Suzuki F，et al.Specific detection of Burkholderia plantarii and B.glumae by PCR using primers selected from thel6S_23S rDNA spacer regions [J].The Phytopathological Society of Japan，1997，63 (6):455—462.；Cottyn Bj Bautista A Tj Nelson R J，et al.Polymerase chain reaction amplification of DNA from bacterial pathogens of rice using specific oligonucleotide primers.1nt Rice Notes，1994，19:30~32.；GnanamanickamSSj Sakthivel N，Nelson R J，et al.Evaluation of Culture Media and Molecular Probesfor Detection of Xanthomonas oryzae pv.0ryzae in Rice.1n:Verma J Pj VarmaA,KUMAR Dj ed.Detection of Plant Pathogens and Their Management.New Delh1: Angkor Publishers, 1995，336~349.;張華，姜英華，胡白石，等.利用PCR技術(shù)專化性檢測水稻細(xì)菌性條斑病菌.植物病理學(xué)報(bào)，2008，38(1):1~5.;懷雁，等.水稻細(xì)菌性谷枯病菌的實(shí)時熒光PCR檢測技術(shù)研究.中國水稻科學(xué)，2003，23(1):107~110.;張華，胡白石，劉鳳權(quán).雙重PCR技術(shù)檢測水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌.植物檢疫，2007，21增刊)。[0006]但是，現(xiàn)有技術(shù)只能對水稻白枯葉病原菌、水稻細(xì)菌性條斑病原菌和水稻細(xì)菌性谷枯病原菌中的一種或兩種進(jìn)行檢測鑒定，能同時對這三種病原菌進(jìn)行檢測鑒定的方法仍未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明公開了一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組，利用該引物組可以同對水稻白枯葉病原菌、水稻細(xì)菌性條斑病原菌和水稻細(xì)菌性谷枯病原菌這三種病原菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測鑒定。[0008]多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組，包括三對引物:[0009]第一對引物的堿基序列為:[0010]上游引物:5'-CCTCTATGAGTCGGGAGCTG-3'；[0011]下游引物:5'-ACACCGTGATGCAATGAAGA-3'；[0012]第二對引物的堿基序列為:[0013]上游引物:5'-CAAGACAGACATTGCTGGCA-3'；[0014]下游引物:5'-GGTCTGGAATTTGTACTCCG-3'；[0015]第三對引物的堿基序列為:[0016]上游引物:5'-TCATCCTCTGACTGGCTCAA-3'；[0017]下游引物:5'-CGCTTCCGCTATCCACTTTA-3'。[0018]在GenBank中搜索水稻白葉枯病原菌(Xanthomonas.0ryzae pv.0ryzae)和細(xì)菌性條斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola)的基因并進(jìn)行BLAST比對,分別獲得了水稻白葉枯病原菌的特異性基因Glycosyltransferase (GenBank號為:AF169030.1，編碼糖基轉(zhuǎn)移酶Glycosyltransferase),以及細(xì)菌性條斑病原菌的特異性基因AvrRxo (GenBank號為: AY395713.1)。針對X.0ryzae pv.0ryzae 在 Glycosyltransferase 基因的特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)了所述第一對引物，針對X.0ryzae pv.0ryzicola在AvrRxo基因的特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)了所述第二對引物。[0019]對水稻細(xì)菌性谷枯病原菌(Burkolderia glumae)的16s rDNA (GenBank號為: D87080)進(jìn)行 BLAST 搜索,獲得了與其同源性極高的 B.plantarii, B.gladioli, B.cepalia 的16s rDNA序列；對這些序列進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)了 B.glumae的16s rDNA的保守區(qū)和特異性區(qū)域，針對該特異性區(qū)域設(shè)計(jì)了所述第三對引物。[0020]本發(fā)明還提供了一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的方法，包括:[0021 ] (I)提取待檢樣品的DNA ;[0022](2)以提取的DNA為模板，利用所述引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增；[0023](3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分離、染色，根據(jù)擴(kuò)增條帶判定待測樣品中水稻檢疫性病原菌的種類；[0024]所述水稻檢疫性病原菌為水稻白葉枯病原菌、水稻細(xì)菌性條斑病原菌和水稻細(xì)菌性谷枯病原菌。[0025]若待檢樣品中病原侵染的程度很低，容易導(dǎo)致無法檢測到相應(yīng)的病原菌。為避免出現(xiàn)“假陰性”結(jié)果，作為優(yōu)選，PCR擴(kuò)增體系中，水稻白葉枯病原菌DNA的濃度不低于0.01ng/ μ L ;水稻細(xì)菌性條斑病原菌DNA的濃度不低于0.05ng/ μ L ;水稻細(xì)菌性谷枯病原菌 DNA 的濃度不低于 0.1ng/μ L0 0.01ng/μ L,0.05ng/yL、0.1ng/μ L 即是相應(yīng)病原菌 DNA 的檢出限，本發(fā)明中，“檢出限(limit of detection)”是指在本發(fā)明的PCR條件下,相應(yīng)病原菌DNA能夠被檢測出來的最低濃度。[0026]作為優(yōu)選，PCR擴(kuò)增體系為50 μ L，其中，2XTaq PCR Master Mix緩沖液25 μ L， 10 μ M的引物各I μ L，DNA模板的終濃度不低于檢出限，滅菌去離子水補(bǔ)至50 μ L ;所述 2 X Taq PCR Master Mix 緩沖液中含有 1.5mMMg2+、200 μ M dNTPUU Taq 酶。[0027]PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 個循環(huán)；最后72°C延伸5min。[0028]本發(fā)明還提供了一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的試劑盒，包括PCR緩沖液，MgCl2, dNTP, Taq酶，引物，陽性對照DNA和滅菌去離子水，所述引物即為本發(fā)明所述引物組。[0029]作為優(yōu)選，所述試劑盒中采用2XTaq PCR Master Mix緩沖液，該緩沖液中含有 Mg2+、dNTP、Taq酶，因此不必另外設(shè)置上述的MgCl2, dNTP, Taq酶，試劑盒內(nèi)只配備2 XPCR Master Mix緩沖液、引物、陽性對照DNA和滅菌去離子水即可,不僅節(jié)約試劑盒內(nèi)空間也大大簡化了 PCR過程，只需在2 X Taq PCR Master Mix緩沖液中加入模板、引物組和滅菌去離子水，即可進(jìn)行反應(yīng)。[0030]作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括核酸提取液和膠回收提取液。如此一來，利用該試劑盒即可完成對待測樣品進(jìn)行核酸提取、膠回收純化的一系列步驟，不必再另外使用其他的核酸提取試劑盒以及膠回收試劑盒。[0031]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的引物組具有極強(qiáng)的特異性，僅能擴(kuò)增相應(yīng)病害的病原菌特異性片段，因此可用于對水稻白枯葉病原菌、水稻細(xì)菌性條斑病原菌和水稻細(xì)菌性谷枯病原菌這三種病原菌進(jìn)行同時、快速、準(zhǔn)確的檢測鑒定。此外，由于本發(fā)明僅在一個PCR管中即可實(shí)現(xiàn)對三種病原菌的同時檢測，因此大大降低了成本?！緦＠綀D】

【附圖說明】[0032] 圖1為引物JLXooF/JLXooR對各水稻病原菌的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-4 泳道依次為 X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、Z173, 5-9 泳道依次為 X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1，10-20 泳道依次為:X.maltophilia, X.campestris, B.gladioli pv.alliicola, B.cepacia, B.glumae, Pellicularia sasakii，F(xiàn)usarium oxysporumf.sp.niveum, Magnaporthe oryzae C30， Magnaporthe oryzae CHL441， Ustilaginoidea oryzae LN, Ustilaginoidea oryzae SX0201 ；[0033]圖2為引物JLXocF/JLXocR對各水稻病原菌的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；其中，M為DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，1~5泳道依次為X.0ryzae pv.0ryzicola的五個菌株AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1，6-9 泳道依次為 X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、 Z173，10-20 泳道依次為:X.maltophilia, X.campestris, B.gladioli pv.alliicola, B.cepacia, B.glumae, Pellicularia sasakii，F(xiàn)usarium oxysporumf.sp.niveum, Magnaporthe oryzae C30， Magnaporthe oryzae CHL441， Ustilaginoidea oryzae LN, Ustilaginoidea oryzae SX0201 ；[0034]圖3為引物JLBgF/JLBgR對各水稻病原菌的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I 泳道為 B.glumae，2 泳道為 B.gladioli pv.alliicola，3 泳道為 B.cepacia， 4-7 泳道依次為 X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、Z173，8_12 泳道依次為 X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1，13-20 泳道依次 為:X.maltophilia，X.campestris，Pellicularia sasakii，F(xiàn)usarium oxysporumf.sp.niveum, Magnaporthe oryzae C30，Magnaporthe oryzae CHL441，Ustilaginoidea oryzae LN，Ustilaginoidea oryzae SX0201 ；[0035]圖4為引物JLXooF/JLXooR的靈敏度檢測結(jié)果圖；[0036]圖5為引物JLXocF/JLXocR的靈敏度檢測結(jié)果圖；[0037]圖6為引物JLBgF/JLBgR的靈敏度檢測結(jié)果圖；[0038]圖4-6中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-9泳道對應(yīng)的DNA模板濃度依次為:lng/uL， 5X10 1Iig/ μ L，I X 10 1Iig/ μ L，5 X 10 2ng/ μ L，I X 10 2ng/ μ L，5 X 10 3ng/ μ L，I X 10 3ng/ μ L，5 X 10 4ng/ μ L，I X 10 4ng/ μ L ；[0039]圖7為本發(fā)明引物組對三種水稻檢疫性病原菌的多重PCR同步檢測結(jié)果圖；其中， M 為 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-3 泳道依次為 X.0ryzae pv.0ryzae Ζ173、Χ.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-K B.glumae 的 DNA ；4 泳道為 X.0ryzae pv.0ryzae Z173 和 X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1 的 DNA 混合物；5 泳道為 X.0ryzae pv.0ryzae Z173 和 B.glumae 的 DNA 混合物；6泳道為 X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1 和 B.glumae 的 DNA 混合物；7 泳道為 X.0ryzae pv.0ryzae Ζ173、Χ.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1 和 Β.glumae 的 DNA 混合物；[0040]圖8為利用現(xiàn)有引物對各水稻病原菌的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-6 泳道為 X.0ryzae pv.0ryzicola JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1、AHB4-75 以及 X.0ryzae pv.0ryzae 0S225，7-11 泳道為 X.0ryzae pv.0ryzae 0S86、0S198、0S225、Z173 以及 X.0ryzae pv.0ryzicola JSB322 ；[0041 ] 圖9為引物JLXooF/JLXooR和JLXocF/JLXocR對帶菌水稻葉片的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1，2泳道分別為X.0ryzae pv.0ryzae Z173、0S198，3， 4 泳道分別為 X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1、AHB4_75，5，6 分別為人工接種 X.0ryzae pv.0ryzae Z173、0S198的水稻葉片提取物，7，8分別為人工接種X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1、AHB4-75的水稻葉片提取物，9泳道為同時接種X.0ryzae pv.0ryzae Z173 和X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1的水稻葉片提取物，10泳道為同時接種X.0ryzae pv.0ryzae 0S198 和 X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75 的水稻葉片提取物，11，12 為健康水稻葉片?！揪唧w實(shí)施方式】[0042]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)說明。[0043]I引物設(shè)計(jì)[0044]在GenBank中搜索水稻白葉枯病原菌(Xanthomonas.0ryzae pv.0ryzae)和細(xì)菌性條斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola)的基因并進(jìn)行BLAST比對,分別獲得了水稻白葉枯病原菌的特異性基因Glycosyltransferase (GenBank號為:AF169030.1，編碼糖基轉(zhuǎn)移酶Glycosyltransferase),以及細(xì)菌性條斑病原菌的特異性基因AvrRxo (GenBank號為: AY395713.1)。針對X.0ryzae pv.0ryzae 在 Glycosyltransferase 基因的特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)了第一對引物JLXooF/JLXooR,針對X.0ryzae pv.0ryzicola在AvrRxo基因的特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)了第二對引物 JLXocF/JLXocR。[0045]第一對引物JLXooF/JLXooR的堿基序列為:[0046]JLXooF:5/ -CCTCTATGAGTCGGGAGCTG-3' (SEQ ID N0.1)；[0047]JLXooR:5/ -ACACCGTGATGCAATGAAGA-3' (SEQ ID N0.2)；[0048]第二對引物JLXocF/JLXocR的堿基序列為:[0049]JLXocF:5/ -CAAGACAGACATTGCTGGCA-3' (SEQ ID N0.3)；[0050]JLXocR:5/ -GGTCTGGAATTTGTACTCCG-3' (SEQ ID N0.4)；[0051]對水稻細(xì)菌性谷枯病原菌(Burkolderia glumae)的16s rDNA (GenBank號為: D87080)進(jìn)行 BLAST 搜索,獲得了與其同源性極高的 B.plantarii, B.gladioli, B.cepalia 的16s rDNA序列；對這些序列進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)了 B.glumae的16s rDNA的保守區(qū)和特異性區(qū)域，針對該特異性區(qū)域設(shè)計(jì)了第三對引物JLBgF/JLBgR，其堿基序列為:[0052]JLBgF:5/ -TCATCCTCTGACTGGCTCAA-3' (SEQ ID N0.5)；[0053]JLBgR:5/ -CGCTTCCGCTATCCACTTTA-3' (SEQ ID N0.6)。[0054]2引物的特異性檢測[0055]分別提取水稻白葉枯病原菌(X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、 Z173)、水稻細(xì)菌性條斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、 GXB3-14、SCB4-1)、水稻細(xì)菌性谷枯病原菌(B.glumae)、以及其他植物病原菌(B.cepacia, B.gladioli pv.alliicola、X.maltophilia、X.campestris、Pellicularia sasaki1、 Fusarium oxysporumf.sp.niveum、Magnaporthe oryzae C30、Magnaporthe oryzae CHL441>Ustilaginoidea oryzae LN>Ustilaginoidea oryzae SX0201)的 DNA,這些植物病原菌由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、浙江大學(xué)、浙江師范大學(xué)提供或購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。DNA 的提取方法為參見生工細(xì)菌DNA提取試劑盒的說明書。[0056]以上述提取的DNA為模板，分別用設(shè)計(jì)的三對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測這三對引物的特異性。[0057]PCR 擴(kuò)增體系為 50μ L，其中，2XTaq PCR Master Mix 緩沖液 25 μ L (含 1.5mM Mg2+、200 μ M dNTP、IU Taq 酶)，10 μ M 的引物各 I μ L，10ng/ul 的 DNA 模板 I μ L，滅菌去離子水補(bǔ)至50 μ L0[0058]PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 個循環(huán)；最后72°C延伸5min。[0059]檢測結(jié)果分別見圖1、圖2和圖3。[0060]由圖1可見，當(dāng)用引物JLXooF/JLXooR分別對上述DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時， X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、Z173均出現(xiàn)了特異性條帶，而其他病原菌未出現(xiàn)條帶，說明引物JLXooF/JLXooR對水稻白葉枯病原菌X.0ryzae pv.0ryzae具有較高的特異性。[0061 ] 由圖2可見，當(dāng)用引物JLXocF/JLXocR分別對上述DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時， X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1 均出現(xiàn)了特異性條帶，而其他病原菌未出現(xiàn)條帶，說明引物JLXocF/JLXoCR對水稻細(xì)菌性條斑病原菌 X.0ryzae pv.0ryzicola具有較高的特異性。[0062]由圖3可見，當(dāng)用引物JLBgF/JLBgR分別對上述DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，僅B.glumae出現(xiàn)了特異性條帶,其他病原菌均未出現(xiàn)條帶,說明引物JLBgF/JLBgR對水稻細(xì)菌性谷枯病原菌B.glumae具有較高的特異性。[0063]3引物的靈敏度檢測[0064]用無菌水分別對水稻白葉枯病原菌X.0ryzae pv.0ryzae Z173的DNA、水稻細(xì)菌性條斑病原菌X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1的DNA、水稻細(xì)菌性谷枯病原菌B.glumae 的 DNA 進(jìn)行一系列稀釋,使其濃度依次為:lng/ μ L, 5xl0_1ng/ μ L, lxlO_1ng/ μ L, 5xl0_2ng/ μ L,IxlO2ng/μ L,5x103ng/μ L,IxlO3ng/μ L,5x104ng/μ L 和 IxlO 4ng/μ L0[0065]分別取I μ L的各濃度DNA作為模板，利用相應(yīng)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測引物的靈敏度。PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序同上，檢測結(jié)果見圖4、圖5、圖6。[0066]由圖4 可見，引物 JLXooF/JLXooR 對 X.0ryzae pv.0ryzae Z173 的檢出限為 0.01ng/ μ L0 由圖 5 可見，引物 JLXocF/JLXocR 對 X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1 的檢出限為0.05ng/yL。由圖6可見，引物JLBgF/JLBgR對B.glumae的檢出限為0.1ng/μ L。由此可見，本發(fā)明的三對引物均具有較高的靈敏度。[0067]4多重PCR同步檢測[0068]為實(shí)現(xiàn)對三種水稻檢疫性病原菌的同步檢測，以X.0ryzae pv.0ryzae Z173、 X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4_1、B.glumae為例，分別將三種病原菌的DNA等量混合、兩種病原菌的DNA等量混合、僅一種病原菌DNA作為模板，在每個擴(kuò)增體系中均同時加入引物 JLXooF/JLXooR,引物JLXocF/JLXocR、引物JLBgF/JLBgR，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序同上。擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖7。[0069]由圖7可見，在以一種病原菌DNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物中，只有一條特異性條帶；在以兩種病原菌的DNA等量混合為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物中，可以得到兩條特異性條帶；在以三種病原菌的DNA等量混合為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物中，可以得到三條特異性條帶；說明利用本發(fā)明的引物組進(jìn)行多重PCR可以用于對三種水稻檢疫性病原菌進(jìn)行同步檢測，并且，檢測結(jié)果精確可/[目。[0070]5、利用已公開引物檢測水稻白葉枯病原菌和水稻細(xì)菌性條斑病原菌[0071]分別以X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、Z173, X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1這九個菌株的DNA為模板，分別利用文獻(xiàn) (Cho M, Kang M, Kim C, Sensitive and Specific Detection of Xanthomonas oryzae pv.0ry zae by RealTime Bio-PCR Using Pathovar-Specific Primers Based on an rhs Family Gene,Plant Disease，2011，95 (5)589-594.)中公開的引物 Xoo290F/Xoo290R (SEQ ID N0.7~8)、文獻(xiàn)(張華，姜英華，胡白石，劉鳳權(quán)，許志剛.利用PCR技術(shù)?；詸z測水稻細(xì)菌性條斑病菌，植物病理學(xué)報(bào)，2008，38 (I) 1-5.)中公開的引物XoocF/XoocR (SEQ IDN0.9~10)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)該引物對水稻白葉枯病原菌和水稻細(xì)菌性條斑病原菌的特異性，PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序同上。擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖8。[0072]由圖8 可見，引物 XoocF/XoocR 從 X.0ryzae pv.0ryzicola 各菌株以及 X.0ryzae pv.0ryzae 0S225 中擴(kuò)增出條帶，引物 Xoo290F/Xoo290R 則從 X.0ryzae pv.0ryzae 各菌株以及X.0ryzae pv.0ryzicola JSB322中擴(kuò)增出條帶。表明這兩對引物對水稻白葉枯病原菌和水稻細(xì)菌性條斑病原菌的檢測特異性較低。[0073]6對水稻帶病葉片的檢測[0074]分別用剪葉法和針孔注射法對水稻9311葉片進(jìn)行白葉枯病原菌(X.0ryzae pv.0ryzae Z173、0S198)和細(xì)菌性條斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1>AHB4-75) 的人工接種，并提取病斑(含病斑周圍水稻組織)的DNA。以提取的DNA為模板，利用引物 JLXooF/JLXooR和JLXocF/JLXocR進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序同上。擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖9。[0075]由圖9可見，經(jīng)相應(yīng)病原菌接種后，在水稻葉片的病斑組織中檢測到相應(yīng)的病原菌侵染，體現(xiàn)為電泳圖譜中出現(xiàn)了特異性的條帶。表明本發(fā)明的引物JLXooF/JLXooR和 JLXocF/JLXocR能夠在實(shí)際應(yīng)用中用于檢測鑒定水稻白葉枯病原菌和水稻細(xì)菌性條斑病原菌。由于水稻谷枯病在國內(nèi)尚屬少見，人工接種方法仍未建立，因此較難找到帶菌葉片或?qū)ζ溥M(jìn)行活體接種。[0076]7試劑盒[0077]利用上述設(shè)計(jì)的引物制備多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的試劑盒，該試劑盒中含有:核酸提取液、2XTaq PCR Master Mix 緩沖液(含 1.5mM Mg2\200yM dNTPUU Taq 酶)、引物 JLXooF/JLXooR、引物 JLXocF/JLXocR、引物 JLBgF/JLBgR、陽性對照 DNA、滅菌去離子水以及膠回收提取液。利用該試劑盒可以實(shí)現(xiàn)對待測樣品進(jìn)行核酸提取、多重PCR擴(kuò)增、 膠回收純化獲得擴(kuò)增片段的一系列步驟。
【權(quán)利要求】
1.一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組，其特征在于，包括三對引物:第一對引物的堿基序列為:上游引物:5' -CCTCTATGAGTCGGGAGCTG-3'；下游引物:5' -ACACCGTGATGCAATGAAGA-3'；第二對引物的堿基序列為:上游引物:5' -CAAGACAGACATTGCTGGCA-3'；下游引物:5' -GGTCTGGAATTTGTACTCCG-3'；第三對引物的堿基序列為:上游引物:5' -TCATCCTCTGACTGGCTCAA-3'；下游引物:5' -CGCTTCCGCTATCCACTTTA-3'。
2.—種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的方法，包括:(1)提取待檢樣品的DNA；(2)以提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分離、染色，根據(jù)擴(kuò)增條帶判定待測樣品中水稻檢疫性病原菌的種類；所述水稻檢疫性病原菌為水稻白葉枯病原菌(Xanthomonas.0ryzae pv.0ryzae)、水稻細(xì)菌性條斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola)和水稻細(xì)菌性谷枯病原菌(Burkolderia glumae)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增體系中水稻白葉枯病原菌DNA的濃度不低于0.01ng/μ L0
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增體系中水稻細(xì)菌性條斑病原菌DNA 的濃度不低于0.05ng/ μ L。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增體系中水稻細(xì)菌性谷枯病原菌DNA 的濃度不低于0.1ng/μ L0
6.如權(quán)利要求2~5任一所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增體系為50μ L，其中， 2 X Taq PCR Master Mix緩沖液25 μ L，10 μ M的引物各I μ L，DNA模板的終濃度不低于檢出限，滅菌去離子水補(bǔ)至50 μ L ;所述2XTaqPCR Master Mix緩沖液中含有1.5mM Mg2+、 200 μ M dNTPUU Taq 酶。
7.一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的試劑盒，包括PCR緩沖液，MgCl2, dNTP，Taq 酶，引物，陽性對照DNA和滅菌去離子水，其特征在于，所述引物為權(quán)利要求1所述的引物組。
8.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特`征在于，還包括核酸提取液和膠回收提取液。
【文檔編號】C12R1/01GK103498000SQ201310473978
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】王雪艷, 陸雯, 潘潞琪, 姚含笑 申請人:中國計(jì)量學(xué)院