一種鄰硝基苯甲酸降解酶的編碼基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于酶基因工程及酶工程領域，涉及一種鄰硝基苯甲酸降解酶的編碼基因及其應用。一種鄰硝基苯甲酸降解酶的編碼基因(基因nbaB)，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。一種所述的編碼基因所編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本發(fā)明從Pseudomonas?sp.ONBA-17中克隆得到負責2-NBA代謝的基因片段——nbaB。本發(fā)明能夠為2-NBA的降解提供有效的生物技術手段，對于2-NBA污染環(huán)境的修復具有重要意義。
【專利說明】一種鄰硝基苯甲酸降解酶的編碼基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于酶基因工程及酶工程領域，涉及一種鄰硝基苯甲酸降解酶的編碼基因及其應用 。
【背景技術】
[0002]隨著我國化學工業(yè)的快速發(fā)展，有機合成所產三廢(廢水、廢氣、廢渣)產生量呈逐年遞增之勢。上述三廢中存在大量對生物體有毒害作用的物質，對環(huán)境造成了極為嚴重的污染和危害，威脅到人類和其它生物的安全和健康。其中，又以硝基芳香化合物的相關污染問題最為關出。
[0003]硝基芳香化合物廣泛存在于自然界中，主要應用于染料、殺蟲劑、炸藥、農藥、醫(yī)藥及其它化工產品的生產。隨著工農業(yè)的迅速發(fā)展，進入到環(huán)境中的硝基芳香化合物日益增多，給人類賴以生存的生態(tài)環(huán)境造成了嚴重的污染。此外，由于硝基和苯環(huán)結構的存在，使得硝基芳香化合物比其它化合物更難于生物降解。如何減少和去除此類化合物對生態(tài)環(huán)境的危害，已成為全社會共同關注的熱點問題。
[0004]鄰硝基苯甲酸(2-NBA)是有機合成和制備染料、香料，潤滑脂和潤滑油的抗氧劑和金銹劑等的重要中間體，其工業(yè)需求量十分巨大。該物質對環(huán)境有危害，會對水體和大氣造成污染，易在大氣化學和大氣物理變化中形成酸雨。當PH值降到5.0以下時，2-NBA會給動、植物造成嚴重危害，魚的繁殖和發(fā)育會受到嚴重影響。此外，水體酸化還會導致水生生物的組成結構發(fā)生變化，耐酸的藻類、真菌增多，而有根植物、細菌和脊椎動物減少，有機物的分解率降低。如何高效、低成本，且環(huán)境友好的去除2-NBA頗具研究意義。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明提供一種鄰硝基苯甲酸降解酶的編碼基因(基因nbaB)。
[0006]本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是:
[0007]一種鄰硝基苯甲酸降解酶的編碼基因(基因nbaB)，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]一種所述的編碼基因所編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]一種擴增所述的編碼基因的引物，其核苷酸序列分別為SEQ ID N0.3和SEQ ID
N0.4。
[0010]含有本發(fā)明所述基因的重組載體。
[0011]含有本發(fā)明所述基因的重組菌。
[0012]含有以上任一所述基因的表達盒、轉基因細胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0013]本發(fā)明從Pseudomonas sp.0NBA-17中克隆得到負責2-NBA代謝的基因片段——nbaB。本發(fā)明能夠為2-NBA的降解提供有效的生物技術手段，對于2-NBA污染環(huán)境的修復具有重要意義。該菌是假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)的菌株0NBA-17,于2013年9月2日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC N0.8095。保藏單位的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，該菌的分類命名為假單胞菌 Pseudomonas sp.。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1 是 Pseudomonas sp.0NBA-17 總 DNA(Genomic DNA)電泳檢測圖。
【具體實施方式】
[0015]下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術方案作進一步的具體說明。應當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。
[0016]在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。
[0017]實施例1Pseudomonas sp.0NBA-17 總 DNA (Genomic DNA)的提取
[0018]1.1Pseudomonas sD.0ΝΒΑ-17 的擴大培養(yǎng)
[0019]在無菌操作環(huán)境下，將_70°C保存的Pseudomonas sp.0NBA-17以接種針挑取小塊，放置、涂布于Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)基之上。28°C，靜置培養(yǎng)3d。挑選單菌落，經(jīng)2次轉接，觀察發(fā)現(xiàn)平板上菌落形態(tài)一致(無雜菌)。這里所述的“平板”和Luria-Bertani (LB)固體/液體培養(yǎng)基等均為微生物研究/生產領域常見術語、培養(yǎng)基、技術和方法，具體參見《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克，等著.分子克隆實驗指南(第三版)[M].黃培堂，等譯.北京:科學出版社，2008)。下文中如無特別備注或說明，均為微生物研究常用技術、方法、 培養(yǎng)基、試劑和藥品，且均在《分子克隆實驗指南》中有所記錄。
[0020]1.2Pseudomonas sp.0NBA-17 總 DNA 的提取
[0021]菌體總DNA的提取采用SDS高鹽沉淀法。挑取LB平板上的單菌落，接至IOOmL的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至穩(wěn)定期。離心收集菌體，加等體積的TEN溶液[IOmMTris-Cl (pH8.0), ImM EDTA(pH8.0), 0.1M NaCI]洗滌菌體，離心收集菌體，懸浮于 IOmLTE[IOmM Tris-Cl (ρΗ8.0), ImM EDTA(ρΗ8.0)]溶液中，加入 100 μ L 溶菌酶(100mg/mL)，37°C水浴 111，加入4(^1^蛋白酶1((2011^/1^)，再加入30(^1^20% (w/v% )的 SDS，37°C水浴過夜(約12h)。加入1/2體積飽和NaCl劇烈振蕩，12000g離心IOmin,上清用等體積酚:氯仿抽提2次，12000g離心lOmin，收集上清，加入等體積TE溶液(稀釋調整NaCl濃度)，
0.6倍體積異丙醇沉淀，12000g離心15min，70% (v/v% )乙醇洗滌沉淀，乙醇揮發(fā)后溶于100 μ L TE 中。
[0022]將提取到的菌體總DNA適當稀釋后，經(jīng)0.75% (w/v% )瓊脂糖電泳檢測其質量(如圖1所示)，發(fā)現(xiàn)所提取的總DNA大部分集中在23kb左右，基本上沒有RNA存在，純度較好，濃度較高。
[0023]實施例22-NBA降解酶編碼基因nbaB的獲得
[0024]經(jīng)過大量的分析實驗，從28對自行設計的引物中篩選出一對有效擴增引物(分別記為 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4)。
[0025]nbaB-f, 5，~ACGACGAATTCATGAGTTACCAAAACTTAG~3，(下劃線為 EcoRI 酶切位點，基因序列為SEQ ID N0.3)；
[0026]nbaB-r，5，-CATTCATCTAGAGGAAGACCAGGAGC-3 ’(下劃線為 XbaI 酶切位點，基因序列為 SEQ ID N0.4)。
[0027]25μ L 擴增體系:10XTaq DNA 聚合酶反應緩沖液 2.5 μ L ;dNTP (25mM) 2 μ L ;引物(25pmol/ μ L)各 0.5 μ L ；Mg2+ 緩沖液(25mM) 2.5 μ L ;實施例1 中所得總 DNA0.5 μ L (約IOOng) ;Taq 酶(5U/μ L) 0.3 μ L ;ddH2016.2 μ L。反應參數(shù):95 °C 預變性 5min，94 °C 變性30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸25 個循環(huán)，最后 72°C終延伸 5min。
[0028]擴增產物經(jīng)0.75% (w/v% )瓊脂糖電泳檢測，發(fā)現(xiàn)擴增片段與預期大小(1.9kb左右)相符。切取含有nbaB基因擴增片段的凝膠，放入無菌1.5mL離心管中稱重，使用B10MIGA膠回收純化試劑盒進行目的片段回收，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0029]所得PCR產物參照《分子克隆實驗指南》，進行TA克隆和后續(xù)操作，克隆用載體PMD19-T及相關試劑均購自寶生物生物技術有限公司(TaKaRa，大連)。挑取質粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證插入片段大小正確后，挑取克隆子交上海生工測序。所得nbaB編碼基因序列如SEQ ID N0.1所示，其相應氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示?；蛐蛄斜葘ο仁堑卿浢绹鴩疑锛夹g信息中心(NCBI)網(wǎng)站，再經(jīng)BLAST搜索引擎搜尋GenBank完成。
[0030]結果顯示，同nbaB編碼基因序列同源的功能基因最高序列同源性僅為84%(U49504.1)，且U49504.1指代基因未見其關于2-NBA降解的報道。而同NbaB氨基酸序列同源的蛋白最高序列同源性僅為82% (YP_987297.1)，且ΥΡ987297.1所指代的雙加氧酶未見其關于2-ΝΒΑ降解的報道。
[0031]實施例3pBBRlMCS_nbaB使先前不具備2-NBA降解能力的Pseudomonas sp.7獲得2-NBA降解能力
[0032]將實施例2中含有nbaB編碼基因片段的載體用EcoRI和XbaI雙酶切。經(jīng)0.75%瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切片段待用。再用EcoRI和XbaI雙酶切廣宿主質粒pBBRlMCS_5，然后用0.75%瓊脂糖凝膠電泳，回收pBBRlMCS-5載體片段。取8 μ L含有nbaB編碼基因的雙酶切片段和I μ L雙酶切pBBRlMCS-5，加入連接酶0.5μ L，bufferl μ 1，16°C連接過夜。將連接產物轉化到Escherichia coli,菌落PCR檢測單克隆,選取驗證正確的克隆測序,選取測序正確的克隆，獲得pBBRlMCS-nbaB。
[0033]Pseudomonas sp.7是實驗室保存的一株不具備2-NBA降解能力的菌株,我們通過用pBBRlMCS-nbaB轉化Pseudomonas sp.7來驗證nbaB是否能使該菌株獲取2-NBA降解能力。同時，這也是一個驗證性實驗，使得實施例2的實驗更具有邏輯性和嚴謹性。用通用電轉化感受態(tài)的制備方法制備Pseudomonas sp.7的電轉化感受態(tài)。采用MicroPulser電轉化儀，在 40 μ LPseudomonas sp.7 的感受態(tài)中加入 I μ I pBBRlMCS-nbaB,電壓 2.5kV,電擊
4.4ms，然后加入ImL LB液體培養(yǎng)基，30°C，200rpm,復蘇2h。將復蘇完的菌液涂布到含慶大霉素的LB固體平板上，30°C培養(yǎng)2天，獲得單克隆。
[0034]將所有的單克隆劃線培養(yǎng)后，接種含有100mg/L的無機鹽培養(yǎng)基(MM)中。麗培養(yǎng)基配方為(g/L) =NH4NO3L O, KH2PO40.5，K2HPO4L 5，NaCl0.5，MgSO4.7Η200.2，ρΗ7.2。參照 Yoshie Hasegawa 等人的方法(Yoshie Hasegawa et al.2000.A novel degradativepathway of2_nitrobenzoate via3-hydroxyanthranilate in Pseudomonas fluorescensstrain KU-7.FEMS Microbiology Letters，190:185-190)，檢測 2-NBA 殘留量。共計檢測單克隆74個，發(fā)現(xiàn)其中16個具有2-NBA降解代謝活性，表明我們獲得了具有2-NBA降解活性的菌株。
[0035]實施例42-NBA-16菌株對2-NBA的生物降解實驗
[0036]隨機挑選實施3中具有2-NBA降解活性的16株菌株中的一株(編號2_NBA_16)，將該菌株接種于含有不同濃度2-NBA的麗培養(yǎng)基中，2-NBA濃度分別為500mg/L，600mg/L, 700mg/L，800mg/L，900mg/L，1000mg/L，25°C，200rpm,振蕩培養(yǎng)。同時，接種 Pseudomonassp.7至上述2-NBA濃度麗培養(yǎng)基中，作為對照。參照實施例3中的2-NBA含量檢測方法定時測定培養(yǎng)基中2-NBA的含量。參照Ashvini Chauhan和Rakesh K.Jain的方法(AshviniChauhan and Rakesh K.Jain.Degradation of o-nitrobenzoate via anthranilicacid(o-aminobenzoate)by Arthrobacter protophormiae:a plasmid-encoded newpathway.Biochemical and Biophysical Research Communications，2000，267:236-244)，對代謝產物進行氣質聯(lián)機(GC-MS)分析。結果發(fā)現(xiàn)，2-NBA-16能夠在所有測試2-NBA濃度條件下增殖，并能夠在48h小時內完成對供試2-NBA的完全降解。對照處理中，Pseudomonassp.7無生長增殖跡象，且2-NBA含量未曾減少。以上結果表明，2-NBA-16可以以2-NBA為唯一碳源進行生長，進一步證實nbaB基因轉化微生物能使其具有2-NBA降解代謝活性。
[0037]在對代謝產物進行的分析中，未檢測到3-羥基-2-氨基苯甲酸，2-羥氨基苯甲酸和2-氨基苯甲酸的存在。再結合實施例2中的序列比對分析結果，可以得知——實施例2-4所涉及的2-NBA降解酶編碼基因nbaB與已報道的PseudomonasfluorescensKU-7(Yoshie Haseg awa etal.2000.A novel degradative pathway of2-nitrobenzoatevia3-hydroxyanthrani late in Pseudomonas fluorescens strain KU-7.FEMSMicrobiology Letters，190:185-190)及 ArthrobacterprotophormiaeRKJlOO(Ashvini Chauhan and Rakesh K.Jain.2000.Degradation of o-nitrobenzoatevia anthranilic acid (o-aminobenzoate) by Arthrobacter protophormiae:a plasmid-encoded new pathway.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications, 267:236-244)菌株中負責2-NBA降解代謝的基因不同。
[0038]以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。
【權利要求】
1.一種鄰硝基苯甲酸降解酶的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.—種權利要求1所述的編碼基因所編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.擴增權利要求1所述的鄰硝基苯甲酸降解酶的編碼基因的引物，其核苷酸序列分別為 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4。
4.含有權利要求1所述基因的重組載體。
5.含有權利要 求1所述基因的重組菌。
【文檔編號】C12N15/11GK103540601SQ201310454327
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權日:2013年9月27日
【發(fā)明者】虞方伯, 管莉菠, 駱林平, 單勝道 申請人:浙江農林大學