食道癌確定用組合物及方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了食道癌確定用組合物及方法。本發(fā)明提供食管癌診斷用組合物、試劑盒或DNA芯片或者使用該組合物、試劑盒或DNA芯片檢測(cè)食管癌的方法。所述食管癌診斷用組合物、試劑盒或DNA芯片含有多種多核苷酸，所述多種多核苷酸選自：與來自食管癌患者的不含食管癌的組織相比在來自食管癌患者的食管癌組織中表達(dá)水平發(fā)生變化的多核苷酸、其變異體或其片段。
【專利說明】食道癌確定用組合物及方法
[0001]本申請(qǐng)是中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)200980126931.3的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及對(duì)確定或檢測(cè)食管癌有用的診斷(確定或檢測(cè))用組合物、利用該組合物的食管癌檢測(cè)或確定方法、及利用該組合物的食管癌診斷或檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0003]食管是連接咽和胃的管腔狀器官，大部分存在于胸腔，一部分存在于頸部和腹腔。在胸腔上部，食管位于氣管和脊椎之間，在胸腔下部，食管被心臟、大動(dòng)脈和肺包圍。食管具有將從口攝入的食物輸送到胃的作用。
[0004]2001年日本人的癌死亡率為10萬人中有238.8人。死亡原因中食管癌所占的比例逐年增加，2001年男性的食管癌死亡例占到所有癌癥死亡例的5.0%、女性占到1.4%。食管癌的發(fā)病年齡的高峰在60~70歲，男性發(fā)病較多。另外，吸煙、飲酒、嗜好熱食品等環(huán)境因素與發(fā)病密切相關(guān)。并且，一般認(rèn)為由于在食管壁內(nèi)部或周圍，血管和淋巴管豐富，所以發(fā)生的癌癥多出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。
[0005]食管癌的治療根據(jù)進(jìn)展程度(日本食管疾病研究會(huì)編臨床.病理食管癌治療規(guī)范1999年)或轉(zhuǎn)移、及全 身狀況而決定。食管癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法記載于日本食管疾病研究會(huì)編“食管癌治療方針”(2002年)。目前最普通的治療方法是手術(shù)療法，即切除含有癌細(xì)胞的食管和包括淋巴結(jié)的周圍組織(淋巴結(jié)清掃(lymph node dissection)),并利用胃等其他器官重建食管。但是，手術(shù)療法、特別是大范圍的淋巴結(jié)清掃給患者帶來很大的負(fù)擔(dān)，還必須考慮手術(shù)后的生活質(zhì)量評(píng)分(QOL)降低的問題。對(duì)于粘膜內(nèi)的早期癌癥，有時(shí)可以在內(nèi)窺鏡下實(shí)施粘膜剝除術(shù)。另外，從根治療法、對(duì)癥療法兩方面考慮，有時(shí)可以進(jìn)行放射線照射。進(jìn)而，與手術(shù)療法或放射線療法組合，進(jìn)行化學(xué)療法。目前，一般認(rèn)為在化學(xué)療法中，并用5 —氟尿嘧啶和順鉬的治療方法是最有效的。
[0006]食管癌通常是在患者感覺吞咽時(shí)有不適感、吞咽困難、胸骨后部疼痛及胸部不適感等自覺癥狀進(jìn)行就診時(shí)被發(fā)現(xiàn)。但是，上述癥狀的出現(xiàn)是由癌在食管內(nèi)生長(zhǎng)導(dǎo)致的，患者因自我檢測(cè)而就診時(shí)發(fā)現(xiàn)的癌已經(jīng)擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移到食管壁外，通常預(yù)后不良。
[0007]食管癌可以通過食管造影檢查、內(nèi)窺鏡檢查及活組織檢查進(jìn)行確定。在進(jìn)行內(nèi)窺鏡檢查時(shí)或手術(shù)時(shí)采集活組織檢查標(biāo)本，制作病理標(biāo)本，并且通過病理組織學(xué)分類加以診斷。此時(shí)，需要開發(fā)一種快速簡(jiǎn)便的診斷方法，該方法能根據(jù)內(nèi)窺鏡檢查得到的細(xì)胞的性質(zhì)預(yù)測(cè)是否有食管癌。
[0008]至今為止，已有人提出使用食管癌組織中特異性含有的標(biāo)記物的分子生物學(xué)診斷方法。該方法能快速地得到客觀的結(jié)果，有助于快速診斷。
[0009]目前，作為食管癌臨床檢查用標(biāo)記物，除使用作為血清中的蛋白質(zhì)標(biāo)記物的SCC、CYFRA21 - 1、CEA等之外，還報(bào)道了專利文獻(xiàn)1、2中記載的蛋白質(zhì)等。但是，上述標(biāo)記物缺少靈敏度、特異性，即使是靈敏度最高的CYFRA21 - 1，其靈敏度也只是33.9% (非專利文獻(xiàn)I)~43.9% (非專利文獻(xiàn)2)左右。因此，尚不能達(dá)到通過對(duì)上述血清中的標(biāo)記物及其組合進(jìn)行檢測(cè)來確定食管癌細(xì)胞是否存在的階段。
[0010]另外，作為使用了用于特異性判斷從受試者采集的活檢試樣中是否含有食管癌細(xì)胞的基因的標(biāo)記物，公開了染色體異常(例如參見專利文獻(xiàn)3，4)或基因的后生序列(epigenetic sequences)(例如專利文獻(xiàn)5),除此之外,還報(bào)道了多個(gè)利用DNA芯片全面解析基因表達(dá)的結(jié)果(例如，參見專利文獻(xiàn)6、非專利文獻(xiàn)3~8)。特別是，專利文獻(xiàn)6中，提供了 20種基因，所述基因通過組合檢測(cè)來確定是否存在食管癌細(xì)胞，但由于分別使用不同的判斷機(jī)器判斷含有食管癌細(xì)胞和不含食管癌細(xì)胞，所以不僅診斷復(fù)雜，而且在一方判斷機(jī)器預(yù)測(cè)含有食管癌細(xì)胞，另一方預(yù)測(cè)不含食管癌細(xì)胞時(shí)，還存在無法進(jìn)行診斷的情況。另外，作為以單獨(dú)的基因表達(dá)作為指標(biāo)的標(biāo)記物，報(bào)道了專利文獻(xiàn)7、非專利文獻(xiàn)9、10中記載的SPRR3基因(Small proline — rich protein3)、非專利文獻(xiàn)11中記載的fgf3基因、專利文獻(xiàn)7、非專利文獻(xiàn)12中記載的CSTB基因(cystatin B、liver thiol proteinaseinhibitor)、專利文獻(xiàn) 8 中記載的 UCP2 基因(mitochondrial uncoupling protein2)及C0L3A1 (3，region for pro — alpha (III) collagen)、專利文獻(xiàn) 7 中記載的 UPKlA 基因(uroplakinlA)、非專利文獻(xiàn) 13 中記載的 HSPAlB 基因(Heat Shock70kDa Proteinl)等。另外，作為上皮系惡性腫瘤的標(biāo)記物，已知專利文獻(xiàn)9中記載的RRMl基因(ribonucleotidereductase Mlpolypeptide)等。但是，即使利用上述基因，也不能充分地診斷是否存在食管癌。 [0011]專利文獻(xiàn)1:日本特開2003 - 259872號(hào)公報(bào)
[0012]專利文獻(xiàn)2:日本特表2000 - 511536號(hào)公報(bào)
[0013]專利文獻(xiàn)3:日本特開2001 - 17200號(hào)公報(bào)
[0014]專利文獻(xiàn)4:日本特開2002 - 272497號(hào)公報(bào)
[0015]專利文獻(xiàn)5:日本特表2004 - 505612號(hào)公報(bào)
[0016]專利文獻(xiàn)6:國(guó)際公開第2006/118308號(hào)說明書
[0017]專利文獻(xiàn)7:國(guó)際公開第2003/042661號(hào)說明書
[0018]專利文獻(xiàn)8:國(guó)際公開第2003/076594號(hào)說明書
[0019]專利文獻(xiàn)9:國(guó)際公開第2006/119464號(hào)說明書
[0020]非專利文獻(xiàn)1:Nakamura, T.等，1998，Diseases of the Esophagus,第 11卷，ρ.35 — 39
[0021]非專利文獻(xiàn)2:Kawaguchi, H.等，2000，Cancer,第 89 卷，ρ.1413 — 1417
[0022]非專利文獻(xiàn)3:Luo, A.等，2004 年，Oncogene,第 23 卷，p.1291 — 1299
[0023]非專利文獻(xiàn)4:Zhi, H.等，2003 年，International Journal of Cancer,第 106卷，ρ.327 — 333
[0024]非專利文獻(xiàn)5:Lu, J.等，2001 年，International Journal of Cancer,第 91卷，p.288 — 294
[0025]非專利文獻(xiàn)6:Kazemi — Noureini, S.等，2004 年，World Journal ofGastroenterology,第 10 卷，p.1716 — 1721
[0026]非專利文獻(xiàn)7:Xu, S.H.等，2OO3 年，World Journal of Gastroenterology,第 9卷，p.417 — 422[0027]非專利文獻(xiàn)8:Su，H.等，2003 年，Cancer Research,第 63 卷，ρ.3872 一 3876
[0028]非專利文獻(xiàn)9:Chen，B.S.等，2000 年，Carcinogenesis,第 21 卷，ρ.2147 — 2150
[0029]非專利文獻(xiàn)10: Abraham, J.Μ.等，1996 年,Cell Growth & Differentiation,第7 卷，ρ.855 — 860
[0030]非專利文獻(xiàn)11:Kitagawa, Y.等，1991 年,Cancer Research,第 51 卷，ρ.1504 —1508
[0031]非專利文獻(xiàn)12:Shiraishi, Τ.等，1998 年，International Journal of Cancer,第 79 卷，ρ.175 - 178
[0032]非專利文獻(xiàn)13:Kawanishi, K.等，1999 年,Cancer,第 85 卷，p.1649 — 1657
【發(fā)明內(nèi)容】

[0033]但是，由于上述現(xiàn)有的指標(biāo)缺少特異性及/或靈敏性，或尚未確立從生物試樣中有效地檢出的方法，所以通常不應(yīng)用于臨床，迫切希望開發(fā)出特異性及靈敏性高的食管癌標(biāo)記物。
[0034]本發(fā)明的目的在于提供在食管癌的診斷及治療中有用的疾病確定用組合物、使用該組合物的食管癌的確定(或檢測(cè))方法、及利用該組合物的食管癌的確定(或檢測(cè)或診斷)用試劑盒。
[0035]作為尋找標(biāo)記物的方法，可以舉出下述方法:通過某種方法對(duì)食管癌細(xì)胞中的、手術(shù)時(shí)來自患者的食管癌細(xì)胞、和來自患者的非癌細(xì)胞中的基因表達(dá)或蛋白質(zhì)表達(dá)、或細(xì)胞代謝產(chǎn)物等的量進(jìn)行比較的方法；和對(duì)食管癌患者和非食管癌患者體液中含有的基因、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物等的量進(jìn)行測(cè)定的方法等。
[0036]近年來，使用DNA陣列進(jìn)行的基因表達(dá)量解析，被特別廣泛地用作尋找上述標(biāo)記物的方法。DNA陣列中固定有使用了對(duì)應(yīng)于數(shù)百至數(shù)萬種基因的堿基序列的探針。通過將受試試樣添加到DNA陣列中，試樣中的基因與探針結(jié)合，利用某種方法測(cè)定結(jié)合量，由此可以知道受試試樣中的基因量。對(duì)應(yīng)于固定在DNA陣列上的探針的基因可以自由選擇，另外，使用來自手術(shù)時(shí)或內(nèi)窺鏡檢查時(shí)食管癌患者的食管癌細(xì)胞和非食管癌細(xì)胞，比較試樣中的基因表達(dá)量，由此能判定可以作為食管癌標(biāo)記物的基因組。
[0037]為了解決上述課題，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn):利用DNA芯片解析來自手術(shù)時(shí)食管癌患者的食管癌細(xì)胞和非食管癌細(xì)胞的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了可用于食管癌的檢測(cè)標(biāo)記物的基因，并且發(fā)現(xiàn)它們的基因表達(dá)量與非食管癌細(xì)胞相比，在食管癌細(xì)胞中減少、降低、或增加、增大，從而完成了本發(fā)明。
[0038]1.發(fā)明概要
[0039]本發(fā)明具有以下特征。
[0040]在本發(fā)明的第一方案中，本發(fā)明提供一種食管癌診斷用組合物，其中含有選自下述(a)~(e)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的3個(gè)以上多核苷酸。
[0041]Ca)由序列號(hào)I~38表不的堿基序列組成的多核苷酸、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段，
[0042](b)含有序列號(hào)I~38表示的堿基序列的多核苷酸，
[0043](c)由與序列號(hào)I~38表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段，
[0044](d)含有與序列號(hào)I~38表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸，
[0045](e)在嚴(yán)格條件下與上述(a)~(d)中任一多核苷酸雜交的多核苷酸、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0046]另外，在其他實(shí)施方式中，在上述組合物中，上述片段為含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0047]另外，在其他實(shí)施方式中，在上述組合物中，上述片段是序列號(hào)I~38中任一個(gè)表不的堿基序列中分別含有序列號(hào)63~100中的任一個(gè)表不的堿基序列、且含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸，或含有與該多核苷酸的序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。
[0048]另外，在其他實(shí)施方式中，在上述組合物中，上述片段是含有序列號(hào)63~100中任一個(gè)表示的堿基序列、或與其互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。
[0049]另外，在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，如上述任一項(xiàng)所述的組合物，其中還含有選自下述(f)~(j)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的2個(gè)以上多核苷酸。
[0050](f)由序列號(hào)39~62表不的堿基序列組成的多核苷酸、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段，
[0051](g)含有序列號(hào)39~62表不的堿基序列的多核苷酸，
[0052](h)由與序列號(hào)39~62表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸、其變異體、或其含有15個(gè)以上連 續(xù)堿基的片段，
[0053](i)含有與序列號(hào)39~62表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸，
[0054](j)在嚴(yán)格條件下與上述(f)~(i)中任一多核苷酸雜交的多核苷酸、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0055]另外，在其他實(shí)施方式中，上述組合物中，上述片段為含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0056]另外，在其他實(shí)施方式中，上述組合物中，上述片段是序列號(hào)39~62中任一個(gè)表示的堿基序列中分別含有序列號(hào)101~124中任一個(gè)表示的堿基序列、且含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸，或含有與該多核苷酸的序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。
[0057]另外，在其他實(shí)施方式中，上述組合物中，上述片段是含有序列號(hào)101~124中任一個(gè)表示的堿基序列、或與其互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。
[0058]作為本發(fā)明的第二方案，本發(fā)明提供一種食管癌診斷用試劑盒，其中含有上述任一項(xiàng)中所述的(a)~(e)所不的多核苷酸、其變異體、或其片段中的3個(gè)以上多核苷酸。
[0059]另外，在其他實(shí)施方式中，上述試劑盒中還含有上述任一項(xiàng)中所述的(f)~(j)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的2個(gè)以上多核苷酸。
[0060]另外，在其他實(shí)施方式中，上述試劑盒中，上述多核苷酸是由序列號(hào)I~62中任一個(gè)表示的堿基序列組成的多核苷酸、由其互補(bǔ)序列組成的多核苷酸、在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸、或上述多核苷酸的含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0061]另外，在其他實(shí)施方式中，上述試劑盒中，上述片段為含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0062]另外，在其他實(shí)施方式中，上述的試劑盒中，上述片段是序列號(hào)I~62中任一個(gè)表不的堿基序列中分別含有序列號(hào)63~124中的任一個(gè)表不的堿基序列、且含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸，或含有與該多核苷酸的序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。
[0063]另外，在其他實(shí)施方式中，上述試劑盒中，上述片段是含有序列號(hào)63~124中的任一個(gè)表示的堿基序列、或與其互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。
[0064]另外,在其他實(shí)施方式中，上述試劑盒中，上述片段是由序列號(hào)63~124中任一個(gè)表示的堿基序列組成的多核苷酸。
[0065]另外，在其他實(shí)施方式中，上述試劑盒含有5種以上至全部的含有序列號(hào)63~124中任一個(gè)表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。
[0066]另外，在其他實(shí)施方式中，如上述任一項(xiàng)所述的試劑盒中，上述多核苷酸分別或以任意組合包裝在不同的容器中。
[0067]另外，在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種食管癌診斷用DNA芯片，其中含有上述任一項(xiàng)所述的(a)~(e)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的3個(gè)以上多核苷酸。
[0068]作為本發(fā)明的第三方案，本發(fā)明提供一種食管癌診斷用DNA芯片，其中含有上述任一項(xiàng)所述的(f)~(j)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的2個(gè)以上多核苷酸。
[0069]另外，在其他實(shí)施方式中，上述DNA芯片含有5種以上~全部的含有序列號(hào)63~124中任一個(gè)表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。
[0070]作為第4方案，本發(fā)明提供一種在體外確定來自受試者的受試樣品中是否含有食管癌細(xì)胞的方法，該方法使用上述任一項(xiàng)所述的組合物、上述任一項(xiàng)所述的試劑盒、上述任一項(xiàng)所述的DNA芯片或它們的組合，測(cè)定來自受試者的生物試樣中的靶核酸的表達(dá)量，由此在體外確定來自受試者的受試樣品中是否含有食管癌細(xì)胞。
[0071]另外，在其他實(shí)施方式 中，上述方法使用DNA芯片。
[0072]另外，在其他實(shí)施方式中，提供一種確定食管癌的方法，該方法包括以下步驟:
[0073]第I步驟,使用上述任一項(xiàng)所述的組合物、上述任一項(xiàng)所述的試劑盒、上述任一項(xiàng)所述的DNA芯片或它們的組合，體外測(cè)定多個(gè)生物試樣中的靶核酸的表達(dá)量，所述生物試樣是已知含有食管癌細(xì)胞的組織；
[0074]第2步驟，以該第I步驟中得到的該靶核酸的表達(dá)量的測(cè)定值作為訓(xùn)練樣本制作辨別式(支持向量機(jī)(Support Vector Machine))；
[0075]第3步驟，與第I步驟相同地體外測(cè)定來自受試者食管的生物試樣中的該靶核酸的表達(dá)量；
[0076]第4步驟，將第3步驟中得到的該靶核酸的表達(dá)量的測(cè)定值代入上述第2步驟中得到的辨別式，基于由該辨別式得到的結(jié)果，判斷生物試樣中含有食管癌細(xì)胞。
[0077]另外，在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供上述任一項(xiàng)所述的組合物、上述任一項(xiàng)所述的試劑盒、或上述任一項(xiàng)所述的DNA芯片在體外預(yù)測(cè)是否有食管癌中的應(yīng)用。
[0078]另外，在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種體外預(yù)測(cè)受試者是否有食管癌的方法，所述方法包括:使用針對(duì)由序列號(hào)I~38表示的堿基序列編碼的多肽的、3個(gè)以上抗體或其片段，體外測(cè)定來自受試者的食管癌細(xì)胞 或血液中的該多肽的量。
[0079]另外，在其他實(shí)施方式中，上述方法還包括:使用針對(duì)由序列號(hào)39~62表示的堿基序列編碼的多肽的、2個(gè)以上抗體或其片段，測(cè)定該多肽的量。
[0080]另外，在其他實(shí)施方式中，上述方法的上述多肽具有序列號(hào)125~186表不的氨基酸序列。[0081]另外，在其他實(shí)施方式中，上述任一項(xiàng)所述的方法中，與健康的受試者相比，上述多肽的表達(dá)水平在患有食管癌的受試者中發(fā)生變化時(shí)，確定為食管癌。
[0082]本發(fā)明提供了以下項(xiàng)。
[0083]項(xiàng)1、一種食管癌診斷用組合物，其中，含有選自下述(a)~(e)所示的多核苷酸、其變異體或其片段中的3個(gè)以上多核苷酸:
[0084]Ca)由序列號(hào)I~38表不的堿基序列組成的多核苷酸、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段，
[0085](b)含有序列號(hào)I~38表不的堿基序列的多核苷酸，
[0086](c)由與序列號(hào)I~38表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段，
[0087](d)含有與序列號(hào)I~38表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸，
[0088](e)在嚴(yán)格條件下與所述(a)~(d)中的任一多核苷酸雜交的多核苷酸、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0089]項(xiàng)2、如項(xiàng)I所述的組合物，其中，所述片段為含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0090]項(xiàng)3、如項(xiàng)2所述的組合物，其中，所述片段是序列號(hào)I~38中的任一個(gè)表示的堿基序列中分別含有序列號(hào)63~100中的任一個(gè)表不的堿基序列的多核苷酸,或含有與該多核苷酸的序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。
[0091]項(xiàng)4、如項(xiàng)2所述的組合物，其中，所述片段是含有序列號(hào)63~100中的任一個(gè)表示的堿基序列、或含有與該堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。
[0092]項(xiàng)5、如項(xiàng)I~4中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，還含有選自下述(f)~(j)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的2個(gè)以上多核苷酸:
[0093](f)由序列號(hào)39~62表不的堿基序列組成的多核苷酸、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段，
[0094](g)含有序列號(hào)39~62表不的堿基序列的多核苷酸，
[0095](h)由與序列號(hào)39~62表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段，
[0096](i)含有與序列號(hào)39~62表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸，
[0097](j)在嚴(yán)格條件下與所述(f)~(i)中任一多核苷酸雜交的多核苷酸、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0098]項(xiàng)6、如項(xiàng)5所述的組合物，其中，所述片段為含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0099]項(xiàng)7、如項(xiàng)6所述的組合物，其中，所述片段是序列號(hào)39~62表示的堿基序列中含有序列號(hào)101~124表示的堿基序列的多核苷酸、或含有與該多核苷酸的序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。
[0100]項(xiàng)8、如項(xiàng)6所述的組合物，其中，所述片段是含有序列號(hào)101~124表示的堿基序列、或含有與該堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。
[0101]項(xiàng)9、一種食管癌診斷用試劑盒，含有項(xiàng)I~4中任一項(xiàng)所述的(a)~(e)所示的多核苷酸、其變異體及/或其片段中的3個(gè)以上。
[0102]項(xiàng)10、如項(xiàng)9所述的試劑盒，其中，還含有項(xiàng)5~8中任一項(xiàng)所述的(f)~(j)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的2個(gè)以上。[0103]項(xiàng)11、如項(xiàng)9或10所述的試劑盒，其中，所述多核苷酸是由序列號(hào)I~62中任一個(gè)表示的堿基序列組成的多核苷酸、由其互補(bǔ)序列組成的多核苷酸、在嚴(yán)格條件下與所述多核苷酸雜交的多核苷酸、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0104]項(xiàng)12、如項(xiàng)11所述的試劑盒，其中，所述片段為含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0105]項(xiàng)13、如項(xiàng)12所述的試劑盒，其中，所述片段是序列號(hào)I~62中的任一個(gè)表示的堿基序列中分別含有序列號(hào)63~124中的任一個(gè)表不的堿基序列的多核苷酸,或含有與所述多核苷酸的序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。
[0106]項(xiàng)14、如項(xiàng)12所述的試劑盒，其中，所述片段是含有序列號(hào)63~124中任一個(gè)表示的堿基序列、或含有與該堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。
[0107]項(xiàng)15、如項(xiàng)14所述的試劑盒,其中，所述片段是由序列號(hào)63~124中任一個(gè)表不的堿基序列組成的多核苷酸。
[0108]項(xiàng)16、如項(xiàng)9所述的試劑盒，其中，含有5種以上至全部的含有序列號(hào)63~124表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。
[0109]項(xiàng)17、如項(xiàng)9~1 6中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，所述多核苷酸分別或任意組合包裝在不同的容器中。
[0110]項(xiàng)18、一種食管癌診斷用DNA芯片，其中，含有項(xiàng)I~4中任一項(xiàng)所述的(a)~(e)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的3個(gè)以上。
[0111]項(xiàng)19、如項(xiàng)18所述的DNA芯片，其中，還含有項(xiàng)5~8中任一項(xiàng)所述的(f )~(j)所示的多核苷酸、其變異體、或其片段中的2個(gè)以上。
[0112]項(xiàng)20、如項(xiàng)18或19所述的DNA芯片，其中，含有5個(gè)以上~全部的含有序列號(hào)63~124表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。
[0113]項(xiàng)21、一種在體外確定來自受試者的受試樣品中不含食管癌細(xì)胞、或含有食管癌細(xì)胞的方法，所述方法使用項(xiàng)I~8中任一項(xiàng)所述的組合物、項(xiàng)9~17中任一項(xiàng)所述的試劑盒、項(xiàng)18~20中任一項(xiàng)所述的DNA芯片或它們的組合，測(cè)定來自受試者的生物試樣中的靶核酸的表達(dá)水平，由此在體外確定來自受試者的受試樣品中不含食管癌細(xì)胞、或含有食管癌細(xì)胞。
[0114]項(xiàng)22、如項(xiàng)21所述的方法，其中，使用DNA芯片。
[0115]項(xiàng)23、一種確定食管癌的方法，所述方法包括以下步驟:
[0116]第I步驟,使用項(xiàng)I~8中任一項(xiàng)所述的組合物、項(xiàng)9~17中任一項(xiàng)所述的試劑盒、項(xiàng)18~20中任一項(xiàng)所述的DNA芯片或它們的組合，體外測(cè)定多個(gè)生物試樣中的靶核酸的表達(dá)量，所述生物試樣是已知含有食管癌細(xì)胞的組織或正常組織；
[0117]第2步驟，以所述第I步驟中得到的所述靶核酸的表達(dá)量的測(cè)定值作為訓(xùn)練樣本制作辨別式(支持向量機(jī));
[0118]第3步驟，與第I步驟相同地體外測(cè)定來自受試者食管的生物試樣中的所述靶核酸的表達(dá)量；
[0119]第4步驟，將第3步驟中得到的所述靶核酸的表達(dá)量的測(cè)定值代入所述第2步驟中得到的辨別式，基于由所述辨別式得到的結(jié)果，判斷來自受試者的生物試樣中不含食管癌細(xì)胞、或含有食管癌細(xì)胞。[0120]項(xiàng)24、項(xiàng)I~8中任一項(xiàng)所述的組合物、項(xiàng)9~17中任一項(xiàng)所述的試劑盒、或項(xiàng)18~20中任一項(xiàng)所述的DNA芯片在體外確定來自受試者的生物試樣中不含食管癌細(xì)胞、或含有食管癌細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0121]項(xiàng)25、一種體外確定來自受試者的生物試樣中不含食管癌、或含有食管癌細(xì)胞的方法，所述方法包括:使用針對(duì)由序列號(hào)I~38表示的堿基序列編碼的多肽的、3個(gè)以上的抗體或其片段，體外測(cè)定來自受試者的食管癌細(xì)胞或血液中的所述多肽的水平。
[0122]項(xiàng)26、如項(xiàng)25所述的方法，其中，還使用針對(duì)由序列號(hào)39~62表示的堿基序列編碼的多肽的、2個(gè)以上的抗體或其片段，測(cè)定所述多肽的水平。
[0123]項(xiàng)27、如項(xiàng)25或26所述的方法,其中，所述多肽具有序列號(hào)125~186表不的氨
基酸序列。
[0124]項(xiàng)28、如項(xiàng)25~27中任一項(xiàng)所述的方法，其中，與健康受試者相比，所述多肽的表達(dá)水平在患有食管癌的受試者中發(fā)生變化時(shí)，確定為食管癌。
[0125]2.定義
[0126]本說明書中使用的術(shù)語具有以下定義。
[0127]核酸、多核苷酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)等簡(jiǎn)寫符號(hào)所表達(dá)的含義根據(jù)“包括堿基序列或氨基酸序列的說明書等的撰寫用手冊(cè)”(日本國(guó)特許廳編)及本領(lǐng)域中的慣用含義。
[0128]在本說明書中，“多核苷酸”是指包括RNA及DNA在內(nèi)的核酸。需要說明的是，上述DNA包括cDNA、基因組DNA及合成DNA。另外，上述RNA包括總RNA、mRNA、rRNA、及合成RNA。另外，本說明書中多核苷酸可以與核酸互換使用。
[0129]在本說明書中，“cDNA”包括與基因表達(dá)生成的RNA互補(bǔ)的序列的全長(zhǎng)DNA鏈、及由其部分序列組成的DNA片段。cDNA可以通過以RNA為模板，利用使用聚T引物的RT — PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶一聚合酶鏈反應(yīng))進(jìn)行合成。
[0130]在本說明書中，“基因”不僅包括雙鏈DNA，還包括構(gòu)成雙鏈DNA的正鏈(或有意義鏈)或互補(bǔ)鏈(或反義鏈)等各單鏈DNA。另外，對(duì)其長(zhǎng)度無特別限定。
[0131]所以，在本說明書中，在沒有特別說明的情況下，“基因”是指包括人類基因組DNA在內(nèi)的雙鏈DNA、包括cDNA在內(nèi)的單鏈DNA (正鏈)、具有與該正鏈互補(bǔ)的序列的單鏈DNA(互補(bǔ)鏈)、及上述DNA的片段中的任一個(gè)。另外，該“基因”不僅包括以特定的堿基序列(或序列號(hào))表示的“基因”，還包括編碼與由上述基因編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能相同的蛋白質(zhì)的“基因”，所述蛋白質(zhì)例如可以舉出同源物(即homolog)、剪接變體等變異體、及衍生物。作為編碼上述同源物、變異體或衍生物的“基因”，具體可以舉出具有在下述的嚴(yán)格條件下與上述序列號(hào)I~62表示的任一特定堿基序列的互補(bǔ)序列雜交的堿基序列的“基因”。
[0132]例如，作為來自人的蛋白質(zhì)的同源物(即homolog)或編碼該同源物的基因，可以舉出與該蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的人基因?qū)?yīng)的其它生物種的蛋白質(zhì)或基因，上述蛋白質(zhì)或基因同源物可以通過 homo1Gene (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/homo1Gene/)鑒定。具體而言，可以將特定的人類氨基酸或堿基序列代入BLAST程序(BLAST program)(Karlin, S.等，Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A.，1993 年，第90 卷，ρ.5873 — 5877, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/),得到一致(得分最高、E 值為O且同一性顯不為100%)序列的登錄號(hào)(accession number)。作為BLAST程序，已知有BLASTN (基因)、BLASTX (蛋白質(zhì))等。例如，進(jìn)行基因檢索時(shí)，將從上述BLAST檢索得到的登錄號(hào)輸入 UniGene (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/UniGene/)，得至Ij UniGeneClusterID(以Hs.表示的編號(hào)),將得到的UniGeneClusterID輸入homoloGene。從作為結(jié)果得到的表不其它生物種基因與人類基因的基因同源物的相關(guān)性的列表中選擇其它生物種的基因作為與由特定堿基序列表示的人類基因?qū)?yīng)的基因同源物。另外，在該方法中，也可以使用FASTA 程序(http://www.ddb j.nig.ac.jp/search/fasta — e.html)代替 BLAST 程序。
[0133]需要說明的是，對(duì)“基因”的功能區(qū)域沒有限定，例如可以包括表達(dá)控制區(qū)域、編碼區(qū)域、外顯子或內(nèi)含子。
[0134]在本說明書中，“轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物”是指以基因的DNA序列為模板合成的信使RNA(mRNA)。RNA聚合酶與位于基因上游的被稱為啟動(dòng)子的部位結(jié)合，使核糖核苷酸與3’末端結(jié)合，使其與DNA的堿基序列互補(bǔ)，合成信使RNA。該信使RNA中不僅含有基因自身，還含有包括表達(dá)控制區(qū)域、編碼區(qū)域、外顯子或內(nèi)含子在內(nèi)的從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)至聚A序列末端的全長(zhǎng)序列。 [0135]在本說明書中，“翻譯產(chǎn)物”表示無論轉(zhuǎn)錄合成的信使RNA接受/不接受剪接等修飾，都基于其信息而合成的蛋白質(zhì)。在信使RNA的翻譯過程中，首先，核糖體與信使RNA結(jié)合，然后，根據(jù)信使RNA的堿基序列結(jié)合氨基酸，從而合成蛋白質(zhì)。
[0136]在本說明書中，“探針”包括能用于特異性地檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)生的RNA或來自該RNA的多核苷酸所使用的多核苷酸及/或與其互補(bǔ)的多核苷酸。
[0137]在本說明書中，“引物”包括能特異性識(shí)別、擴(kuò)增基因表達(dá)產(chǎn)生的RNA或來自該RNA的多核苷酸的連續(xù)的多核苷酸及/或與其互補(bǔ)的多核苷酸。
[0138]此處，互補(bǔ)的多核苷酸(互補(bǔ)鏈、反鏈)是指基于A:T (U)、G:C的堿基配對(duì)，與由序列號(hào)定義的堿基序列組成的多核苷酸的全長(zhǎng)序列、或其部分序列(此處，為了便于說明，將上述序列稱為正鏈)具有堿基互補(bǔ)關(guān)系的多核苷酸。其中，所述互補(bǔ)鏈不只限于形成與作為對(duì)象的正鏈的堿基序列完全互補(bǔ)的序列，也可以是具有能與作為對(duì)象的正鏈在嚴(yán)格條件下雜交的程度的互補(bǔ)關(guān)系的序列。
[0139]在本說明書中，“嚴(yán)格條件”是指相對(duì)于探針對(duì)其它序列的雜交，探針以可檢測(cè)性更大的程度(例如，比背景至少大2倍)與其靶序列雜交的條件。嚴(yán)格條件具有序列依賴性，因進(jìn)行雜交的環(huán)境的不同而不同。通過控制雜交及/或清洗條件為嚴(yán)格條件，可以鑒定與探針100%互補(bǔ)的靶序列。
[0140]在本說明書中，“變異體”為核酸時(shí)，是指起因于多型性、突變、轉(zhuǎn)錄時(shí)的選擇剪接等的天然變異體、或以遺傳密碼的簡(jiǎn)并為基礎(chǔ)的變異體、或在序列號(hào)I~62表示的堿基序列或其部分序列中缺失、置換、添加或插入I個(gè)以上、優(yōu)選I個(gè)或幾個(gè)堿基的變異體、或與該堿基序列或其部分序列具有約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、約98%以上、約99%以上的同源性百分比的變異體、或在上述定義的嚴(yán)格條件下與含有該堿基序列或其部分序列的多核苷酸或寡核苷酸雜交的核酸，另一方面，變異體為蛋白質(zhì)或肽時(shí)，是指包括在序列號(hào)125~186表示的氨基酸序列或其部分序列中缺失、置換、添加或插入I個(gè)以上、優(yōu)選I個(gè)或幾個(gè)氨基酸的變異體、或與該氨基酸序列或其部分序列具有約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、約98%以上、約99%以上的同源性百分比的變異體。
[0141]在本說明書中，“數(shù)個(gè)”是指約10、9、8、7、6、5、4、3或2個(gè)的整數(shù)。
[0142]在本說明書中，“同源性百分比”可以使用由上述BLAST或FASTA得到的蛋白質(zhì)或基因檢索系統(tǒng)，導(dǎo)入或不導(dǎo)入空位(gap)而進(jìn)行確定(Karlin, S.等，1993年，Proceedingsof the National Academic Sciences U.S.A.,第 90 卷,p.5873 — 5877;Altschul,S.F.等，1990 年，Journal of Molecular Biology,第 215 卷，ρ.403 — 410; Pearson,ff.R.等，1988 年，Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A.,第 85卷，p.2444 — 2448)。
[0143]在本說明書中，“衍生物”為核酸時(shí)，是指通過熒光團(tuán)等進(jìn)行標(biāo)記的衍生物、含有修飾核苷酸(例如，含有鹵素、甲基等烷基、甲氧基等烷氧基、硫代、羧甲基等基團(tuán)的核苷酸，及進(jìn)行了堿基的再構(gòu)建、雙鍵的飽和、脫氨基化、硫分子對(duì)氧分子的取代等的核苷酸等)的衍生物等，另一方面，“衍生物”為蛋白質(zhì)時(shí)，是指乙?；?、?；?、烷基化、磷酸化、硫酸化、糖基化、生物素化等化學(xué)修飾衍生物。
[0144]在本說明書中，“診斷(或檢測(cè)或確定)用組合物”，是指為了診斷是否罹患食管癌、發(fā)病程度或是否改善或改善程度，或?yàn)榱撕Y選對(duì)食管癌的預(yù)防、改善或治療有用的候補(bǔ)物質(zhì)，而直接或間接使用的組合物。其中，包括能特異性識(shí)別或結(jié)合下述基因的核酸、寡核苷酸及多核苷酸，所述基因與食管癌的罹患相關(guān)、在生物體內(nèi)特別是在食管組織內(nèi)的表達(dá)發(fā)生變化，還包括能檢測(cè)作為該基因翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的抗體。上述核酸、寡核苷酸及多核苷酸基于上述性質(zhì)，可以有效地用作探針或引物，所述探針用于檢測(cè)在生物體內(nèi)、組織或細(xì)胞內(nèi)等表達(dá)的上述基因，所述引物用于擴(kuò)增在生物體內(nèi)表達(dá)的上述基因。
[0145]在本說明書中，成為檢測(cè).診斷對(duì)象的“生物組織”是指伴隨食管癌的發(fā)生，本發(fā)明的基因表達(dá)發(fā)生變化的組織。具體是指食管組織、其周圍的淋巴結(jié)、及懷疑發(fā)生轉(zhuǎn)移的其它器官等。
[0146]本說明書中使用的“EYA2基因”或“EYA2”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)I)表不的眼缺乏同源物2(eyes absent homolog2)基因(DNA)、編碼HTG、PRKCBP1、RPS2、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)I中記載的EYA2基因(GenBank登錄號(hào)AL049540)或其他生物種同源物等。EYA2基因可以根據(jù)Zimmerman J.E.等，1997 年,Genome Res.,第 7 卷，pp.128 — 141 中記載的方法得到。
[0147] 本說明書中使用的“SERF1A基因”或“SERF1A”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)2)表示的小EDRK豐富因子I (Small EDRK 一 richfactorl)基因(DNA)、編碼4F5、H4F5、SMA修飾物1、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)2中記載的SERFlA基因(GenBank登錄號(hào)AF073519)或其他生物種同源物等。SERFlA基因可以根據(jù)Scharf J.M.,等.，1998年，Nat.Genet.，第20卷，pp.83 — 86中記載的方法得到。
[0148]本說明書中使用的“ IGHGl基因”或“ IGHGl ”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)3)表示的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)Yl (immunoglobulinheavy constant gammal)基因(DNA)、編碼 Glm marker、FLJ39988、FLJ40036、FLJ40253、FLJ40587、FLJ40789、FLJ40834、MGC45809、DKFZp686H11213、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)3中記載的IGHGl基因(GenBank登錄號(hào)NC_000014)或其他生物種同源物等。IGHGl基因可以根據(jù)Hood L.，等，1968年，Nature,第220卷，pp.764 —767中記載的方法得到。
[0149]本說明書中使用的“ITSN2基因”或“ITSN2”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)4)表示的INTERSECTIN2基因(DNA)、編碼SH3domain —containing protein IB、SH3P18、SH3P18 — like WASP associated protein、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)4中記載的ITSN2基因(GenBank登錄號(hào)NM_019595)或其他生物種同源物等。ITSN2基因可以根據(jù)Pucharcos C.，等，2000年，F(xiàn)EBSLett.，第478卷，pp.43 — 51中記載的方法得到。
[0150]本說明書中使用的“RAB11FIP5基因”或“RAB11FIP5”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)5)表示的人類RABll家族結(jié)合蛋白5 (類I)基因(DNA)、編碼KIAA0853、RIPll、pp75、GAFl、DKFZP434H018、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)5中記載的RAB11FIP5基因(GenBank登錄號(hào)BC035013)或其他生物種同源物等。RAB11FIP5基因可以根據(jù)Ito T.，等，1999年，J.Clin.1nvest.，第104卷，pp.1265 — 1275中記載的方法得到。
[0151]本說明書中使用的“HSPA1A基因”或“HSPA1A”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)6)表示的熱休克70kD蛋白IA (Heat shock70kDaproteinlA)基因(DNA)、編碼 HAPAl (DNA)、HSP70.1 (DNA)、HSP70 — 1/HSP70 — 2 (DNA)、HSPAlB (DNA)、HSP72 (DNA)、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)6中記載的HSPAlA基因(GenBank登錄號(hào)NM_005345)或其他生物種同源物等。HSPAlA基因可以根據(jù) Ito T.，等，1998 年,J.Biochem.(Tokyo),第 124 卷,pp.347 — 353 中記載的方法得到。
[0152]本說明書中使用的“NMU基因”或“NMU”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)7)表示的神經(jīng)介素U前體(neuromedin U precursor)基因(DNA)、編碼神經(jīng)介素一 U - 25、NmU - 25、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)7中記載的NMU 基因(GenBank登錄號(hào)NM_006688)或其他生物種同源物等。NMU基因可以根據(jù) Austin U.，等，1995 年,J.Mol.Endocrinol.,第 14 卷，pp.157 — 169 中記載的方法得到。
[0153]本說明書中使用的“E2F3基因”或“E2F3”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)8)表示的E2F轉(zhuǎn)錄因子3 (E2F transcription factor3)基因(DNA)、編碼E2F - 3、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)8中記載的E2F3基因(GenBank登錄號(hào)NM_001949)或其他生物種同源物等。E2F3基因可以根據(jù)Lees J.A.,等，1993，Mol.Cell.Biol.，第 13 卷，pp.7813 — 7825 中記載的方法得到。
[0154]本說明書中使用的“ESR2基因”或“ESR2”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)9)表示的雌激素受體β (estrogen receptor beta)基因(DNA)、編碼ER - BETA、Erb, NR3A2、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)9中記載的ESR2基因(GenBank登錄號(hào)NM_001437)或其他生物種同源物等。ESR2基因可以根據(jù) Dotzlaw H.，等，1997 年,J.Clin.Endocrinol.Metab.,第 82 卷，pp.2371 — 2374中記載的方法得到。
[0155]本說明書中使用的“CFDP1基因”或“CFDP1”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)10)表示的頡面發(fā)育蛋白I (craniofacial developmentproteinl)基因(DNA)、編碼 Bucentaur、BCNT、CP27、p97、SWC5、Yet1、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)10中記載的CFDPl基因(GenBank登錄號(hào)NM_006324)或其他生物種同源物等。CFDPl基因可以根據(jù)Diekwisch T.G.，等，1999年，Gene,第235卷，pp.19 — 30中記載的方法得到。
[0156]本說明書中使用的“HSPC190基因”或“HSPC190”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)11)表示的前細(xì)胞凋亡胱天蛋白酶連接蛋白(proapoptotic caspase adaptor protein)基因(DNA)、編碼胱天蛋白酶一2 結(jié)合蛋白、MGC29506、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)11中記載的HSPC190基因(GenBank登錄號(hào)NM_016459)或其他生物種同源物等。HSPC190基因可以根據(jù) Katoh M.，等，2003 年,Int.J.0ncol.,第 23 卷，pp.235 — 241 中記載的方法得到。
[0157]本說明書中使用的“C0L1A2基因”或“C0L1A2”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)12)表示的膠原α - 2 (I)鏈前體(collagen alpha — 2(I)chain precursor)基因(DNA)、編碼 α — 2型 I 膠原(Alpha — 2type I collagen)、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)12中記載的C0L1A2基因(GenBank登錄號(hào)Z7461)或其他生物種同源物等。C0L1A2基因可以根據(jù)Mottes M.，等，1998年，Hum.Mutat.，第12卷，pp.71 — 72中記載的方法得到。[0158]本說明書中使用的“GCS1基因”或“GCS1”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)13)表示的甘露糖基寡糖葡糖苷酶(Mannosyl —oligosaccharide glucosidase)基因(DNA)、編碼加工 A—葡糖昔酶 I (Processing A —glucosidase I )、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)13中記載的GCSl基因(GenBank登錄號(hào)NM_006302)或其他生物種同源物等。GCSl基因可以根據(jù)Kalz —Fuller B.，等，1995 年,Eur.J.Biochem.,第 231 卷,pp.344 — 351 中記載的方法得到。
[0159]本說明書中使用的“PARL基因”或“PARL”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)14)表示的早老素相關(guān)菱形樣蛋白(presenillins associatedrhomboid - like protein)基因(DNA)、編碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)14中記載的PARL基因(GenBank登錄號(hào)NM_01862)或其他生物種同源物等。PARL 基因可以根據(jù) Pellegrini L.，等，2001 年,J.Alzheimers Dis.，第 3 卷，pp.181 —190中記載的方法得到。
[0160]本說明書中使用的“CELSR2基因”或“CELSR2”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定喊基序列(序列號(hào)15)表不的鈣粘著蛋白EGF LAG七經(jīng)G型受:體2如體(Cadherin EGF LAG seven — pass G — type receptorfprecursor)基因(DNA)、編碼類表皮生長(zhǎng)因子2 (epidermal growth factor — like2)、類表皮生長(zhǎng)因子域3 (multipleepidermal growth factor — like domains3)> Flamingol、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)15中記載的CELSR2基因(GenBank登錄號(hào)NM_001408)或其他生物種同源物等。CELSR2基因可以根據(jù)Nakayama M.，等，1998年,Genomics,第51卷，pp.27 — 34中記載的方法得到。
[0161]本說明書中使用的“NDRG1基因”或“NDRG1”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)16)表示的N — myc下游調(diào)芐基因I (N — myc downstreamregulated gene I)基因(DNA)、編碼 GC4、RTP、NDRl、NMSL、TDD5、CAP43、CMT4D、HMSNL,RIT42、TARGU PR0XY1、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)16中記載的NDRGl基因(GenBank登錄號(hào)NM_006096)或其他生物種同源物等。NDRGl基因可以根據(jù) Kokame K.，等，1996 年，J.Biol.Chem.，第 271 卷，pp.29659 — 29665 中記載的方法得到。
[0162]本說明書中使用的“SLC25A44基因”或“SLC25A44”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)17)表示的溶質(zhì)載體家族25成員44( solute carrierfamily25, member44 )基因(DNA)、編碼 FLJ90431、KIAA0446、RP11 — 54H19.3、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)17中記載的SLC25A44基因(GenBank登錄號(hào)NM_014655)或其他生物種同源物等。SLC25A44基因可以根據(jù)Haitina T.，等，2006年,Genomics,第88卷，pp.779 — 790中記載的方法得到。
[0163]本說明書中使用的“TUSC2基因”或“TUSC2”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)18)表示的腫瘤抑制因子候選基因2 (tumor suppressorcandidate2)基因(DNA)、編碼PAP、FUSU PDAP2、C3orfll、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)18中記載的TUSC2基因(GenBank登錄號(hào)NM_007275)或其他生物種同源物等。TUSC2基因可以根據(jù)Lerman M.1.，等，2000，Cancer Res.,第60卷，pp.6116 - 6133中記載的方法得到。
[0164]本說明書中使用的“SLC4A1基因”或“SLC4A1”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)19)表示的溶質(zhì)載體家族4陰離子交換體成員I (Solutecarrier family4, anion exchanger, memberl)基因(DNA)、編碼 D1、FR、Sff> WD> WR> AEI>WD1、BND3、EPB3、CD233、EMPB3、RTA1A、MGC116753、MGC126619、MGC126623、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)19中記載的SLC4A1基因(GenBank登錄號(hào)NM_000342)或其他生物種同源物等。SLC4A1基因可以根據(jù)Lux S.E.，等，1189年，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,第 86 卷，pp.9089 — 9093 中記載的方法得到。
[0165]本說明書中使用的“MS4A7基因”或“MS4A7”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)20)表示的跨膜結(jié)構(gòu)域4亞家族A成員7 (Membrane 一spanning4 — domains, sunfamily A, member7)基因(DNA)、編碼 CFFM4、MS4A8、4SPAN2、⑶20L4、MGC22368、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)20中記載的MS4A7基因(GenBank登錄號(hào)NM_206938)或其他生物種同源物等。MS4A7基因可以根據(jù)Ishibashi K.，等，2001年,Gene,第264卷,pp.87 — 93中記載的方法得到。
[0166]本說明書中使用的“胸腺素β — 4基因”或“TMSB4X”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)21)表示的胸腺素β — 4 (thymosin beta 一 4)基因(DNA)、編碼FX、TB4X、PTMB4、TMSB4、胸腺素β — 4、Χ — linked8、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)21中記載的TMSB4X基因(GenBank登錄號(hào)NM_021109)或其他生物種同源物等。TMSB4X基因可以根據(jù)Gondo H.等，1987年，J.1mmunol.，第139卷，pp.3840 — 3848中記載的方法得到。
[0167]本說明書中使用的“PRC1基因”或“PRC1”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)22)表示的胞質(zhì)分裂調(diào)控蛋白I (protein regulatorof cytokinesisl)基因(DNA)、編碼胞質(zhì)分裂調(diào)控蛋白 I (protein regulationgcytokinesisl)、ASEl、MGC1671、MGC3669、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)22中記載的PRCl基因(GenBank登錄號(hào)NM_003981)或其他生物種同源物等。PRCl基因可以根據(jù)Jiang I ’等’ 1998年，Mol.Cell.，第2卷，pp.877 — 885中記載的方法得到。
[0168]本說明書中使用的“VCP基因”或“VCP”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)23)表示的纟顏酪肽蛋白(Valosin — containing protein)基因(DNA)、編碼p97、TERA、IBMPFD、MGC8560、MGC131997、MGC148092、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)23中記載的VCP基因(GenBank登錄號(hào)NM_007126)或其他生物種同源物等。VCP基因可以根據(jù)Druck T.,等，1995年，Genomics,第30卷，pp.94 —97中記載的方法得到。
[0169]本說明書中使用的“RBM9基因”或“RBM9”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)24)表示的RNA結(jié)合修飾蛋白9(RNA binding motif protein9)基因(DNA)、編碼 RTA、fxh、Fox — 2、HNRBP2、HRNBP2、dj 106120.3、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)24中記載的RBM9基因(GenBank登錄號(hào)NM_014309)或其他生物種同源物等。RBM9基因可以根據(jù)Norris J.D.，等，2002年，Mol.Endocrinol.，第16卷，pp.459 — 468中記載的方法得到。 [0170]本說明書中使用的“GPR126基因”或“GPR126”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)25)表示的G蛋白偶聯(lián)受體126 (G protein — coupledreceptorl26)基因(DNA)、編碼 FLJ14937、DKFZp564D0462、VIGR、DREG、PS1TP2、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)25中記載的GPR126基因(GenBank登錄號(hào)BC075798)或其他生物種同源物等。GPR126基因可以根據(jù)Stehlik C.，等，2004年，F(xiàn)EBSLett.，第569卷，pp.149 — 155中記載的方法得到。
[0171]本說明書中使用的“H0XA10基因”或“H0XA10”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定喊基序列(序列號(hào)26)表不的同源異型框基因AlO (Homeobox A10)基因(DNA)、編碼H0X1.8、MGC12859、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)26中記載的H0XA10基因(GenBank登錄號(hào)BC013971)或其他生物種同源物等。H0XA10基因可以根據(jù) Lowney P.，等，1991 年,Nucleic Acid Res.,第 19 卷，pp.3443 — 3449 中記載的方法得到。
[0172]本說明書中使用的“PPP1R1A基因”或“PPP1R1A”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)27)表示的蛋白磷酸酶I調(diào)控因子(抑制因子)亞基IA(protein phosphatasel, regulatory (inhibitor)subunitlA)基因(DNA)、編碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)27中記載的PPP1R1A基因(GenBank登錄號(hào) NM_006741)或蛋白憐酸酶抑制因子 I (protein phosphatase inhibitorl)、IPP — 1、I 一 1、其他生物種同源物等。PPP1R1A基因可以根據(jù)Endo S.，等，1996年，Biochemistry,第35卷，pp.5220 — 5228中記載的方法得到。
[0173]本說明書中使用的“MY09B基因”或“MY09B”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)28)表示的myosineIXB基因(DNA)、編碼MYR5、CELIAC4、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)28中記載的MY09B基因(GenBank登錄號(hào)NM_004145)、其他生物種同源物等。MY09B基因可以根據(jù)Wirth J.A.，等，1996年，J.Cell.Sc1.，第109卷，pp.653 一 661中記載的方法得到。
[0174]本說明書中使用的“SLC04C1基因”或“SLC04C1”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)29)表示的溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員4C1 (solute carrier organic anion transporter family, member4Cl)基因(DNA)、編碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)29中記載的SLC04C1基因(GenBank登錄號(hào)NM_180991)或其他生物種同源物等。SLC04C1基因可以根據(jù)MikkaichiT.，等，2004 年，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,第 101 卷，pp.3569 — 3574 中記載的方法得到。
[0175]本說明書中使用的“SERPINB13基因”或“SERPINB13”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)30)表示的HURPIN基因(DNA)、編碼HACAT UV 一REPRESSIBLE SERPIN、PROTEASE INHIBIT0R13、HEADPIN、SERPIN B13、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)30中記載的SERPINB13基因(GenBank登錄號(hào)NM_012397)或其他生物種同源物等。SERPINB13基因可以根據(jù)Spring P.,等，1999年,Biochem.Biophys.Res.Commun.,第 264 卷,pp.299 — 304 中記載的方法得到。
[0176]本說明書中使用的“SDC2基因”或“SDC2”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)31)表示的Syndecan 2基因(DNA)、編碼硫酸乙酰肝素蛋白聚糖I (heparan sulfate proteoglycanl)、cell — associated、纖維蛋白聚糖(fibroglycan)、人硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白3’末端(Human heparan sulfate proteoglycan(HSPG)core protein3’end)、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)31中記載的SDC2基因(GenBank登錄號(hào)J04621)或其他生物種同源物等。SDC2基因可以根據(jù)deBoeck H.，等，1987 年，Biochem.J.，第 247 卷，pp.765 — 771 中記載的方法得到。
[0177]本說明書中使用的“T0R1A基因”或“T0R1A”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)32)表示的torsin家族成員A (torsin family, memberA)基因(DNA)、編碼Dystonial、DYTU DQ2、torsin A、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)0具體包括序列號(hào)32中記載的T0R1A基因(GenBank登錄號(hào)ΝΜ_000113)或其他生物種同源物等。T0R1A基因可以根據(jù) Ozelius L.J.,等，1997 年,Nat.Genet.,第 17 卷，pp.40 —48中記載的方法得到。
[0178]本說明書中使用的“RPL18A基因”或“RPL18A”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)33)表示的核糖體蛋白L18a (ribosomal protein L18a)基因(DNA)、編碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)33中記載的RPL18A基因(GenBank登錄號(hào)NM_000980)或其他生物種同源物等。RPL18A基因可以根據(jù)Adams M.D.,等，1992 年,Nature,第 355 卷,pp.632 — 634 中記載的方法得到。
[0179]本說明書中使用的“GAS7基因”或“GAS7”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)34)表示的生長(zhǎng)終止特異性蛋白7 (Growth 一 arrest 一specific protein7)基因(DNA)、編碼GAS — 7、MGC1348、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)34中記載的GAS7基因(GenBank登錄號(hào)NM_201432)或其他生物種同源物等。GAS7 基因可以根據(jù) Ju Y.T.,等，1998 年，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，第95卷，pp.11423 — 11428中記載的方法得到。
[0180]本說明書中使用的“WISP1基因”或“WISP1”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)35)表示的WNTl誘導(dǎo)信號(hào)通道蛋白I (WNTlinduciblesignaling pathway proteinl)基因(DNA)、編碼CCN4、WISPlc、WISPl1、WISPltc、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)35中記載的WISPl基因(GenBank登錄號(hào)NM_003882)或其他生物種同源物等。WISPl基因可以根據(jù)Pennica D.，等，1998年，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,第 95 卷，pp.14717 — 14722 中記載的方法得到。
[0181]本說明書中使用的“ CACNG4基因”或“ CACNG4 ”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)36)表示的依賴電壓的鈣離子通道Y — 4亞單元(voltage — dependent calcium channel gamma — 4subunit)基因(DNA)、編碼神經(jīng)兀電壓門控性鈣通道 Y — 4 亞單位(Neuronal voltage — gated calcium channel gamma —4subunit)、MGC11138、MGC24983、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)36中記載的CACNG4基因(GenBank登錄號(hào)NM_014405)或其他生物種同源物等。CACNG4基因可以根據(jù) Burgess D.L.,等，1999 年,Genome Res.，第 9 卷，pp.1204 — 1213 中記載的方法得到。[0182]本說明書中使用的“S100P基因”或“S100P”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)37)表示的S -1OOP蛋白(S - 100P protein)基因(DNA)、編碼S100 鈣結(jié)合蛋白P (SlOOcalcium binding protein P)、MIG9、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)37中記載的S100P基因(GenBank登錄號(hào)NM_005980)或其他生物種同源物等。S100P基因可以根據(jù)Becker T.,等，1992年，Eur.J.Biochem.，第207卷，pp.541 — 547中記載的方法得到。
[0183]本說明書中使用的“UCHL5基因”或“UCHL5”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)38)表示的泛素羧基末端水解酶L5(ubiquitin carboxyl 一terminal hydrolase L5)基因(DNA)、編碼UCH37、CGI — 70、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)38中記載的UCHL5基因(GenBank登錄號(hào)NM_015984)或其他生物種同源物等。UCHL5基因可以根據(jù)Wicks S.J.，等，2005年，Oncogene，第24卷，pp.8080 — 8084中記載的方法得到。
[0184]本說明書中使用的“APQ3基因”或“APQ3”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)39)表示的水通道蛋白3 (Aquaporin3)基因(DNA)、編碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)39中記載的APQ3基因(GenBank登錄號(hào)NM_004925)或其他生物種同源物等。APQ3基因可以根據(jù)Kuriyama H.,等，1997年,Biochem.Biophys.Res.Commun.,第 241 卷,pp.53 — 58 中記載的方法得到。
[0185]本說明書中使用的“NSUN5基因”或“NSUN5”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)40)表示的N0L1/N0P2/太陽域家族成員5 (N0Ll/N0P2/Sundomain family, member5)基因(DNA)、編碼 pl20、N0L1R、NOL1、MGC986、NSUN5A、WBSCR20、FLJ10267、WBSCR20A、pl20(N0Ll)、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)40中記載的NSUN5基因(GenBank登錄號(hào)NM_018044)或其他生物種同源物等。NSUN5基因可以根據(jù) Doll A.，等，2001 年,Cytogenet.Cell Genet.,第 95 卷，pp.20 — 27 中記載的方法得到。
[0186]本說明書中使用的“B4GALT2基因”或“B4GALT2”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)41)表示的UDP - Gal: β GIcNAc β 1，4 一半乳糖基轉(zhuǎn)移酶多妝 2 (UDP — GalibetaGlcNAc betal, 4 — galactosyl transferase, po lypept ide2)基因(DNA)、編碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)41中記載的B4GALT2基因(GenBank登錄號(hào)BC096821)或其他生物種同源物等。B4GALT2基因可以根據(jù)Lo N.ff.,等，1998 年,Glycobiology,第 8 卷，pp.517 — 52 中記載的方法得到。
[0187]本說明書中使用的“CD48基因”或“CD48”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)42)表示的CD48分子(CD48molecule)基因(DNA)、編碼BCM1、BLAST、hCD48、mCD48、BLASTl、SLAMF2、MEM 一 102、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)0具體包括序列號(hào)42中記載的CD48基因(GenBank登錄號(hào)NM_001778)或其他生物種同源物等。CD48 基因可以根據(jù) Wong Y.W.,等，1990 年，J.Exp.Med.，第 171 卷，pp.2115 —2130中記載的方法得到。
[0188]本說明書中使用的“DAB2基因”或“DAB2”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)43)表示的失效同源物2，促分裂原應(yīng)答磷蛋白(Disabledhomolog2, mitogen — responsive phosphoprotein)基因(DNA)、編碼 D0C2、DOC — 2、FLJ26626、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)43中記載的DAB2基因(GenBank登錄號(hào)NM_001343)或其他生物種同源物等。DAB2基因可以根據(jù)AlbertsenH.M.,等，1996年,Genomics,第33卷，pp.207 — 213中記載的方法得到。
[0189]本說明書中使用的“EBI3基因”或“EBI3”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)44)表示的Epstein — barr病毒誘導(dǎo)(Epstein — barr virusinduced)基因(DNA)、編碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)44中記載的EBI3基因(GenBank登錄號(hào)NM_005755)或其他生物種同源物等。EBI3基因可以根據(jù)Devergne 0.，等，1996年，J.Virol.，第70卷，pp.1143 一 1153中記載的方法得到。
[0190]本說明書中使用的“MAP3K12基因”或“MAP3K12”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)45)表示的絲裂原活化蛋白激酶12 (mitogen 一activated protein kinasel2)基因(DNA)、編碼 DLK、MUK, ZPK, ZPKP1、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)45中記載的MAP3K12基因(GenBank登錄號(hào)NM_006301)或其他生物種同源物等。MAP3K12基因可以根據(jù)Ready U.R.和PleasureD., 1994 年,Biochem.Biophys.Res.Commun.,第 202 卷,pp.613 — 620 中記載的方法得到。
[0191]本說明書中使用的“ SPEN基因”或“ SPEN ”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)46)表示的spen同源物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(spenhomolog, transcriptional regulator)基因(DNA)、編碼 MINT、SHARP、KIAA0929、RPl —134019.1、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)46中記載的SPEN基因(GenBank登錄號(hào)NM_015001)或其他生物種同源物等。SPEN基因可以根據(jù)Shi T.，等,2001年,Genes Dev.,第15卷，pp.1140 — 1151中記載的方法得到。
[0192]本說明書中使用的“ARHGEF3基因”或“ARHGEF3”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)47)表示的Rho鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子(GEF) 3 (Rho guaninenucleotide exchange factor (GEF) 3)基因(DNA)、編碼 GEF、STA3、XPLN、MGCl 18905,DKFZP434F2429、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)47中記載的ARHGEF3基因(GenBank登錄號(hào)NM_019555)或其他生物種同源物等。ARHGEF3基因可以根據(jù) Thiesen S.，等，2000 年,Biochem.Biophys.Res.Commun.,第 273 卷,pp.364 — 369 中記載的方法得到。
[0193]本說明書中使用的“C0L3A1基因”或“C0L3A1”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)48)表示的a (III)型前膠原3’區(qū)域(3 ‘regionfor pro - alpha (III) collagen)基因(DNA)、編碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)0具體包括序列號(hào)48中記載的C0L3A1基因(GenBank登錄號(hào)X06700)或其他生物種同源物等。C0L3A1 基因可以根據(jù) Loidl H.R.,等，1984 年，Nucleic Acids Res.,第 16卷，pp.9383 — 9394中記載的方法得到。
[0194]本說明書中使用的“CSTB基因”或“CSTB”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)49)表示的半胱氨酸蛋白酶抑制劑一 B (Cystatin 一 B)基因(DNA)、編碼 Stefin — B、肝疏基蛋白酶抑制劑(Liver thiol proteinase inhibitor)、CP1- B、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)49中記載的CSTB基因(GenBank登錄號(hào)NM_000100)或其他生物種同源物等。CSTB基因可以根據(jù)Jerala，R.，等.,1988年,FEBS Lett.,第239卷,pp.41 — 44中記載的方法得到。
[0195]本說明書中使用的“ SPRR3基因”或“ SPRR3 ”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)50)表示的小脯氨酸豐富蛋白3 (Small proline — richprotein3)基因(DNA)、編碼Cornifine、Esophagin、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)0具體包括序列號(hào)50中記載的SPRR3基因(GenBank登錄號(hào)NM_005416)或其他生物種同源物等。SPRR3基因可以根據(jù)Abraham J.M.，等，1996年，Cell Growth Differ.,第7卷，pp.855 — 860中記載的方法得到。
[0196]本說明書中使用的“SLIT2基因”或“SLIT2”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)51)表示的Slit同源物2蛋白(Slit homolog2protein)基因(DNA)、編碼Slit - 2、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)51中記載的SLIT2基因(GenBank登錄號(hào)NM_004787)或其他生物種同源物等。SLIT2基因可以根據(jù)Holmes G.P.,等，1998年,Mech.Dev.,第79卷，pp.57 — 72中記載的方法得到。
[0197]本說明書中使用的“CAMK2B基因”或“CAMK2B”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)52)表示的鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶II型β鏈(Calcium/calmodulin — dependent protein kinase type II beta chain)基因(DNA)、編石馬CaM—激酶 ΙΙβ 鏈(CaM —kinase II beta chain)、CaM激酶 II β 亞單位(CaM kinase II subunitbeta)、CaMK — II激酶β亞單位(CaMK — II subunit beta)、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)52中記載的CAMK2B基因(GenBank登錄號(hào)NM_001220)或其他生物種同源物等。CAMK2B基因可以根據(jù)Tombes R.M.,等，1997年,Biochem.Biophys.Acta.，第1355卷，pp.281 — 292中記載的方法得到。
[0198]本說明書中使用的“SLC2A14基因”或“SLC2A14”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)53)表示的溶質(zhì)載體家族2 (Solute carrier family2)基因(DNA)、編碼易化葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)成員 14 (facilitated glucose transporter member 14) >葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白14 (Glucose transporter typel4)、GLUT14、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)53中記載的SLC2A14基因(GenBank登錄號(hào)NM_153449)或其他生物種同源物等。SLC2A14基因可以根據(jù)Wu X.等，2002年，Genomics,第80卷，pp.553 — 557中記載的方法得到。
[0199]本說明書中使用的“ SATB2基因”或“ SATB2 ”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)54)表示的DNA結(jié)合蛋白SATB2 (DNA 一 binding proteinSATB2)基因(DNA)、編碼特異富含AT序列結(jié)合蛋白2 (Special AT - rich sequence -binding protein2)、FLJ21474、KIAA1034、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)54中記載的SATB2基因(GenBank登錄號(hào)NM_015265)或其他生物種同源物等。SATB2 基因可以根據(jù) FitzPatrick D.R.,等，2003 年，Hum.Mol.Genet.，第 12卷，pp.2491 — 2501中記載的方法得到。
[0200]本說明書中使用的“ SEPT6基因”或“ SEPT6 ”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)55)表示的S印tin - 6基因(DNA)、編碼KIAA0128、MGC16619、MGC20339、SEP2、SEPT2、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)55中記載的SEPT6基因(GenBank登錄號(hào)ΝΜ_015129)或其他生物種同源物等。SEPT6基因可以根據(jù) Sui L.，等，2003 年,Biochem.Biophys.Res.Commun.,第 304 卷,pp.393 —398中記載的方法得到。
[0201]本說明書中使用的“GALNS基因”或“GALNS”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)56)表示的半乳糖胺(N —乙?；?-6 一硫酸鹽硫酸酯酶(Galactosamine (N — acetyl) — 6 — sulfate sulfatase)基因(DNA)、編碼Morquio syndrome、粘多糖忙積癥 IVA 型(mucopolysaccharidosis type IVA)、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)56中記載的GALNS基因(GenBank登錄號(hào)NM_000512)或其他生物種同源物等。GALNS基因可以根據(jù)Nakashima Y.,等，1994年，Genomics,第20卷，pp.99 — 104中記載的方法得到。
[0202]本說明書中使用的“TR0AP基因”或“TR0AP”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列 (序列號(hào)57)表示的滋養(yǎng)蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(Trophinin associatedprotein)基因(DNA)、編碼滋養(yǎng)蛋白輔助蛋白(tastin)、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)57中記載的TROAP基因(GenBank登錄號(hào)NM_005480)或其他生物種同源物等。TROAP基因可以根據(jù)Fukuda M.N.,等，1995年，Genes Dev.,第9卷，pp.1199 — 1210中記載的方法得到。
[0203]本說明書中使用的“XRCC3基因”或“XRCC3”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)58)表示的中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞X射線修復(fù)補(bǔ)缺陷修復(fù)3 (X -ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells3)基因(DNA)、編碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)58中記載的XRCC3基因(GenBank登錄號(hào)NM_005432)或其他生物種同源物等。XRCC3基因可以根據(jù)Tebbs R.S.，等，1995 年，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,第 92 卷，pp.6354 — 6358 中記載的方法得到。
[0204]本說明書中使用的“FGF3基因”或“FGF3”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)59)表示的成纖維生長(zhǎng)因子3 (fibroblast growth factor3)基因(DNA)、編碼鼠乳腺腫瘤病毒整合位點(diǎn)(V — int 一 2)癌基因同源物(murine mammarytumor virus integration site(v — int — 2)oncogene homolog)、INT — 2>HBGF — 3、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)59中記載的FGF3基因(GenBank登錄號(hào)NM_005247)或其他生物種同源物等。FGF3基因可以根據(jù)Brookes S.，等，1989年，Oncogene,第4卷，pp.429 — 436中記載的方法得到。
[0205]本說明書中 使用的“EIF4EBP2基因”或“EIF4EBP2”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)60)表示的真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白(eukaryotic translation initiation factor4E binding protein)基因(DNA)、編石馬4EBP2、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)60中記載的EIF4EBP2基因(GenBank登錄號(hào)NM_004096)或其他生物種同源物等。EIF4EBP2基因可以根據(jù)PauseA.，等，1994, Nature.,第 371 卷,pp.762 — 767 中記載的方法得到。Kawamata, H.等,2003年，Cancer Science,第94卷，pp.699 一 706中公開了 EIF4EBP2基因在食管癌株化細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性亞株中表達(dá)增加。
[0206]本說明書中使用的“RRM1基因”或“RRM1”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)61)表示的核苷酸還原酶Ml多肽(ribonucleotide reductaseMlpolyp印tide)基因(DNA)、編碼Rl、RRU RIR1、其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)0具體包括序列號(hào)61中記載的RRMl基因(GenBank登錄號(hào)NM_001033)或其他生物種同源物等。RRMl基因可以根據(jù)Parker N.J.,等，1994年，Genomics,第19卷，pp.91 一96中記載的方法得到。 [0207]本說明書中使用的“M6PR基因”或“M6PR”的術(shù)語，在沒有被序列號(hào)定義的情況下，包括特定堿基序列(序列號(hào)62)表示的甘露糖一 6 —磷酸受體(陽離子依賴)(mannose —6 — phosphate receptor (cation dependent))基因(DNA)、編碼其同源物、變異體及衍生物等的基因(DNA)。具體包括序列號(hào)62中記載的M6PR基因(GenBank登錄號(hào)NM_002355)或其他生物種同源物等。M6PR基因可以根據(jù)Pohlmann R.，等，1987年，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，第84卷，pp.5575 — 5579中記載的方法得到。
[0208]本發(fā)明提供對(duì)診斷及治療食管癌有用的疾病確定用組合物及使用了該組合物的食管癌確定(或檢測(cè))方法，由此具有以下獨(dú)特的作用效果，即，提供具有特異性且預(yù)測(cè)率高、及迅速、簡(jiǎn)單的確定食管癌的方法。
[0209]本說明書包括作為本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本國(guó)專利申請(qǐng)2008 - 133491號(hào)說明書及/或附圖中記載的內(nèi)容。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0210][圖1]表不組合使用與表1中記載的基因?qū)?yīng)的序列號(hào)63~124的多核苷酸時(shí)，存在食管癌細(xì)胞的檢出率。縱軸表示能夠檢測(cè)到樣品中存在食管癌組織的準(zhǔn)確率，橫軸表示檢測(cè)食管癌所需要的基因總數(shù)，該基因數(shù)按照表1中記載的序列號(hào)依次增加。
[0211][圖2]表不組合使用與表1中記載的基因?qū)?yīng)的序列號(hào)63~124的多核苷酸時(shí)，存在食管癌細(xì)胞的檢出率?？v軸表示樣品中存在食管癌組織的準(zhǔn)確率，橫軸從左依次表示以由食管癌組織得到的總RNA與由不含食管癌的組織得到的總RNA的比率為9:1、8:2、7:
3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9混合得到的RNA混合物的數(shù)據(jù)。
[0212][圖3]表不組合使用與表1中記載的基因?qū)?yīng)的序列號(hào)63~124的多核苷酸時(shí)，存在來自活檢組織的食管癌細(xì)胞的檢出率。縱軸表示活檢樣品中存在食管癌組織的準(zhǔn)確率，橫軸的左邊的框表示由利用內(nèi)窺鏡采集的食管癌患者的不含食管癌的活檢組織得到的數(shù)據(jù)，橫軸的右邊的框表示由利用內(nèi)窺鏡采集的食管癌患者的含有食管癌的活檢組織得到的數(shù)據(jù)。
[0213][圖4]表示組合使用與國(guó)際公開第2006/118308號(hào)中記載的食管癌診斷用組合物對(duì)應(yīng)的多核苷酸時(shí)，存在食管癌細(xì)胞的檢出率。辨別機(jī)按照專利文獻(xiàn)6所述的方法，制作癌辨別用辨別機(jī)，辨別活檢樣品中存在食管癌組織的準(zhǔn)確率。縱軸表示活檢樣品中存在食管癌組織的準(zhǔn)確率，橫軸的左邊的框表示由利用內(nèi)窺鏡采集的食管癌患者的不含食管癌的活檢組織得到的數(shù)據(jù)，橫軸的右邊的框表示由利用內(nèi)窺鏡采集的食管癌患者的含有食管癌的活檢組織得到的數(shù)據(jù)。
[0214][圖5]表示組合使用與國(guó)際公開第2006/118308號(hào)中記載的食管癌診斷用組合物對(duì)應(yīng)的多核苷酸時(shí)，存在食管癌細(xì)胞的檢出率。辨別機(jī)按照專利文獻(xiàn)6所述的方法，制作非癌辨別用辨別機(jī)，辨別活檢樣品中存在食管癌組織的準(zhǔn)確率?？v軸表示活檢樣品中存在食管癌組織的準(zhǔn)確率，橫軸的左邊的框表示由利用內(nèi)窺鏡采集的食管癌患者的不含食管癌的活檢組織得到的數(shù)據(jù)，橫軸的右邊的框表示由利用內(nèi)窺鏡采集的食管癌患者的含有食管癌的活檢組織得到的數(shù)據(jù)。
[0215][圖6]表示組合使用與國(guó)際公開第2006/118308號(hào)中記載的食管癌診斷用組合物對(duì)應(yīng)的多核苷酸時(shí)，存在食管癌細(xì)胞的檢出率。利用本說明書所述的方法制作辨別機(jī)，辨別活檢樣品中存在食管癌組織的準(zhǔn)確率?？v軸表示活檢樣品中存在食管癌組織的準(zhǔn)確率，橫軸的左邊的框表示由利用內(nèi)窺鏡采集的食管癌患者的不含食管癌的活檢組織得到的數(shù)據(jù)，橫軸的右邊的框表示由利用內(nèi)窺鏡采集的食管癌患者的含有食管癌的活檢組織得到的數(shù)據(jù) 。 【具體實(shí)施方式】
[0216]以下進(jìn)一步具體地說明本發(fā)明。
[0217]1.食管癌靶核酸
[0218]作為在使用本發(fā)明上述定義的食管癌診斷用組合物及試劑盒用于確定存在及/或不存在食管癌或食管癌細(xì)胞的食管癌標(biāo)記物的靶核酸，例如包括含有序列號(hào)I~62表示的堿基序列的人類基因(即，EYA2、SERF1A、IGHGl、ITSN2、RAB11FIP5、HSPA1A、NMU, E2F3、ESR2、CFDP1、HSPC190、COLIA2、GCS1、PARL、CELSR2、NDRG1、SLC25A44、TUSC2、SLC4A1、MS4A7、TMSB4X、PRCl、VCP, RBM9、GPR126、H0XA10, PPP1R1A、MY09B、SLC04C1、SERPINB13、SDC2、T0R1A、RPL18A、GAS7、WISPl、CACNG4、S100P、UCHL5、AQP3、NSUN5、B4GALT2、CD48、DAB2、EB13、MAP3K12、SPEN、ARHGEF3、C0L3A1、CSTB、SPRR3、SLIT2、CAMK2B、SLC2A14、SATB2、SEPT6、GALNS、TR0AP、XRCC3、FGF3、EIF4EBP2、RRM1 及 M6PR)、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或 cDNA、或其變異體或衍生物。此處，基因、同源物、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、cDNA、變異體及衍生物的含義與上述定義相同。優(yōu)選的靶核酸為含有序列號(hào)I~62表示的堿基序列的人類基因、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA，較優(yōu)選該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA。
[0219]在本發(fā)明中，成為食管癌靶的上述基因在患有食管癌的受試者中的表達(dá)水平，與健康受試者相比均增加/降低(參見下述實(shí)施例的表1)。
[0220]第I靶核酸是EYA2基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于EYA2基因或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志(marker)的報(bào)道。
[0221]第2靶核酸是SERFlA基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于SERFlA基因或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0222]第3靶核酸是IGHGl基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于IGHGl基因或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0223]第4靶核酸是ITSN2基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于ITSN2基因或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0224]第5靶核酸是RAB11FIP5基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于RAB11FIP5基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0225]第6靶核酸是HSPAlA基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于HSPAlA基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0226]第7靶核酸是NMU基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于NMU基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0227]第8靶核酸是E2F3基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于E2F3基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0228]第9靶核酸是ESR2基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于ESR2基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0229]第10靶核酸是CFDPl基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于CFDPl基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0230]第11靶核酸是HSPC190基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于HSPC190基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0231]第12靶核酸是C0L1A2基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于C0L1A2基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0232]第13靶核酸是GCSl基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于GCSl基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0233]第14靶核酸是PARL基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于PARL基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)減少可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0234]第15靶核酸是CELSR2基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于CELSR2基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0235] 第16靶核酸是NDRGl基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于NDRGl基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0236]第17靶核酸是SLC25A4基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于SLC25A4基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0237]第18靶核酸是TUSC2基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于TUSC2基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0238]第19靶核酸是SLC4A1基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于SLC4A1基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0239]第20靶核酸是MS4A7基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于MS4A7基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)減少可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0240]第21靶核酸是TMSB4X基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于TMSB4X基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0241]第22靶核酸是PRCl基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于PRCl基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)減少可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0242]第23靶核酸是VCP基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于VCP基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0243]第24靶核酸是RBM9基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于RBM9基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0244]第25靶核酸是GPR126基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于GPR126基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0245]第26靶核酸是H0XA10基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于H0XA10基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0246]第27靶核酸是PPP1R1A基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于PPP1R1A基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0247]第28靶核酸是MY09B基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于MY09B基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0248]第29靶核酸是SLC04C1基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于SLC04C1基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0249]第30靶核酸是SERPINB13基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于SERPINB13基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0250]第31靶核酸是SDC2基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于SDC2基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)減少可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0251]第32靶核酸是TORlA基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于TORlA基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0252]第33靶核酸是RPL18A基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于RPL18A基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0253]第34靶核酸是GAS7基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于GAS7基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0254]第35靶核酸是WISPl基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于WISPl基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)減少可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0255]第36靶核酸是CACNG4基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于CACNG4基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)增加可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0256]第37靶核酸是S100P基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于S100P基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)減少可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0257]第38靶核酸是UCHL5基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于UCHL5基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)減少可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。 [0258]第39靶核酸是AQP3基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知AQP3基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)可以作為食管癌的標(biāo)志(W006118308)。
[0259]第40靶核酸是NSUN5基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知NSUN5基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)可以作為食管癌的標(biāo)志(W006118308)。
[0260]第41靶核酸是B4GALT2基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知B4GALT2基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)可以作為食管癌的標(biāo)志(W006118308)。
[0261]第42靶核酸是⑶48基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知⑶48基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)可以作為食管癌的標(biāo)志(W006118308)。
[0262]第43靶核酸是DAB2基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知DAB2基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)可以作為食管癌的標(biāo)志(W006118308)。
[0263]第44靶核酸是EBI3基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知EBI3基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)可以作為食管癌的標(biāo)志(W006118308)。
[0264]第45靶核酸是MAP3K12基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知MAP3K12基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)可以作為食管癌的標(biāo)志(W006118308)。
[0265]第46靶核酸是SPEN基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知SPEN基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)可以作為食管癌的標(biāo)志(W006118308)。
[0266]第47靶核酸是ARHGEF3基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知ARHGEF3基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)可以作為食管癌的標(biāo)志(W006118308)。
[0267]第48靶核酸是C0L3A1基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知C0L3A1基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)可以作為食管癌的標(biāo)志(Su, H.，等，2003年，CancerResearch,第 63 卷，pp.3872-3876)。
[0268]第49靶核酸是CSTB基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知CSTB基因或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)可以作為食管癌的標(biāo)志(W003042661、Shiraishi，T.，等,1998 年,International Journal of Cancer,第 79 卷，pp.175-178)。
[0269]第50靶核酸是SPRR3基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知SPRR3基因?yàn)槭彻馨┑臉?biāo)志(W006118308、國(guó)際公開W02003/042661說明書、Chem, B.S.，等，2000 年,Carcinogenesis,第 21 卷,p2147-2150>Abraham, J.Μ.,等，1996 年,CellGrowth&Differentiation,第 7 卷，p855_860)。
[0270]第51靶核酸是SLIT2基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知SLIT2基因?yàn)槭彻馨┑臉?biāo)志(W006118308)。
[0271 ] 第52靶核酸是CAMK2B基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知CAMK2B基因?yàn)槭彻馨┑臉?biāo)志(W006118308)。
[0272]第53靶核酸是SLC2A14基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知SLC2A14基因?yàn)槭彻馨┑臉?biāo)志(W006118308)。
[0273]第54靶核酸是SATB2基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知SATB2基因?yàn)槭彻馨┑臉?biāo)志(W006118308)。
[0274]第55靶核酸是SEPT6基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。迄今為止還沒有關(guān)于SEPT6基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)減少可以作為食管癌的標(biāo)志的報(bào)道。
[0275]第56靶核酸是GALNS基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知GALNS基因?yàn)槭彻馨┑臉?biāo)志(W006118308)。
[0276]第57靶核酸是TROAP基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知TROAP基因?yàn)槭彻馨┑臉?biāo)志(W006118308)。[0277]第58靶核酸是XRCC3基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知XRCC3基因?yàn)槭彻馨┑臉?biāo)志(W006118308)。
[0278]第59靶核酸是FGF3基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知FGF3基因?yàn)槭彻馨┑臉?biāo)志(W006118308)。
[0279]第60靶核酸是EIF4EBP2基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知EIF4EBP2基因?yàn)槭彻馨┑臉?biāo)志(W006118308 )。
[0280]第61靶核酸是RRMl基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知RRMl基因?yàn)樯掀は祼盒阅[瘤的標(biāo)志(W006119464A1)。
[0281]第62靶核酸是M6PR基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。已知M6PR基因?yàn)槭彻馨┑臉?biāo)志(W006118308)。
[0282]2.食管癌相關(guān)靶多肽
[0283]作為使用本發(fā)明上述定義的食管癌診斷用組合物及試劑盒用于確定食管癌或食管癌細(xì)胞存在及/或不存在的食管癌標(biāo)記物的靶核酸，包括例如由含有序列號(hào)I~62表示的堿基序列的人類基因(即，分別為 EYA2、SERF1A、IGHGU ITSN2、RAB11FIP5、HSPA1A、NMU,E2F3、ESR2、CFDP1、HSPC190、COLIA2、GCS1、PARL、CELSR2、NDRG1、SLC25A44、TUSC2、SLC4A1、MS4A7、TMSB4X、PRCU VCP, RBM9、GPR126、H0XA10, PPP1R1A、MY09B、SLC04C1、SERPINB13、SDC2、T0R1A、RPL18A、GAS7、WISPl、CACNG4、S100P、UCHL5、AQP3、NSUN5、B4GALT2、CD48、DAB2、EB13、MAP3K12、SPEN、ARHGEF3、C0L3A1、CSTB、SPRR3、SLIT2、CAMK2B、SLC2A14、SATB2、SEPT6、GALNS, TROAP, XRCC3、FGF3、EIF4EBP2、RRMl、及 M6PR)編碼的多肽，例如含有序列號(hào)125~186表示的氨基酸序列的人多肽、其同源物、或其變異體或衍生物。此處，多肽、同源物、變異體及衍生物的含義與上述定義相同。優(yōu)選的靶多肽是含有序列號(hào)125~186表示的氨基酸序列的人多肽。
[0284]本發(fā)明中，成為食管癌的靶的上述多肽與對(duì)應(yīng)的基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)量相同地都具有以下特征:食管組織中的表達(dá)量低于其在非癌組織中的表達(dá)量，或血液中的該多肽的水平在患有食管癌的受試者中與健康受試者相比增加或下降。
[0285]3.食管癌診斷用組合物
[0286]3.1 核酸
[0287]本發(fā)明中，能用于確定或診斷食管癌的核酸組合物能夠定性及/或定量地測(cè)定食管癌的靶核酸的存在、表達(dá)水平或存在量，作為食管癌的靶核酸，為來自人的EYA2、SERF1A、IGHGl、ITSN2、RAB11FIP5、HSPA1A、NMU、E2F3、ESR2、CFDPl、HSPC190、COL1A2、GCSl、PARL、CELSR2、NDRG1、SLC2 5A44、TUSC2、SLC4A1、MS4A7、TMSB4X、PRC1、VCP、RBM9、GPR126、HOXAIO、PPP1R1A、MY09B、SLC04C1、SERPINB13、SDC2、T0R1A、RPL18A、GAS7、WISPl、CACNG4、S100P、UCHL5、AQP3、NSUN5、B4GALT2、CD48、DAB2、EBI3、MAP3K12、SPEN、ARHGEF3、C0L3A1、CSTB、SPRR3、SLIT2、CAMK2B、SLC2A14、SATB2、SEPT6、GALNS、TROAP, XRCC3、FGF3、EIF4EBP2、RRMl及M6PR基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或其變異體或衍生物。
[0288]上述靶核酸在患有食管癌的受試者中的表達(dá)水平與在健康受試者中的表達(dá)水平相比增加或降低。因此，本發(fā)明的組合物能夠有效地用于測(cè)定食管癌組織和正常食管組織中的靶核酸的表達(dá)水平，并對(duì)其進(jìn)行比較。
[0289]本發(fā)明中能使用的組合物包括選自下述多核苷酸組的I種或多種(優(yōu)選3個(gè)以上、較優(yōu)選5個(gè)以上)多核苷酸的組合，所述多核苷酸組為患有食管癌的患者的生物組織中含有序列號(hào)I~62表示的堿基序列的多核苷酸組及其互補(bǔ)多核苷酸組；在嚴(yán)格條件下與下述DNA分別雜交的多核苷酸組及其互補(bǔ)多核苷酸組，所述DNA由與上述堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成；及上述多核苷酸組的堿基序列中含有15個(gè)以上、優(yōu)選20個(gè)以上、較優(yōu)選25個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸組。
[0290]具體而言，本發(fā)明的組合物可以含有以下I種或多種(優(yōu)選3個(gè)以上、較優(yōu)選5個(gè)以上)多核苷酸或其片段。
[0291](I)由序列號(hào)I~62表不的堿基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0292](2)含有序列號(hào)I~62表示的堿基序列的多核苷酸組。
[0293](3)由序列號(hào)I~62表不的堿基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0294](4)含有序列號(hào)I~38表示的堿基序列的多核苷酸組。
[0295](5)由與序列號(hào)I~38表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0296](6)含有與序列號(hào)I~38表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸組。
[0297](7)在嚴(yán)格條件下，與下述DNA雜交的多核苷酸組、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段，上述DNA由與序列號(hào)I~38表示的各堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成。
[0298](8)在嚴(yán)格條件下與由序列號(hào)I~38表示的各堿基序列組成的DNA雜交的多核苷酸組、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0299](9)由序列號(hào)39~62表不的堿基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0300](10)含有序列號(hào)39~62表示的堿基序列的多核苷酸組。
[0301](11)由與序列號(hào)39~62表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0302](12)含有與序列號(hào)39~62表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸組。
[0303](13)在嚴(yán)格條件下，與下述DNA雜交的多核苷酸組、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段，上述DNA由與 序列號(hào)39~62表示的各堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成。[0304](14)在嚴(yán)格條件下，與由序列號(hào)39~62表示的各堿基序列組成的DNA雜交的多核苷酸組、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0305]上述(I)~(14)的多核苷酸的片段可以含有各多核苷酸的堿基序列中的例如下述范圍的連續(xù)堿基數(shù)，但并不限定于此，所述范圍包括15~序列的全部堿基數(shù)、15~5000個(gè)堿基、15~4500個(gè)堿基、15~4000個(gè)堿基、15~3500個(gè)堿基、15~3000個(gè)堿基、15~2500個(gè)堿基、15~2000個(gè)堿基、15~1500個(gè)堿基、15~1000個(gè)堿基、15~900個(gè)堿基、15~800個(gè)堿基、15~700個(gè)堿基、15~600個(gè)堿基、15~500個(gè)堿基、15~400個(gè)堿基、15~300個(gè)堿基、15~250個(gè)堿基、15~200個(gè)堿基、15~150個(gè)堿基、15~140個(gè)堿基、15~130個(gè)堿基、15~120個(gè)堿基、15~110個(gè)堿基、15~100個(gè)堿基、15~90個(gè)堿基、15~80個(gè)喊基、15~70個(gè)喊基、15~60個(gè)喊基、15~50個(gè)喊基、15~40個(gè)喊基、15~30個(gè)喊基或15~25個(gè)喊基；25~序列的全部喊基數(shù)、25~1000個(gè)喊基、25~900個(gè)喊基、25~800個(gè)堿基、25~700個(gè)堿基、25~600個(gè)堿基、25~500個(gè)堿基、25~400個(gè)堿基、25~300個(gè)堿基、25~250個(gè)堿基、25~200個(gè)堿基、25~150個(gè)堿基、25~140個(gè)堿基、25~130個(gè)堿基、25~120個(gè)堿基、25~110個(gè)堿基、25~100個(gè)堿基、25~90個(gè)堿基、25~80個(gè)堿基、25~70個(gè)堿基、25~60個(gè)堿基、25~50個(gè)堿基或25~40個(gè)堿基；50~序列的全部堿基數(shù)、50~1000個(gè)堿基、50~900個(gè)堿基、50~800個(gè)堿基、50~700個(gè)堿基、50~600個(gè)堿基、50~500個(gè)堿基、50~400個(gè)堿基、50~300個(gè)堿基、50~250個(gè)堿基、50~200個(gè)堿基、50~150個(gè)堿基、50~140個(gè)堿基、50~130個(gè)堿基、50~120個(gè)堿基、50~110個(gè)堿基、50~100個(gè)堿基、50~90個(gè)堿基、50~80個(gè)堿基、50~70個(gè)堿基或50~60個(gè)喊基；60~序列的全部喊基數(shù)、60~1000個(gè)喊基、60~900個(gè)喊基、60~800個(gè)堿基、60~700個(gè)堿基、60~600個(gè)堿基、60~500個(gè)堿基、60~400個(gè)堿基、60~300個(gè)堿基、60~250個(gè)堿基、60~200個(gè)堿基、60~150個(gè)堿基、60~140個(gè)堿基、60~130個(gè)堿基、60~120個(gè)堿基、60~110個(gè)堿基、60~100個(gè)堿基、60~90個(gè)堿基、60~80個(gè)堿基或60~70個(gè)堿基等。
[0306]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，含有序列號(hào)I~62表不的堿基序列的多核苷酸的片段，優(yōu)選分別含有序列號(hào)63~124表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列、或其連續(xù)15個(gè)堿基以上的部分序列。
[0307]本發(fā)明的組合物中例如含有以下多核苷酸。
[0308](I)序列號(hào)I~38表示的堿 基序列或其互補(bǔ)序列的各序列中，含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0309](2)序列號(hào)I~38表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列的各序列中，含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0310](3)序列號(hào)39~62表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列中，含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0311](4)序列號(hào)39~62表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列中，含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0312](5)序列號(hào)I~38表不的喊基序列中，分別含有序列號(hào)63~100表不的喊基序列、且含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0313](6)與序列號(hào)I~38表示的堿基序列互補(bǔ)的序列中，分別含有與序列號(hào)63~100表示的堿基序列互補(bǔ)的序列、且含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0314](7)序列號(hào)39~62表示的堿基序列中，含有序列號(hào)101~124表示的堿基序列、且含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0315](8)與序列號(hào)39~62表示的堿基序列互補(bǔ)的序列中，分別含有與序列號(hào)101~124表示的堿基序列互補(bǔ)的序列、且含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0316]本發(fā)明中使用的上述多核苷酸類或其片段類均可以為DNA或RNA。
[0317]作為本發(fā)明的組合物的多核苷酸可以使用DNA重組技術(shù)、PCR法、使用DNA/RNA自動(dòng)合成儀的方法等常規(guī)技術(shù)進(jìn)行制作。
[0318]DNA重組技術(shù)及PCR法可以使用例如Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology, John Willey & Sons, US (1993) ;Sambrook 等，Molecular CloningA Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,US (1989)等中記載的技術(shù)。
[0319]來自人的EYA2、SERF1A、IGHGl、ITSN2、RAB11FIP5、HSPA1A、NMU、E2F3、ESR2、CFDPl、HSPC190、C0L1A2、GCSl、PARL、CELSR2、NDRGl、SLC25A44、TUSC2、SLC4A1、MS4A7、TMSB4X、PRCU VCP、RBM9、GPR126、H0XA10, PPP1R1A、MY09B、SLC04C1、SERPINB13、SDC2、T0R1A、RPL18A、GAS7、WISPl、CACNG4、S100P、UCHL5、AQP3、NSUN5、B4GALT2、CD48、DAB2、EB13、MAP3K12、SPEN、ARHGEF3、C0L3A1、CSTB、SPRR3、SLIT2、CAMK2B、SLC2A14、SATB2、SEPT6、GALNS、TROAP, XRCC3、FGF3、EIF4EBP2、RRMl及M6PR基因是公知的，如上所述，其獲得方法也是已知的。所以，可以通過克隆上述基因制作作為本發(fā)明的組合物的多核苷酸。
[0320]構(gòu)成本發(fā)明的組合物的多核苷酸可以使用DNA自動(dòng)合成裝置化學(xué)合成得到。通?？梢允褂脕喠柞０贩ㄟM(jìn)行合成，利用該方法可以自動(dòng)合成至約100個(gè)堿基的單鏈DNA。DNA自動(dòng)合成裝置可以從例如Polygen公司、ABI公司、Applied BioSystems公司等購(gòu)買。
[0321]或者，本發(fā)明的多核苷酸也可以通過cDNA克隆法制作。可以從表達(dá)作為本發(fā)明中的靶的上述基因的食管組織等生物組織中提取總RNA，將該總RNA用寡聚dT纖維素柱處理得到聚A ( + )RNA，通過RT— PCR法由該聚A ( + ) RNA制作cDNA庫(kù)，通過雜交篩選、表達(dá)篩選、抗體篩選等進(jìn)行篩選，從該cDNA庫(kù)得到目標(biāo)cDNA克隆。也可以根據(jù)需要，利用PCR法擴(kuò)增cDNA克隆?？梢曰谛蛄刑?hào)I~62表示的堿基序列，從15~100個(gè)連續(xù)堿基序列中選擇并合成探針或引物。例如在Sambrook, J.& Russel, D.著，Molecular Cloning, ALABORATORY MANUAL > Co Id Spring Harbor Laboratory Press、2001 年 I 月 15 日出版，第 I卷7.42~7.45，第2卷8.9~8.17中記載了 cDNA克隆技術(shù)。
[0322]3.2食管癌診斷用試劑盒(抗體)
[0323]本發(fā)明還提供一種食管癌診斷用試劑盒，所述食管癌診斷用試劑盒含有針對(duì)下述多肽的I種或多種(優(yōu)選3個(gè)以上)的抗體、其片段、或其化學(xué)修飾衍生物，所述多肽具有序列號(hào)125~162表不的氨基酸序列。
[0324]本發(fā)明的試劑盒可以進(jìn)一步含有針對(duì)下述多肽的I種或多種(優(yōu)選2個(gè)以上)的抗體、其片段、或其化學(xué)修飾衍生物，所述多肽具有序列號(hào)163~186表示的氨基酸序列。通過并用上述抗體，可以提高用于預(yù)后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度。
[0325]即，根據(jù)本發(fā)明，為了檢測(cè)作為食管癌標(biāo)記物的、被上述EYA2、SERF1A、IGHGUITSN2、RAB11FIP5、HSPA1A、NMU、E2F3、ESR2、CFDPl、HSPC190、COLIA2、GCSl、PARL、CELSR2、NDRG1、SLC2 5A44、TUSC2、SLC4A1、MS4A7、TMSB4X、PRC1、VCP、RBM9、GPR126、HOXAIO、PPPIRIA、MY09B、SLC04C1、SERPINB13、SDC2、T0R1A、RPL18A、GAS7、WISP1、CACNG4、S100P、UCHL5、AQP3、NSUN5、B4GALT2、CD48、DAB2、EBI3、MAP3K12、SPEN、ARHGEF3、C0L3A1、CSTB、SPRR3、SLIT2、CAMK2B、SLC2A14、SATB2、SEPT6、GALNS、TROAP, XRCC3、FGF3、EIF4EBP2、RRMl 及 M6PR 基因編碼的多肽、其同源物、或其變異體或衍生物，可以組合使用I種或多種針對(duì)上述多肽的抗體。
[0326]上述多肽可以利用DNA重組技術(shù)得到。例如，將如上所述得到的cDNA克隆插入表達(dá)載體中，通過培養(yǎng)由該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞，可以從該細(xì)胞或培養(yǎng)上清得到上述多肽。載體及表達(dá)系統(tǒng)可以從Novagen公司、寶酒造、第一化學(xué)藥品、Qiagen公司、Stratagene 公司 >Promega 公司、Roche Diagnositics 公司、Invitrogen 公司 >GeneticsInstitute公司、Amersham Bioscience公司等購(gòu)買。作為宿主細(xì)胞,可以使用細(xì)菌等原核細(xì)胞(例如大腸桿菌、枯草菌)、酵母(例如釀酒酵母)、昆蟲細(xì)胞(例如Sf細(xì)胞)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如C0S、CH0、BHK)等。載體中除含有編碼該多肽的DNA以外，還可以含有調(diào)節(jié)成分，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多聚腺苷酸化信號(hào)、核糖體結(jié)合部位、復(fù)制起始點(diǎn)、終止子、選擇標(biāo)記等。為了容易進(jìn)行多肽的精制，可以將多肽制成在多肽的C末端或N末端結(jié)合了標(biāo)記肽的融合多肽。作為代表性的標(biāo)記肽，可以舉出6~10個(gè)殘基的組氨酸重復(fù)序列、FLAG、myc肽、GFP多肽等，但標(biāo)記肽并不限定于此。另外，DNA重組技術(shù)記載于Sambrook, J.& Russel, D.(參見上述記載)。
[0327]在不結(jié)合標(biāo)記肽的狀態(tài)下制備本發(fā)明的多肽時(shí)，作為其精制方法，例如可以舉出利用離子交換色譜法的方法。除此之外，還可以使用組合凝膠過濾或疏水性色譜、等電點(diǎn)色譜等的方法。另一方面，在該蛋白上結(jié)合組氨酸重復(fù)序列、FLAG、myc、GFP等標(biāo)記肽時(shí)，可以舉出適合通常使用的各種標(biāo)記肽的親和色譜法。可以構(gòu)建能容易分離.精制的表達(dá)載體。特別是構(gòu)建能以多肽和標(biāo)記肽的融合多肽的狀態(tài)進(jìn)行表達(dá)的表達(dá)載體，利用基因工程技術(shù)制備該多肽時(shí)，也可容易地進(jìn)行分離.精制。
[0328]識(shí)別如上所述得到的多肽的抗體可以通過抗體的抗原結(jié)合部位特異性結(jié)合該多肽。具體而言可以將具有序列號(hào)125~186的氨基酸序列的多肽或其片段、其變異體多肽或融合多肽等，分別用作用于產(chǎn)生免疫反應(yīng)性抗體的免疫原。
[0329]更具體而言，多肽、片段、變異體、融合多肽等含有促使抗體形成的抗原決定基或抗原決定部位，上述抗原決定基或抗原決定部位可以是直鏈，也可以是較高級(jí)結(jié)構(gòu)(斷開)。需要說明的是，該抗原決定基或抗原決定部位可以通過本領(lǐng)域已知的所有方法進(jìn)行確定。
[0330]利用本發(fā)明的多肽能誘導(dǎo)所有種類的抗體。如果分離該多肽的全部或一部分或抗原決定部位，則使用常規(guī)技術(shù)即可制備多克隆抗體及單克隆抗體中的任一個(gè)。方法例如包括 Kennet 等(主編)，Monoclonal Antibodies, Hybridomas:A New Dimension inBiological Analyses, Ple num Press, NewYork, 1980 中列舉的方法。
[0331]作為本發(fā)明的抗體，只要是能與本發(fā)明的靶多肽或其片段特異性結(jié)合的抗體即可，沒有特別限定，可以使用單克隆抗體，也可以使用多克隆抗體，優(yōu)選使用單克隆抗體。另外，本發(fā)明抗體的球蛋白類型只要具有上述特征的抗體即可，沒有特別限定，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD 中的任一個(gè)。
[0332]<單克隆抗體的制作>[0333]( I)免疫及抗體產(chǎn)生細(xì)胞的采集
[0334]對(duì)哺乳動(dòng)物例如大鼠、小鼠(例如近交系小鼠Balb/c)、家兔等給與由靶多肽組成的免疫原。免疫原的I次給藥量可以根據(jù)免疫動(dòng)物種類、給藥途徑等適當(dāng)確定，每I只動(dòng)物給藥約50~200yg。主要通過在皮下、腹腔內(nèi)注入免疫原進(jìn)行免疫。另外，免疫的間隔沒有特別限定，初次免疫后，間隔數(shù)日至數(shù)周，優(yōu)選間隔I~4周，進(jìn)行2~10次、優(yōu)選3~4次追加免疫。初次免疫后，利用ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme — Linked ImmunoSorbent Assay))法等反復(fù)測(cè)定免疫動(dòng)物血清中的抗體值,抗體值達(dá)到平臺(tái)時(shí)，向靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)注射免疫原，進(jìn)行最終免疫。從最終免疫日起2~5日后，優(yōu)選3日后，采集抗體產(chǎn)生細(xì)胞。作為抗體產(chǎn)生細(xì)胞，可以舉出脾臟細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、末梢血細(xì)胞等，優(yōu)選脾臟細(xì)胞或局部淋巴結(jié)細(xì)胞。
[0335](2)細(xì)胞融合 [0336]制作生產(chǎn)對(duì)各靶多肽特異的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。該雜交瘤可以通過常規(guī)技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)并鑒定。用于生產(chǎn)該雜交瘤細(xì)胞株的方法之一包括:用本發(fā)明的蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物，從被免疫的動(dòng)物中采集脾臟細(xì)胞，使該脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株融合，由此生成雜交瘤細(xì)胞，鑒定生產(chǎn)與該酶結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。作為與抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞株，可以使用小鼠等動(dòng)物的通常能購(gòu)買到的細(xì)胞株。作為使用的細(xì)胞株，優(yōu)選具有下述性質(zhì)的細(xì)胞株，即具有藥劑選擇性，并具有在未融合狀態(tài)下在HAT選擇培養(yǎng)基(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)中不能存活，只有在與抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合的狀態(tài)下能存活的性質(zhì)。另外，細(xì)胞株優(yōu)選來自與免疫動(dòng)物同種系的動(dòng)物的細(xì)胞。作為骨髓瘤細(xì)胞株的具體例，可以舉出來自BALB/c小鼠的次黃嘌呤.鳥嘌呤.磷酸核糖基.轉(zhuǎn)換酶(HGPRT)缺損細(xì)胞株即 P3X63 — Ag.8 株(ATCC TIB9)等。
[0337]接下來使上述骨髓瘤細(xì)胞株與抗體產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合如下進(jìn)行:在不含有血清的DMEM、RPMI 一 1640培養(yǎng)基等動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中，以約1:1~20:1的比例混合抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞株，在細(xì)胞融合促進(jìn)劑的存在下進(jìn)行融合反應(yīng)。作為細(xì)胞融合促進(jìn)劑，可以使用濃度約為10~80%、平均分子量為1500~4000道爾頓的聚乙二醇等。另外，因情況的不同，為了提高融合效率，可以并用二甲基亞砜等輔助劑。還可以使用利用電刺激(例如電穿孔)的市售的細(xì)胞融合裝置使抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞株融合。
[0338](3)雜交瘤的篩選及克隆
[0339]從細(xì)胞融合處理后的細(xì)胞中篩選目標(biāo)雜交瘤。作為篩選方法，使用例如含有胎牛血清的RPM1- 1640培養(yǎng)基等適當(dāng)稀釋細(xì)胞懸浮液后，以約200萬個(gè)細(xì)胞/孔左右接種到微孔板上，向各孔中加入選擇培養(yǎng)基，并在以后適當(dāng)更換選擇培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為20~40°C、優(yōu)選為約37°C。骨髓瘤細(xì)胞是HGPRT缺損株或胸苷激酶缺損株時(shí)，通過使用含有次黃嘌呤.氨基蝶呤.胸腺嘧啶核苷的選擇培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)，能夠僅選擇性培養(yǎng)、增殖具有抗體產(chǎn)生能力的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株的雜交瘤。結(jié)果在用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)開始后，生長(zhǎng)約14天左右的細(xì)胞可以作為雜交瘤被得到。
[0340]接下來，在進(jìn)行了增殖的雜交瘤的培養(yǎng)上清中對(duì)是否存在目標(biāo)抗體進(jìn)行篩選。雜交瘤的篩選可以按照常規(guī)方法進(jìn)行，沒有特別限定。例如，采集作為雜交瘤培養(yǎng)的包含在孔中的培養(yǎng)上清的一部分，通過酶免疫測(cè)定法(EIA:Enzyme Immuno Assay、及ELISA)、放射免疫測(cè)定法(RIA:Radio Immuno Assay)等進(jìn)行篩選。融合細(xì)胞的克隆通過有限稀釋法等進(jìn)行，從而最終確立產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞即雜交瘤。本發(fā)明的雜交瘤如下所述，在RPM1-1640、DMEM等基本培養(yǎng)基中的培養(yǎng)穩(wěn)定，并能生產(chǎn)、分泌與靶多肽特異性反應(yīng)的單克隆抗體。
[0341](4)抗體的回收
[0342]單克隆抗體可以利用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行回收。即，作為從確立的雜交瘤中采集單克隆抗體的方法，可以采用通常的細(xì)胞培養(yǎng)法或腹水形成法等。采用細(xì)胞培養(yǎng)法時(shí)，在通常的培養(yǎng)條件(例如，37°C、5% C02濃度)下，在含有10%胎牛血清的RPMI — 1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基等動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤2~10日，從該培養(yǎng)上清中獲得抗體。采用腹水形成法的情況下，向與來自骨髓瘤細(xì)胞的哺乳動(dòng)物同種系的動(dòng)物的腹腔內(nèi)給與約1000萬個(gè)雜交瘤，使雜交瘤大量增殖。并在I~2周后采集腹水或血清。
[0343]對(duì)于上述抗體的采集方法，在需要精制抗體的情況下，可以通過適當(dāng)選擇硫酸銨鹽析法、離子交換色譜法、親和色譜法、凝膠色譜法等公知的方法，或組合使用上述方法，得到精制的單克隆抗體。
[0344]<多克隆抗體的制作>
[0345]制作多克隆抗體時(shí)，與上述相同，免疫家兔等動(dòng)物，從最終免疫日起6~60天后，利用酶免疫測(cè)定法(EIA及ELISA)、放射免疫測(cè)定法(RIA)等測(cè)定抗體值，在顯示最大抗體值的當(dāng)天采血，得到抗血清。然后，利用ELISA法等測(cè)定抗血清中的多克隆抗體的反應(yīng)性。
[0346]〈檢測(cè)法〉
[0347]根據(jù)本發(fā)明，提供一種在體外確定受試者的樣品試樣中不含食管癌細(xì)胞/或含有食管癌細(xì)胞的方法，所述方法包括:使用本發(fā)明的上述抗體，在體外測(cè)定來自受試者的食管癌細(xì)胞、血液等生物試樣中的該多肽水平。
[0348]作為免疫學(xué)測(cè)定方法，例如可以舉出酶免疫測(cè)定法(ELISA、EIA)、熒光免疫測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法(RIA)、發(fā)光免疫測(cè)定法、免疫比濁法、乳膠凝集反應(yīng)、乳膠比濁法、紅細(xì)胞凝集反應(yīng)、粒子凝集反應(yīng)或蛋白質(zhì)印跡法。
[0349]上述方法通過使用了標(biāo)記的免疫測(cè)定法進(jìn)行時(shí)，可以在將本發(fā)明的抗體、或試樣中的成分固相化后，進(jìn)行其免疫學(xué)反應(yīng)。
[0350]作為固相載體，可以使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龍、聚甲基丙烯酸酯、乳膠、明膠、瓊脂糖、纖維素、瓊脂糖凝膠、玻璃、金屬、陶瓷或磁性體等材料組成的微珠、微量培養(yǎng)板、試管、棒(stick)或試驗(yàn)片等形狀的不溶性載體。
[0351]可以通過物理吸附法、化學(xué)結(jié)合法或并用兩種方法等公知的方法，使固相載體和本發(fā)明的抗體或試樣成分結(jié)合，進(jìn)行固相化。
[0352]進(jìn)而，在本發(fā)明中，為了容易地檢測(cè)本發(fā)明的抗體與試樣中的靶多肽的反應(yīng)，通過標(biāo)記本發(fā)明的抗體直接檢測(cè)該反應(yīng)，或通過使用標(biāo)記二抗間接檢測(cè)該反應(yīng)。本發(fā)明的檢測(cè)方法，從靈敏度方面考慮，優(yōu)選使用后者的間接檢測(cè)(例如，夾心法等)。
[0353]作為標(biāo)記物質(zhì)，使用酶免疫測(cè)定法時(shí)，可以使用過氧化物酶(P0D)、堿性磷酸酶、β 一半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脫氫酶、淀粉酶或生物素一抗生物素蛋白復(fù)合體等酶；使用熒光免疫測(cè)定法時(shí)，可以使用異硫氰酸熒光素、四甲基羅丹明異硫氰酸鹽、取代異硫氰酸羅丹明、二氯三嗪異硫氰酸鹽、Alexa或AlexaFluoro等；使用放射免疫測(cè)定法時(shí)，可以使用氚、碘125或131等。另外，使用發(fā)光免疫測(cè)定法時(shí)，可以使用NADH —、FMNH2 —、熒光素酶類、魯米諾一過氧化氫一 POD類、吖啶酯類或二氧雜環(huán)丁烷化合物類等。
[0354]作為標(biāo)記物質(zhì)和抗體的結(jié)合方法，在使用酶免疫測(cè)定法時(shí)，可以使用戊二醛法、馬來酰亞胺法、吡啶基二硫化物法或高碘酸法等公知方法；在使用放射免疫測(cè)定法時(shí)，可以使用氯胺T法、Bolton-Hunter法等公知方法。測(cè)定操作方法可以通過公知的方法(Currentprotocols in Protein Sciences、1995年，John Wiley & Sons Inc.、Current protocolsin Immunology、2001年，John Wiley & Sons Inc.)進(jìn)行。例如,直接標(biāo)記本發(fā)明的抗體時(shí)，將試樣中的成分固相化，使其與標(biāo)記的本發(fā)明的抗體接觸，形成標(biāo)記多肽和本發(fā)明的抗體的復(fù)合體。然后將未結(jié)合的標(biāo)記抗體洗滌分離，可以由結(jié)合標(biāo)記抗體量或未結(jié)合標(biāo)記抗體量測(cè)定試樣中的靶多肽的量。[0355]另外，使用例如標(biāo)記二抗時(shí)，使本發(fā)明的抗體與試樣反應(yīng)(一次反應(yīng))，再與標(biāo)記二抗反應(yīng)(二次反應(yīng))。一次反應(yīng)和二次反應(yīng)可以以相反的順序進(jìn)行，也可以同時(shí)進(jìn)行，還可以錯(cuò)開時(shí)間進(jìn)行。通過一次反應(yīng)及二次反應(yīng)，形成固相化的靶多肽一本發(fā)明的抗體一標(biāo)記二抗的復(fù)合體、或固相化的本發(fā)明的抗體一靶多肽一標(biāo)記二抗的復(fù)合體。然后洗滌分離未結(jié)合的標(biāo)記二抗，可以通過結(jié)合標(biāo)記二抗量或未結(jié)合標(biāo)記二抗量測(cè)定試樣中的靶多肽的量。
[0356]具體而言，使用酶免疫測(cè)定法時(shí)，在標(biāo)記酶的最適條件下使其與基質(zhì)反應(yīng)，通過光學(xué)方法等測(cè)定反應(yīng)生成物的量。使用熒光免疫測(cè)定法時(shí)，測(cè)定由熒光物質(zhì)標(biāo)記產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，使用放射免疫測(cè)定法時(shí)，測(cè)定由放射性物質(zhì)標(biāo)記產(chǎn)生的放射能量。使用發(fā)光免疫測(cè)定法時(shí)，測(cè)定由發(fā)光反應(yīng)體系產(chǎn)生的發(fā)光量。
[0357]本發(fā)明的方法中，通過采用光學(xué)方法測(cè)定或者肉眼觀測(cè)其透射光或散射光的測(cè)定方法來測(cè)定免疫比濁法、乳膠凝聚反應(yīng)、乳膠比濁法、紅細(xì)胞凝集反應(yīng)或粒子凝集反應(yīng)等中免疫復(fù)合體凝集物的生成，此時(shí)，作為溶劑可以使用磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、Tris緩沖液或Good’ s緩沖液等,還可以在反應(yīng)體系中含有聚乙二醇等反應(yīng)促進(jìn)劑或非特異性反應(yīng)抑制劑。
[0358]本發(fā)明的試劑盒中含有的抗體可以單獨(dú)存在，也可以以混合物的狀態(tài)存在，或與固相載體結(jié)合存在，也可以以游離狀態(tài)存在。另外，本發(fā)明的試劑盒可以含有標(biāo)記二抗、載體、清洗緩沖液、試樣稀釋液、酶基質(zhì)、反應(yīng)停止液、精制的作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)記物(祀)多肽、使用說明書等。
[0359]4.食管癌診斷用試劑盒(核酸)
[0360]另外，本發(fā)明提供一種食管癌診斷(檢測(cè))用試劑盒，所述試劑盒含有與本發(fā)明的組合中含有的多核苷酸相同的多核苷酸、其變異體及/或其片段中的I種或多種(優(yōu)選3個(gè)以上、較優(yōu)選5個(gè)以上)。
[0361]本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選含有選自上述3.1中記載的多核苷酸中的I種或多種多核苷酸或其片段。
[0362]本發(fā)明的試劑盒可以含有下述多核苷酸中的3個(gè)以上，所述多核苷酸為含有序列號(hào)I~38表示的堿基序列的多核苷酸、含有其互補(bǔ)序列的多核苷酸、在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸、或上述多核苷酸的片段。[0363]本發(fā)明的試劑盒可以進(jìn)一步含有下述多核苷酸中的2個(gè)以上，所述多核苷酸為含有序列號(hào)39~62表示的堿基序列的多核苷酸、含有其互補(bǔ)序列的多核苷酸、在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸、或上述多核苷酸的片段。
[0364]本發(fā)明的試劑盒中可以含有的多核苷酸片段例如是選自下述(I)~(5)中的5個(gè)以上DNA :
[0365](I)序列號(hào)I~62表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列中，含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的DNA。
[0366](2)序列號(hào)I~62表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列中，含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的DNA。
[0367](3)序列號(hào)I~62表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列中，分別含有序列號(hào)63~124表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列、且含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的DNA。
[0368](4)包含序列號(hào)63~124表示的堿基序列的DNA。
[0369](5)含有與序列號(hào)63~124表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的DNA。
[0370]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述多核苷酸是含有由序列號(hào)I~38中任一個(gè)表不的堿基序列組成的多核苷酸、由其互補(bǔ)序列組成的多核苷酸、在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸、或其含有15個(gè)以上、優(yōu)選20個(gè)以上、較優(yōu)選25個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0371]在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒除含有上述多核苷酸以外，還可以含有由序列號(hào)47表示的堿基序列組成的多核苷酸、由其互補(bǔ)序列組成的多核苷酸、在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0372]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述片段可以是含有15個(gè)以上、優(yōu)選20個(gè)以上、較優(yōu)選25個(gè)以上、更優(yōu)選60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0373]在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述片段是序列號(hào)I~62中任一個(gè)表不的堿基序列中分別含有序列號(hào)63~124中任一個(gè)表不的堿基序列、且含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸、或含有與該多核苷酸的序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。
[0374]在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述片段是含有序列號(hào)63~124中任一個(gè)表不的堿基序列的多核苷酸。
[0375]在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述片段是含有與序列號(hào)63~124中任一個(gè)表不的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸。
[0376]在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述片段是由序列號(hào)63~124中任一個(gè)表不的堿基序列組成的多核苷酸。
[0377]上述組合的例子包括:對(duì)于含有序列號(hào)I~62表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸、在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸、及/或其片段(例如序列號(hào)63~124)，從下述表1所示的基因的優(yōu)先順序(第I號(hào)至第62號(hào))較高的一方開始依次組合基因。采用上述方案依次組合62種基因時(shí)，相對(duì)于檢測(cè)食管癌所需的基因數(shù)將存在食管癌的檢測(cè)準(zhǔn)確率(％)進(jìn)行繪圖，準(zhǔn)確率如下:例如僅為SPRR3(序列號(hào)50)時(shí)準(zhǔn)確率為42.1%，SPRR3 (序列號(hào)50)及CSTB (序列號(hào)49)的組合時(shí)準(zhǔn)確率為52.6%，SPRR3 (序列號(hào)50)、CSTB (序列號(hào)49)及EYA2 (序列號(hào)I)的組合時(shí)準(zhǔn)確率為59.6%, SPRR3 (序列號(hào)50) ,CSTB (序列號(hào)49)、EYA2 (序列號(hào)I)及SERFlA (序列號(hào)2)的組合時(shí)準(zhǔn)確率為59.7%, SPRR3 (序列號(hào)50)、CSTB (序列號(hào)49)、EYA2(序列號(hào)I)、SERF1A(序列號(hào)2)及IGHGl (序列號(hào)3)的組合時(shí)準(zhǔn)確率為86.0%，同樣地組合全部62種基因時(shí)，準(zhǔn)確率為96.5% (圖1)。
[0378] 因此,本發(fā)明的實(shí)施方式中，優(yōu)選最少的組合為SPRR3(序列號(hào)50)、CSTB (序列號(hào)49)、EYA2(序列號(hào)I)、SERFlA (序列號(hào)2)及IGHG1(序列號(hào)3)的組合，構(gòu)成其的各多核苷酸或片段選自含有序列號(hào)50、49、1、2或3所示的堿基序列或其互補(bǔ)的序列的多核苷酸、在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸、及/或其片段。進(jìn)而，可以在上述5種基因中，追加表1所示的其他基因，由此，可以提高其準(zhǔn)確率至例如89%以上、91%以上、92%以上、96%以上。
[0379]根據(jù)其他較優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的試劑盒可以包括3個(gè)以上(優(yōu)選5個(gè)以上)~全部的含有序列號(hào)63~124表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。
[0380]在本發(fā)明中，多核苷酸片段的大小是各多核苷酸堿基序列中下述范圍的連續(xù)堿基數(shù)，例如15~序列的全部堿基數(shù)、15~5000個(gè)堿基、15~4500個(gè)堿基、15~4000個(gè)堿基、15~3500個(gè)堿基、15~3000個(gè)堿基、15~2500個(gè)堿基、15~2000個(gè)堿基、15~1500個(gè)堿基、15~1000個(gè)堿基、15~900個(gè)堿基、15~800個(gè)堿基、15~700個(gè)堿基、15~600個(gè)堿基、15~500個(gè)堿基、15~400個(gè)堿基、15~300個(gè)堿基、15~250個(gè)堿基、15~200個(gè)喊基、15~150個(gè)喊基、15~140個(gè)喊基、15~130個(gè)喊基、15~120個(gè)喊基、15~110個(gè)喊基、15~100個(gè)喊基、15~90個(gè)喊基、15~80個(gè)喊基、15~70個(gè)喊基、15~60個(gè)喊基、15~50個(gè)喊基、15~40個(gè)喊基、15~30個(gè)喊基或15~25個(gè)喊基；25~序列的全部喊基數(shù)、25~1000個(gè)堿基、25~900個(gè)堿基、25~800個(gè)堿基、25~700個(gè)堿基、25~600個(gè)堿基、25~500個(gè)堿基、25~400個(gè)堿基、25~300個(gè)堿基、25~250個(gè)堿基、25~200個(gè)堿基、25~150個(gè)堿基、25~140個(gè)堿基、25~130個(gè)堿基、25~120個(gè)堿基、25~110個(gè)堿基、25~100個(gè)堿基、25~90個(gè)堿基、25~80個(gè)堿基、25~70個(gè)堿基、25~60個(gè)堿基、25~50個(gè)喊基或25~40個(gè)喊基；50~序列的全部喊基數(shù)、50~1000個(gè)喊基、50~900個(gè)堿基、50~800個(gè)堿基、50~700個(gè)堿基、50~600個(gè)堿基、50~500個(gè)堿基、50~400個(gè)堿基、50~300個(gè)堿基、50~250個(gè)堿基、50~200個(gè)堿基、50~150個(gè)堿基、50~140個(gè)堿基、50~130個(gè)堿基、50~120個(gè)堿基、50~110個(gè)堿基、50~100個(gè)堿基、50~90個(gè)喊基、50~80個(gè)喊基、50~70個(gè)喊基或50~60個(gè)喊基；60~序列的全部喊基數(shù)、60~1000個(gè)堿基、60~900個(gè)堿基、60~800個(gè)堿基、60~700個(gè)堿基、60~600個(gè)堿基、60~500個(gè)堿基、60~400個(gè)堿基、60~300個(gè)堿基、60~250個(gè)堿基、60~200個(gè)堿基、60~150個(gè)堿基、60~140個(gè)堿基、60~130個(gè)堿基、60~120個(gè)堿基、60~110個(gè)堿基、60~100個(gè)堿基、60~90個(gè)堿基、60~80個(gè)堿基或60~70個(gè)堿基等。
[0381]構(gòu)成本發(fā)明的試劑盒的上述組合只是列舉，其他各種可能的組合都包括在本發(fā)明中。
[0382]本發(fā)明的試劑盒除了上述說明的本發(fā)明的多核苷酸、其變異體或其片段之外，還可以含有已知能夠檢測(cè)食管癌的或?qū)戆l(fā)現(xiàn)的多核苷酸。
[0383]本發(fā)明的試劑盒中含有的多核苷酸、其變異體或其片段可以被單獨(dú)或任意組合包裝在不同容器中。
[0384]5.DNA 芯片
[0385]本發(fā)明還提供一種食管癌診斷用DNA芯片，所述食管癌診斷用DNA芯片含有與本發(fā)明的組合物及/或試劑盒中含有的物質(zhì)相同的多核苷酸(或上述3.1節(jié)的組合物及/或4節(jié)的試劑盒中記載的多核苷酸)、變異體、片段或它們的組合。
[0386]作為DNA芯片的基板，只要是能夠?qū)NA固相化的基板即可，沒有特別限定，可以舉出載玻片、硅制芯片、聚合物制芯片及尼龍膜等。另外，可以對(duì)上述基板進(jìn)行聚L賴氨酸涂布或?qū)氚被?、羧基等官能團(tuán)等的表面處理。
[0387]另外，固相化法只要是通常使用的方法即可，沒有特別限定，可以舉出以下方法:使用被稱為點(diǎn)樣器(spotter)或陣列點(diǎn)樣儀(arrayer)的高密度分液器點(diǎn)樣DNA的方法、或使用通過壓電元件等從噴嘴噴射微量的液滴的裝置(噴墨)將DNA噴射到基板上的方法、或在基板上依次進(jìn)行核苷酸合成的方法。使用高密度分液器時(shí)，例如如下進(jìn)行固相化:在具有多個(gè)孔的平板的各孔中裝入不同的基因溶液，用針取出該溶液，然后依次點(diǎn)到基板上。使用噴墨法時(shí)，如下進(jìn)行固相化:從噴嘴噴射基因，將基因高速地排列在基板上。在基板上合成DNA時(shí)，如下進(jìn)行固相化:用能在光或熱的作用下離去的官能團(tuán)保護(hù)與基板結(jié)合的堿基，通過使用掩模只將特定部位的堿基接觸光或熱，使官能團(tuán)離去。然后，反復(fù)進(jìn)行向反應(yīng)液中加入堿基、使其與基板上的堿基偶聯(lián)的步驟。 [0388]被固相化的多核苷酸是上述說明的本發(fā)明的全部多核苷酸。
[0389]例如，上述多核苷酸可以含有以下I種或幾種(優(yōu)選5個(gè)以上)多核苷酸或其片段。
[0390](I)由序列號(hào)I~62表不的堿基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0391](2)含有序列號(hào)I~62表示的堿基序列的多核苷酸組。
[0392](3)由序列號(hào)I~38表示的堿基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0393](4)含有序列號(hào)I~38表不的堿基序列的多核苷酸組、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0394](5)由與序列號(hào)I~38表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0395](6)含有與序列號(hào)I~38表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸組。
[0396](7)在嚴(yán)格條件下與DNA雜交的多核苷酸組、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段，所述DNA由與序列號(hào)I~38表示的各堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成。
[0397](8)在嚴(yán)格條件下與由序列號(hào)I~38表示的各堿基序列組成的DNA雜交的多核苷酸組、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0398](9)由序列號(hào)39~62表不的堿基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0399](10)含有序列號(hào)39~62表不的堿基序列的多核苷酸組、其變異體、或其含有15以上連續(xù)堿基的片段。
[0400](11)由與序列號(hào)39~62表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸組、其變異體、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0401](12)含有與序列號(hào)39~62表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸組。
[0402](13)在嚴(yán)格條件下與DNA雜交的多核苷酸組、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段，上述DNA由與序列號(hào)39~62表示的各堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成。
[0403](14)在嚴(yán)格條件下與由序列號(hào)39~62表示的各堿基序列組成的DNA雜交的多核苷酸組、或其含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的片段。
[0404](15)序列號(hào)I~38表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列的各序列中含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0405](16)序列號(hào)I~38表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列的各序列中含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0406](17)序列號(hào)39~62表示的各堿基序列或其互補(bǔ)序列中，含有15個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0407](18)序列號(hào)39~62表示的各堿基序列或其互補(bǔ)序列中，含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0408](19)序列號(hào)I~38表不的喊基序列中，分別含有序列號(hào)63~100表不的喊基序列、且含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0409](20)與序列號(hào)I~38表示的堿基序列互補(bǔ)的序列中，分別含有與序列號(hào)63~100表示的堿基序列互補(bǔ)的序列、且含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0410](21)序列號(hào)39~62表不的喊基序列中，分別含有序列號(hào)101~124表不的喊基序列、且含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0411](22)與序列號(hào)39~62表示的堿基序列互補(bǔ)的序列中，分別含有與序列號(hào)101~124表示的堿基序列互補(bǔ)的序列、且含有60個(gè)以上連續(xù)堿基的多核苷酸。
[0412]根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的DNA芯片可以含有5個(gè)以上~全部的含有序列號(hào)63~124表示的堿基序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。
[0413]本發(fā)明中，被固相化的多核苷酸可以是基因組DNA、cDNA、RNA、合成DNA、合成RNA中的任一個(gè)，可以為單鏈或雙鏈。
[0414]作為能夠檢測(cè)、測(cè)定靶基因、RNA或cDNA的表達(dá)水平的DNA芯片的例子，可以舉出東 I? 株式會(huì)社的 3D_Gene、Affymetrix 公司的 the Gene Chip Human GenomeU133Plus2.0Array、Agilent 公司的 Whole human genome oligo microarray、Takara Bio公司的 IntelliGene (注冊(cè)商標(biāo))HS Human Expression CHIP 等。
[0415]DNA芯片的制作例如可以使用在固相表面固定預(yù)先制備的探針的方法。在固相表面固定預(yù)先制備的多核苷酸探針的方法如下:合成導(dǎo)入了官能團(tuán)的多核苷酸，在經(jīng)過表面處理的固相載體表面上點(diǎn)樣寡核苷酸或多核苷酸，使其共價(jià)鍵合(例如、J.B.Lamture等、Nucleic.Acids.Research、1994 年，第 22 卷，ρ.2121 — 2125、Z.Guo 等、Nucleic.Acids.Research、1994年，第22卷，p.5456 — 5465)。多核苷酸通常通過間隔臂(spacer)或交聯(lián)劑(cross I inker )與經(jīng)過表面處理的固相載體共價(jià)鍵合。還已知使聚丙烯酰胺凝膠的微小片排列在玻璃表面上，使合成多核苷酸與其共價(jià)鍵合的方法(G.Yershov等、Proceedingsof the National Academic Sciences U.S.A.、1996 年，第 94 卷，p.4913)。還已知下述方法:在二氧化硅微陣列上制作微小電極的陣列，在電極上設(shè)置含有鏈霉抗生物素蛋白的瓊脂糖的滲透層，形成反應(yīng)部位，通過使該部位帶正電，固定生物素化多核苷酸，通過控制部位的電荷，能高速且嚴(yán)格地進(jìn)行雜交(R.G.Sosnowski等、Proceedings of the NationalAcademic Sciences U.S.A.、1997 年，第 94 卷，p.1119 — 1123)。
[0416]6.食管癌的檢測(cè)法
[0417]本發(fā)明提供下述方法，所述方法是使用本發(fā)明的組合物、試劑盒、DNA芯片、或它們的組合，在體外確定樣品試樣中是否含有食管癌細(xì)胞的方法，所述方法包括:手術(shù)時(shí)或內(nèi)窺鏡檢查時(shí)使用來自食管癌患者的食管癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞，比較試樣中表達(dá)基因的量，該樣品試樣中的細(xì)胞的靶核酸表達(dá)量增加/降低時(shí)，確定該樣品試樣中存在食管癌細(xì)胞，此處，該靶核酸可以通過該組合物、試劑盒或DNA芯片所含的多核苷酸、其變異體或其片段來檢測(cè)。[0418]另外，本發(fā)明提供本發(fā)明的組合物、試劑盒、DNA芯片在體內(nèi)檢測(cè)來自受試者的樣品試樣中的食管癌中的應(yīng)用。
[0419]本發(fā)明的上述方法中，組合物、試劑盒、DNA芯片以單獨(dú)的方式或以所有可能的組合的方式含有如上所述的本發(fā)明的多核苷酸、其變異體或其片段進(jìn)行使用。
[0420]在本發(fā)明的食管癌的檢測(cè)、確定或(基因)診斷中，本發(fā)明的組合物、試劑盒或DNA芯片中含有的多核苷酸、其變異體或其片段可以作為引物或探針使用。用作引物時(shí)，可以舉出堿基長(zhǎng)度通常為15~50個(gè)堿基、優(yōu)選為15~30個(gè)堿基、較優(yōu)選為18~25個(gè)堿基的引物。另外，用作檢測(cè)探針時(shí)，例如可以舉出堿基長(zhǎng)度為15個(gè)堿基~全部序列的堿基數(shù)、優(yōu)選為25~1000個(gè)堿基、較優(yōu)選為25~100個(gè)堿基的探針，但并不限定于上述范圍。
[0421]本發(fā)明的組合物或試劑盒中含有的多核苷酸、其變異體或其片段在RNA印跡法(Northern Blot)、DNA 印跡法(Southern blot)、RT 一 PCR 法、原位雜交法、DNA 雜交法等特異性地檢測(cè)特定基因的公知方法中，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用作引物或探針。作為測(cè)定對(duì)象試樣，根據(jù)所用的檢測(cè)方法的種類，可以通過活組織檢測(cè)等采集受試者的食管組織或被懷疑存在食管癌細(xì)胞的生物組織的一部分或全部，或者從手術(shù)取出的生物組織中回收。還可以使用按照常規(guī)方法由其制備的總RNA，還可以使用基于該RNA制備的含有cDNA、聚A ( + )RNA的各種多核苷酸。
[0422]或者，可以使用DNA芯片(包括DNA宏陣列(macroarray))檢測(cè)或定量生物組織中的本發(fā)明的基因、RNA、cDNA等核酸的表達(dá)量。此種情況下，本發(fā)明的組合物或試劑盒可以用作DNA陣列的探針(例如，在Affymetrix公司的Human Genome U133Plus2.0Array中，使用長(zhǎng)度為25個(gè)堿基的多核苷酸探針)。使上述DNA芯片與以從生物組織采集的RNA為基礎(chǔ)制備的標(biāo)記DNA或RNA雜交,以該標(biāo)記DNA或RNA的標(biāo)記為指標(biāo),檢測(cè)通過該雜交形成的上述探針和標(biāo)記DNA或RNA的復(fù)合體，由此能評(píng)價(jià)生物組織中的食管癌相關(guān)基因或食管癌是否表達(dá)或表達(dá)水平(表達(dá)量)。本發(fā)明方法中優(yōu)選使用DNA芯片，該DNA芯片能對(duì)一個(gè)生物試樣同時(shí)評(píng)價(jià)多個(gè)基因是否表達(dá)或表達(dá)水平。
[0423]本發(fā)明的組合物、試劑盒或DNA芯片對(duì)于食管癌的診斷、確定或檢測(cè)(是否患病或患病程度的診斷)是有用的。使用該組合物、試劑盒或DNA芯片診斷食管癌具體可以如下進(jìn)行:使用手術(shù)時(shí)或內(nèi)窺鏡檢查時(shí)來自食管癌患者的食管癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞，比較試樣中的基因表達(dá)量，或者將手術(shù)時(shí)或內(nèi)窺鏡檢查時(shí)來自食管癌患者的食管癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞與等同的生物組織進(jìn)行比較，判斷用該診斷用組合物檢測(cè)的基因的表達(dá)水平的不同。此時(shí)，基因表達(dá)水平的不同不僅僅表示有無表達(dá)，還包括以下情形:來自食管癌患者的食管癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞兩者都表達(dá)時(shí)，比較兩者間的表達(dá)量時(shí)的差值。例如，由于EYA2基因在食管癌中表達(dá)誘導(dǎo)/減少，所以，在受試者的食管癌組織中表達(dá)/減少，如果將該表達(dá)量與正常組織的表達(dá)量相比較存在差異，則確定試樣中不含食管癌細(xì)胞/或含有食管癌細(xì)胞。
[0424]利用本發(fā)明的組合物、試劑盒或DNA芯片檢測(cè)樣品試樣中不含食管癌細(xì)胞/或含有食管癌細(xì)胞的方法如下:通過活組織檢測(cè)等采集或從手術(shù)取出的生物組織中回收受試者的生物組織的一部分或全部，使用選自本發(fā)明的多核苷酸組中的I種或幾種多核苷酸、其變異體或其片段檢測(cè)上述生物組織中含有的基因，測(cè)定該基因的表達(dá)量，由此診斷是否患有食管癌或患病程度。另外，本發(fā)明的食管癌的檢測(cè)方法還可以在例如對(duì)食管癌患者給與用于改善該疾病的治療藥時(shí)，檢測(cè)、確定或診斷該疾病是否改善或改善程度。
[0425]本發(fā)明的方法例如可以包括以下(a)、(b)及(C)步驟:
[0426](a)使來自受試者的生物試樣與本發(fā)明的組合物、試劑盒或DNA芯片的多核苷酸接觸的步驟，
[0427](b)使用上述多核苷酸作為探針測(cè)定生物試樣中的靶核酸的表達(dá)水平的步驟、
[0428](C)基于(b)的結(jié)果，判斷該生物試樣中是否存在食管癌(細(xì)胞)的步驟。
[0429]作為本發(fā)明方法中使用的生物試樣，可以舉出由受試者的生物組織例如食管組織及其周圍組織、懷疑發(fā)生食管癌的組織等制備的試樣。具體而言，含有由該組織制備的RNA的試樣、或含有由該組織制備的多核苷酸的試樣可以如下制備，即，通過活組織檢測(cè)等采集或從通過手術(shù)取出的生物組織中回收受試者的生物組織的一部分或全部，然后按照常規(guī)方法進(jìn)行制備。
[0430]此處的受試者是指哺乳動(dòng)物，例如人、猴子、小鼠、大鼠等，并無限定，優(yōu)選為人。
[0431]本發(fā)明的方法，可以根據(jù)用作測(cè)定對(duì)象的生物試樣的種類變更步驟。
[0432]例如，使用RNA作為測(cè)定對(duì)象物時(shí)，食管癌(細(xì)胞)的檢測(cè)可以包括例如下述步驟(a)、(b)及(c):
[0433](a)使由受試者的生物試樣制備的RNA或由該RNA轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)多核苷酸(cDNA)與本發(fā)明的組合物、試劑盒或DNA芯片的多核苷酸結(jié)合的步驟，
[0434](b)使用上述多核苷酸作為探針，測(cè)定與該多核苷酸結(jié)合的來自生物試樣的RNA或由該RNA轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)多核苷酸的步驟，
[0435](C)基于上述(b)的測(cè)定結(jié)果，判斷是否存在食管癌(細(xì)胞)的步驟。
[0436]為了利用本發(fā)明檢測(cè)、確定或診斷食管癌(細(xì)胞)，例如可以使用各種雜交法。所述雜交法，例如可以使用RNA印跡法、DNA印跡法、RT — PCR法、DNA芯片解析法、原位雜交法、DNA雜交法等。
[0437]使用RNA印跡法時(shí)，通過使用本發(fā)明的診斷用組合物作為探針，可以檢測(cè)、測(cè)定RNA中的各基因是否表達(dá)或其表達(dá)水平。具體可以舉出以下方法:用放射性同位素(32P、33P、35S等)或熒光物質(zhì)等標(biāo)記本發(fā)明的診斷用組合物(互補(bǔ)鏈)，使其與利用常規(guī)方法轉(zhuǎn)移到尼龍膜等上的來自受試者的生物組織的RNA雜交，然后用放射線檢測(cè)器(可以舉出BAS — 1800 I I Fuji Photo Film 株式會(huì)社等)或熒光檢測(cè)器(例如 ST0RM860, AmershamBioscience公司等)檢測(cè)、測(cè)定形成的診斷用組合物(DNA)和RNA的雙鏈中的來自診斷用組合物的標(biāo)記物(放射性同位素或熒光物質(zhì))的信號(hào)。
[0438]使用定量RT - PCR法時(shí)，通過使用本發(fā)明的上述診斷用組合物作為引物，可以檢測(cè)、測(cè)定RNA中的基因是否表達(dá)或其表達(dá)水平。具體可以舉出以下方法:按照常規(guī)方法由來自受試者的生物組織的RNA制備cDNA，為了能以該cDNA為模板擴(kuò)增各靶基因區(qū)域，使由本發(fā)明的組合物制備的I對(duì)引物(由與上述cDNA結(jié)合的正鏈和反鏈組成)與cDNA雜交，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR法，檢測(cè)得到的雙鏈DNA。需要說明的是，作為雙鏈DNA的檢測(cè)方法，可以采用以下方法:使用預(yù)先用放射性同位素或熒光物質(zhì)標(biāo)記的引物進(jìn)行上述PCR的方法；用瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，用溴乙錠等染色雙鏈DNA進(jìn)行檢測(cè)的方法；將產(chǎn)生的雙鏈DNA按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)移到尼龍膜等上，作為探針與標(biāo)記的診斷用組合物雜交，進(jìn)行檢測(cè)的方法。
[0439]使用DNA芯片解析時(shí)，使用將本發(fā)明的上述診斷用組合物作為DNA探針(單鏈或雙鏈)貼合到基板上制成的DNA芯片。將基因組在基板上固相化得到的物質(zhì)通常稱為DNA芯片及DNA陣列，DNA陣列包括DNA宏陣列和DNA微陣列，本說明書中稱為DNA芯片時(shí)，即為含有該DNA陣列的物質(zhì)。
[0440]雜交條件沒有限定，例如，包括在30°C~50°C下，在3~4XSSC、0.1~0.5% SDS中雜交I~24小時(shí)，較優(yōu)選在40°C~45°C下，在3XSSC、0.3% SDS中雜交I~24小時(shí)，然后進(jìn)行清洗。作為清洗條件，例如可以舉出利用含有30°C的3XSSC和0.1% SDS的溶液、及42°C的0.3 X SSC和0.1%SDS溶液、及30°C的0.1 X SSC溶液在室溫下連續(xù)清洗等的條件。此處，I X SSC是含有150mM氯化鈉及15mM檸檬酸鈉的水溶液(pH7.2)?；パa(bǔ)鏈優(yōu)選為即使在上述條件下進(jìn)行清洗仍能保持與作為對(duì)象的正鏈雜交的狀態(tài)的鏈。作為上述互補(bǔ)鏈，具體可以舉出由與作為對(duì)象的正鏈的堿基序列具有完全互補(bǔ)關(guān)系的堿基序列組成的鏈、以及由與該鏈具有至少80%同源性的堿基序列組成的鏈。
[0441]作為以來自本發(fā)明的組合物或試劑盒的多核苷酸片段為引物進(jìn)行PCR時(shí)的嚴(yán)格的雜交條件的例子，例如可以舉出使用組成為IOmM Tris —HCL(pH8.3)、50mM KCL、1~2mMMgCl2等的PCR緩沖液，在由該引物序列計(jì)算的Tm+5~10°C下處理15秒~I分鐘左右等。作為上述Tm的計(jì)算方法，可以舉出Tm= 2X (腺嘌呤殘基數(shù)+胸腺嘧啶殘基數(shù))+4 X (鳥嘌呤殘基數(shù)+胞嘧啶殘基 數(shù))等。
[0442]上述雜交的“嚴(yán)格條件”的其它例子，記載于例如Sambrook, J.& Russel, D.著，Molecular Cloning,A LABORATORY MANUAL>CoId Spring Harbor Laboratory Press、2001年I月15日出版，第I卷7.42~7.45，第2卷8.9~8.17等中，可以在本發(fā)明中使用。
[0443]本發(fā)明還提供判斷生物試樣不含及/或含有食管癌細(xì)胞的方法，該方法使用本發(fā)明的組合物、試劑盒、DNA芯片或它們的組合，測(cè)定來自受試者的生物試樣中的靶核酸或基因的表達(dá)量，以支持向量機(jī)(SVM, support vector machine)作為辨別式進(jìn)行判斷,所述支持向量機(jī)(SVM)以食管癌組織和正常組織的基因表達(dá)量作為訓(xùn)練樣本。
[0444]即，本發(fā)明還提供上述方法，該方法包括以下步驟:第I步驟，使用本發(fā)明的組合物、試劑盒、DNA芯片或它們的組合，體外測(cè)定多個(gè)生物試樣中的靶核酸的表達(dá)量，所述生物試樣是已知確定樣品試樣中不含食管癌細(xì)胞/或含有食管癌細(xì)胞的生物試樣；第2步驟，以該第I步驟得到的該靶核酸的表達(dá)量的測(cè)定值作為訓(xùn)練樣本，制作辨別式(支持向量機(jī));第3步驟，與第I步驟相同地體外測(cè)定來自受試者的食管的生物試樣中的該靶核酸的表達(dá)量；第4步驟，將第3步驟中得到的該靶乙酸的表達(dá)量的測(cè)定值代入該第2步驟中得到的辨別式，基于由該辨別式得到的結(jié)果，判斷生物試樣中不含食管癌細(xì)胞/或含有食管癌細(xì)胞，此處，該靶核酸可以通過該組合物、試劑盒或DNA芯片中含有的多核苷酸、其變異體或其片段檢測(cè)到。
[0445]或者，本發(fā)明的方法可以包含例如下述步驟(a)、(b)及(C):
[0446](a)步驟:使用本發(fā)明的診斷(檢測(cè))用組合物、試劑盒或DNA芯片測(cè)定生物試樣中的靶基因的表達(dá)量，所述生物試樣是已知含有來自食管癌患者的食管癌細(xì)胞的組織及/或不含來自食管癌患者的食管癌細(xì)胞的組織；
[0447](b)步驟:將(a)中測(cè)定的表達(dá)量的測(cè)定值代入下述數(shù)I~數(shù)5的式中，制作稱為SVM的辨別式；
[0448](C)步驟:使用本發(fā)明的診斷(檢測(cè))用組合物、試劑盒或DNA芯片測(cè)定來自受試者的生物試樣中的該靶基因的表達(dá)量，并將其代入(b)中制作的辨別式，基于得到的結(jié)果，判斷該生物試樣中是否含有食管癌細(xì)胞。
[0449]SVM是為了解決二級(jí)分類問題而制作的，是1995年由AT & T的V.Vapnik (TheNature of Statistical Leaning Theory、Springer、1995 年出版)基于統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)理論的框架提出的學(xué)習(xí)機(jī)。SVM是一種線性辨識(shí)器，但通過組合后述的核函數(shù)(Kernel)，能夠解決非線性問題。針對(duì)不同級(jí)別的訓(xùn)練樣本，在辨識(shí)上述訓(xùn)練樣本的多個(gè)超平面中，將該超平面與訓(xùn)練樣本的最小距離變得最大的超平面作為辨識(shí)面，由此能最準(zhǔn)確地辨識(shí)新給與的試樣屬于哪一個(gè)級(jí)別。
[0450]SVM只能解決線性問題，但作為用于解決本質(zhì)上為非線性問題的方法，已知將特征向量非線性地轉(zhuǎn)換成高維，在該高維空間內(nèi)進(jìn)行線性辨識(shí)的方法。使用該方法，與在原空間使用非線性模型等效。但進(jìn)行向高維轉(zhuǎn)換的繪圖需要龐大的計(jì)算量，歸納能力也降低。SVM中，辨識(shí)函數(shù)僅依賴輸入圖案的內(nèi)積，如果能計(jì)算內(nèi)積，則能構(gòu)建最優(yōu)辨識(shí)函數(shù)。非線性地繪制的空間中的二個(gè)要素的內(nèi)積僅由各自原來的空間的輸入表示的式子稱為核函數(shù)，一邊在高維空間中繪制，一邊避免在實(shí)際繪制的空間中的特征的計(jì)算，僅由核函數(shù)的計(jì)算構(gòu)建最優(yōu)辨識(shí)函數(shù)，即辨別式(例如，麻生英樹等著、統(tǒng)計(jì)科學(xué)的前沿6 “圖案識(shí)別與學(xué)習(xí)的統(tǒng)計(jì)學(xué)新概念和方法”、巖波書店、東京、日本(2004年))。
[0451]本發(fā)明的方法中可以使用的辨別式的計(jì)算例如下所示。
[0452]為了確定SVM，可以準(zhǔn)備生物試樣中的靶基因的表達(dá)量作為訓(xùn)練樣本，按照以下步驟確定辨識(shí)函數(shù)的常數(shù)，所述生物試樣是已知含有食管癌細(xì)胞的組織或正常組織。
[0453]訓(xùn)練樣本Xi屬于被分類為(+1、一 I)的含有食管癌細(xì)胞的組織組或正常組織組中的任一組。可以用超平面線性分離上述訓(xùn)練樣本時(shí)，辨識(shí)函數(shù)例如為下式。
[0454][等式I]
【權(quán)利要求】
1.與基因EYA2、SERF1A、IGHGl、CSTB和SPRR3結(jié)合的至少5個(gè)多核苷酸探針在制造食道癌診斷劑中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中5個(gè)多核苷酸探針選自下述多核苷酸(a)~(d)構(gòu)成的組: (a)選自由序列號(hào)I~3、49和50表不的核苷酸序列組成的組的多核苷酸、或其含有至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段； (b)選自由與序列號(hào)I~3、49和50表示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的組的多核苷酸、或其含有至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段； (c)多核苷酸，其為含有來自針對(duì)基因EYA2、SERF1A、IGHGUCSTB和SPRR3的cDNA的至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段，或由與所述片段的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸 '及 (d)多核苷酸,其為由序列號(hào)63~65、111和112表不的核苷酸序列組成的片段,或由與所述片段的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的 用途，其中，所述片段為含有至少60個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求2所述的用途,其中，所述片段是序列號(hào)63~65、111和112中的任一個(gè)表不的核苷酸序列組成的多核苷酸，或與序列號(hào)63~65、111和112中的任一個(gè)表不的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的用途，其還含有針對(duì)基因ITSN2、RAB11FIP5、HSPA1A、NMU, E2F3、ESR2、CFDPl、HSPC190、COL1A2、GCSU PARL, CELSR2、NDRGl、SLC25A44、TUSC2、SLC4A1、MS4A7、TMSB4X、PRC1、VCP、RBM9、GPR126、HOXAIO、PPPIRIA、MY09B、SLC04C1、SERPINB13、SDC2、T0R1A、RPL18A、GAS7、WISP1、CACNG4、S100P、UCHL5、AQP3、NSUN5、B4GALT2、CD48、DAB2、EB13、MAP3K12、SPEN、ARHGEF3、C0L3A1、SLIT2、CAMK2B、SLC2A14、SATB2、SEPT6、GALNS、TROAP、XRCC3、FGF3、EIF4EBP2、RRMl和M6PR的I個(gè)或2個(gè)以上多核苷酸探針，所述多核苷酸探針選自下述多核苷酸(e)至(h)組成的組: (e)選自由序列號(hào)4~48、51~62表不的核苷酸序列組成的組的多核苷酸、或其含有至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段； (f)選自由與序列號(hào)4~48、51~62表示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的組的多核苷酸、或其含有至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段； (g)多核苷酸，其是包含來自針對(duì)基因ITSN2、RAB11FIP5、HSPAlA,NMU, E2F3、ESR2、CFDP1、HSPC190、COLIA2、GCS1、PARL、CELSR2、NDRGl、SLC25A44、TUSC2、SLC4A1、MS4A7、TMSB4X、PRCl、VCP、RBM9、GPRl26, H0XA10, PPP1R1A、MY09B、SLC04C1、SERPINB13、SDC2、T0R1A、RPL18A、GAS7、WISP1、CACNG4、S100P、UCHL5、AQP3、NSUN5、B4GALT2、CD48、DAB2、EBI3、MAP3K12、SPEN、ARHGEF3、C0L3A1、SLIT2、CAMK2B、SLC2A14、SATB2、SEPT6、GALNS, TROAP,XRCC3、FGF3、EIF4EBP2、RRMl和M6PR的cDNA的至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段，或由與所述片段的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸；及 (h)多核苷酸,其是由序列號(hào)66~110、113~124表不的核苷酸序列組成的片段,或由與所述片段的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其中，所述片段為含有至少60個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
7.如權(quán)利要求6所述的用途,其中，所述片段是序列號(hào)66~110、113~124中的任一個(gè)表不的核苷酸序列組成的多核苷酸，或與序列號(hào)66~110、113~124中的任一個(gè)表不的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
8.如權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述診斷劑是組合物、試劑盒或DNA芯片的形式。
9.如權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述片段含有下述多核苷酸中的至少5個(gè)至全部,所述多核苷酸每個(gè)含有序列號(hào)63~124中的任一個(gè)表不的核苷酸序列、或與序列號(hào)63~124中的任一個(gè)表不的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
10.如權(quán)利要求8或9所述的用途，其中所述試劑盒中含有的多核苷酸分別或任意組合包裝在不同的容 器中。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103540657SQ201310407690
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2009年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2008年5月21日
【發(fā)明者】妙本陽, 小園聰子, 秋山英雄, 信正均, 島田裕, 辻本豪三 申請(qǐng)人:東麗株式會(huì)社, 國(guó)立大學(xué)法人京都大學(xué)